一种手性分离多种基本氨基酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用反相高效液相色谱和手性固定相来手性分离一些基本氨基酸的方法，主要解决高效液相色谱法手性分离体系中使用的流动相体系比较繁琐和手性色谱柱不稳定的技术问题，该方法包括步骤：将配制的外消旋样品用甲醇和水进行溶解过滤作为待测样品。待手性色谱柱平衡好后，用微量注射器吸取滤液进入色谱仪，通过色谱工作站采集手性分离色谱图，查看分离效果。此方法简化了基本氨基酸的手性分离问题，提高了测试效率，只使用简单流动相，分离速度快，并且分离的条件对于温度也没有特殊要求，分离过程中不需要柱温箱，不增加仪器成本，使用范围广，有很好的经济价值。
【专利说明】
一种手性分离多种基本氨基酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用反相高效液相色谱和手性固定相来手性分离一些基本氨基酸的方法，利用手性固定相在高效液相色谱系统上手性分离一些基本氨基酸对映异构体，DL-亮氨酸、DL-谷氨酰胺、DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-酪氨酸。
【背景技术】
[0002]目前，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。由于许多药物对映体之间在药理、毒理和临床疗效等方面存在较大差异，因此建立快速而灵敏的分离和测定对映体化合物的方法十分重要。而且药物治疗多肽有副作用低，药效高，针对性强，不会蓄积于体内而引起中毒的优点，越来越多的多肽药物应用到了癌症，肝炎，糖尿病临床治疗中，目前国内的药物治疗多肽发展迅速，药物多肽合成方法中无论是液相合成，固相合成，片段连接都会使用到氨基酸作为原料，对于多肽合成来说，防止消旋化是一个十分重要的问题。为了保证合成产物的光学纯度，除了在合成过程中严格控制消旋化的发生以外，还必须严格采用光学纯的原料氨基酸。因此，氨基酸对映体的检测对于光学活性多肽的合成至关重要。而一种快速，简单，经济，应用范围广的手性分离方法对工作效率的提高也是至关重要的。
[0003]很多时候，分离氨基酸对映体需要进行衍生化，这种方法比较复杂而且需要花费一定的额外成本，需要用到多种手性流动相来进行测试，增加了测试时间，因此，找到一种快速有效的氨基酸分离方法是很有必要的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种利用高效液相色谱法，同时使用替考拉宁键合手性固定相进行多种基本氨基酸的手性分离方法。此方法可以解决高效液相色谱法手性分离体系中使用的流动相体系比较繁琐和手性色谱柱不稳定的技术问题。
[0005]本发明的技术方案如下:一种手性分离多种基本氨基酸的方法，采用替考拉宁手性固定相的高效液相色谱方法，包括以下步骤:
将DL-亮氨酸、DL-谷氨酰胺、DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-酪氨酸等外消旋样品配制成l-20mg/ml浓度,用甲醇和水进行溶解过滤作为待测样品；
手性色谱柱=ChiroB1tic T (替考拉宁键合手性柱)，5 μ m，4.6 X 250mm(1.D)；
流动相 A:甲醇 B:7jC ；
流速:0.3-0.6ml/min (优选 0.4ml/min)；
流动相的洗脱条件如下:
时间(min)A (体积百分比)B (体积百分比)
0.0140%60%
30.040%60%
检测波长:210nm-220nm ； 以甲醇比水体积比4:6的比例平衡手性色谱柱，平衡40分钟，待紫外检测器的基线维持在零点左右时可以准备分析样品。
[0006]将配制好的样品注射进入高效液相色谱系统，在手性固定相分离后，通过色谱工作站记录分离色谱图，查看相关数据，检验两个色谱峰是否完全分离。
[0007]按照本发明，所述的手性分离多种基本氨基酸的方法，手性色谱柱使用的是以硅胶为基质的，在硅胶基质上化学键合大环抗生素-替考拉宁的手性色谱柱(Te1-CSP)。
[0008]本发明所用的样品溶解条件为体积比，甲醇:水=4:6 ；
本发明所述的样品在4.6mm内径的分析柱上的样品浓度分别为:
DL-亮氨酸20mg/ml、DL-谷氨酰胺20mg/ml、DL_苯丙氨酸3mg/ml、DL_色氨酸Img/ml、DL-酪氨酸 lmg/ml。
[0009]本发明的有益效果:简化了基本氨基酸的手性分离问题，提高了测试效率，本发明所述的手性分离方法，只使用简单流动相，分离速度快，并且分离的条件对于温度也没有特殊要求，分离过程中不需要柱温箱，不增加仪器成本，同时替考拉宁键合的手性柱稳定性比较好，在手性分离上千次样品后仍能得到很好的手性分离效果，同时这种手性柱也能用于其它类的氨基酸，肽，和手性药物的手性分离，使用范围广，有很好的经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:DL_亮氨酸消旋体的手性分离色谱图。
[0011]图2:DL-谷氨酰胺消旋体的手性分离色谱图。
[0012]图3:DL-苯丙氨酸消旋体的手性分离色谱图。
[0013]图4:DL-色氨酸消旋体的手性分离色谱图。
[0014]图5:DL-酪氨酸消旋体的手性分离色谱图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1-5如下:
将样品溶解过滤:
1.精密称取L-亮氨酸和D-亮氨酸各1mg于Iml样品管中(相当于20mg/ml )，用甲醇和水按体积比4:6超声溶解,用0.45um滤头过滤代用。
[0016]2.精密称取L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺各1mg于Iml样品管中(相当于20mg/ml),用甲醇和水按体积比4:6超声溶解,用0.45um滤头过滤代用。
[0017]3.精密称取L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸各15mg于1ml容量瓶中(相当于3mg/ml),用甲醇和水按体积比4:6超声溶解,用0.45um滤头过滤代用。
[0018]4.精密称取L-色氨酸和D-色氨酸各5mg于1ml容量瓶中(相当于lmg/ml)，用甲醇和水按体积比4:6超声溶解,用0.45um滤头过滤代用。
[0019]5.精密称取L-酪氨酸和D-酪氨酸各5mg于1ml容量瓶中(相当于lmg/ml)，用甲醇和水按体积比4:6超声溶解,用0.45um滤头过滤代用。
[0020]色谱条件为:时间(min)A (体积百分比)B (体积百分比)
0.0140%60%
30.040%60% ； 色谱柱=ChiroB1tic T (替考拉宁键合手性柱)，5um，4.6X250mm(1.D)；
流速:0.4ml/min ；
检测波长:210nm(DL_売氨酸、DL-谷氨酰胺)；220nm(DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-酪氨酸)；
进样量:5ul。
[0021]色谱图见图1 -图5。图1显示L-亮氨酸和D-亮氨酸的两个色谱峰完全分离，说明两个亮氨酸对应异构体得到分离；图2显示L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺的两个色谱峰完全分离，说明两个谷氨酰胺对应异构体得到分离；图3显示L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸的两个色谱峰完全分离，说明两个苯丙氨酸对应异构体得到分离；图4显示L-色氨酸和D-色氨酸的两个色谱峰完全分离，说明两个色氨酸对应异构体得到分离；图5显示L-酪氨酸和D-酪氨酸的两个色谱峰完全分离，说明两个酪氨酸对应异构体得到分离。
【权利要求】
1.一种手性分离多种基本氨基酸的方法，其特征是包括如下步骤: 将配制的外消旋样品用甲醇和水进行溶解过滤作为待测样品，待手性色谱柱平衡好后，用微量注射器吸取滤液进入色谱仪，通过色谱工作站采集手性分离色谱图，查看分离效果。
2.根据权利要求1所述的一种手性分离多种基本氨基酸的方法，其特征是所述的外消旋体样品为下述中的一种:0卜亮氨酸、0卜谷氨酰胺、0卜苯丙氨酸、0卜色氨酸、0卜酪氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种手性分离多种基本氨基酸的方法，其特征是所述的外消旋体样品的浓度为1-201118/1111。
4.根据权利要求1所述的一种手性分离多种基本氨基酸的方法，其特征是所述的色谱仪手性分离的色谱条件为: 手性色谱柱:替考拉宁键合手性柱 流动相:甲醇 8冰 流速:0.3-0.61111/111111 流动相的洗脱条件如下:
时间4 (体积百分比) 8 (体积百分比)0.01 11111140%60%
30.0 11111140%60% 检测波长:210咖-22011111。
5.根据权利要求4所述的一种手性分离多种基本氨基酸的方法，其特征是所述的流速:0.41111/111111。
6.根据权利要求1或4所述的一种手性分离多种基本氨基酸的方法，其特征是所述的甲醇和水的体积比为4:6，手性色谱柱的平衡时间40分钟。
【文档编号】C07C227/40GK104275169SQ201310271925
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月1日 优先权日:2013年7月1日
【发明者】乔立超, 巢庆, 张倩, 杨培, 张恒维, 朱国基 申请人:希施生物科技（上海）有限公司