杂交瘤细胞株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于蛋白领域，特别涉及杂交瘤细胞和单克隆抗体，分泌α干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述生物保藏编号为CCTCC?NO：C201242；其分泌的单克隆抗体可作为检测α干扰素的诊断试剂；本杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体效价高；所制备的单克隆抗体，被HRP标记后，可作为酶标抗体；所述单克隆抗体可作为包被抗体；用制备的单克隆抗体制备的ELISA试剂盒，特异性高，缩短检测时间，提高试验准确性，可大规模检测，投入小；达到更加方便快捷检测干扰素活性的目的；本单克隆抗体效价高可检测中和抗体，并进一步判断患者对IFN治疗无反应或复发的可能行。
【专利说明】杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白领域，特别涉及单克隆抗体的制备。
【背景技术】
[0002]a干扰素,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。a干扰素的免疫调节作用很强，还有增强免疫对病毒感染细胞的免疫杀伤活性。a干扰素还能增强巨噬细胞的吞噬功能和细胞毒活性。临床治疗剂量为300万~500万单位，每周3次，疗程3~6个月。持久疗效为25%~40%。常见的不良反应为流感样症状，如:发热、头痛、关节及肌肉酸痛等。聚乙二醇干扰素是相对于常规干扰素在药代动力学和用药频次上有很大改进的一种干扰素，临床研究结果显示聚乙二醇干扰素在治疗慢性乙型肝炎方面显示出了令人鼓舞的效果。a干扰素至少有15个亚型，彼此之间有78-98%的同源性，其均能和I型受体结合。每种亚型之间，因其自身结构的微小差异而导致各自的生物活性差异。
[0003]a干扰素的单抗在研究细胞因子的功能上有许多用途。如结构与功能的研究，定性和定量的检测，及纯化工艺。a干扰素的高同源性为单抗的应用提供了广阔的空间，但是，a干扰素的高同源性也提高了制备杂交瘤细胞和单抗难度。
[0004]另外，传统a干扰素活性检测法为细胞病变抑制法，该方法耗时多，结果可重复性差。操作要求较高，投入较大，且具有生物危险性。
[0005]另外，仍有部分患者对IFN治疗无反应或仅有短暂反应后再次复发。原因之一与机体产生了抗干扰素的抗体，特别是能够中和IFN生物学活性的中和抗体(NA)有关。国内有关生物学方法测定IFN-a中和抗体的研究不多。
[0006]本发明是针对上述问题改进得到的。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明的目的在于提供杂交瘤细胞，其能稳定分泌a干扰素单克隆抗体。本发明的目的之二在于提供a干扰素单克隆抗体及其应用，单克隆抗体效价高；本发明的目的之三在于提供诊断试剂盒及其应用方法，其可以用于检测a干扰素；该方法操作简单，适用于大批量的临床检测。
[0008]分泌a干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述生物保藏编号为CCTCC NO:C201242。
[0009]由所述的杂交瘤细胞分泌的a干扰素单克隆抗体。
[0010]所述的a干扰素单克隆抗体制备检测a干扰素的诊断试剂中的应用。
[0011]含有酶标所述的a干扰素单克隆抗体的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括:固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液，所述用于包被所述固相载体的抗体为抗a干扰素多克隆抗体，所述酶标抗体为酶标a干扰素单克隆抗体。
[0012]进一步，所述显色底物为TMB，所述酶标抗体为HRP标记的a干扰素单克隆抗体。[0013]检测a干扰素的方法，具体包括以下步骤:
[0014]A含有包被抗体的固相载体的制备
[0015]将抗a干扰素多克隆抗体包被至固相载体上，用洗涤液洗去杂质；
[0016]B 孵育
[0017]将样本添加至固相载体中，与所述a干扰素单克隆抗体孵育至充分结合，形成抗原-抗体结合物；将所述酶标抗体与所述抗原-抗体结合物孵育至充分结合，洗去杂质；
[0018]C 检测
[0019]加入显色底物，检测光强度。
[0020]进-步，所述的检测a干扰素的方法，步骤A中，所述a干扰素多克隆抗体的包被浓度 2 ii g/mL。
[0021]进一步，所述的检测a干扰素的方法，步骤B中，所述样本为血清作50倍体积稀释；进一步，所述的检测a干扰素的方法，所述方法设置有同样本平行的标准品组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；进一步，所述的检测a干扰素的方法，检测OD 值。
[0022]含有所述的a干扰素单克隆抗体的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括:固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液，所述用于包被所述固相载体的抗体为所述的单克隆抗体，所述酶标抗体为酶标a干扰素多克隆抗体。
[0023]两种抗体的联合应用，抗a干扰素多克隆抗体作和酶标的所述a干扰素单克隆抗体联合在检测a干扰素的间接 竞争ELISA法的应用。
[0024]本发明的有益效果在于:1)本杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体效价高；2)所制备的单克隆抗体，被HRP标记后，可作为酶标抗体；3)所述单克隆抗体可作为包被抗体；4)用制备的单克隆抗体制备的ELISA试剂盒，特异性高，缩短检测时间，提高试验准确性，可大规模检测，投入小。达到更加方便快捷检测干扰素活性的目的。5)本单克隆抗体效价高可检测中和抗体，并进一步判断患者对IFN治疗无反应或复发的可能行。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为单克隆抗体能特异性抑制干扰素受体及信号传导通路关键分子STAT1，JAK3 的磷酸化 WESTERN-B0LT 图。
[0026]本发明涉及的杂交瘤细胞，送于中国典型培养物保藏中心保藏，本保藏中心保藏编号为CCTCC NO:C201242 ;培养物名称为杂交瘤细胞2D8，于2012年3月29日送往保藏中心，2012年11月13日检测完毕，结果为存活。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆:实验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。
[0028]实施例1表位肽及其衍生物的制备[0029]所述的B细胞表位肽的序列来自生物信息学分析结果，综合分析a干扰素的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域。具体的,利用Chou & Fasman预测0转角、Emini法预测抗原表面可及性、Karplus& Schulz法预测蛋白柔韧性、Kolaskar & Tongaonkar进行蛋白质抗原性分析、Parker法进行蛋白质疏水分析和Bepipred进行线性抗原表位预测等,综合分析获取的技术参数，获得人a干扰素中潜在的B细胞表位肽氨基酸序列。把a干扰素的B细胞表位肽进行化学合成。
[0030]实施例2抗a干扰素B细胞表位肽免疫Balb/c小鼠及血清效价测定
[0031]将实施例1化学合成的B细胞表位肽抗原从_80°C冰箱取出作免疫原，溶解后过滤。选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠免疫。抗原乳化选用双注射器互推法。首次免疫时，将a干扰素B细胞表位肽衍生物抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，得抗原混合物，每只小鼠按100 u g的量皮内多点加腹腔注射。第14和第28天分别进行第2次第3次免疫，佐剂改用不完全弗氏佐剂，抗原量、注射体积和途径不变，第3次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg表位肽衍生物，3天后细胞融合。第3次免疫后10天从小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价。
[0032]效价的测定如下:
[0033]将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用；用包被液(0.05mol/L碳酸钠缓冲液:0.16g Na2CO3,0.293g NaHCO3,0.02g NaN3，加去离子水溶解定容100ml)。将商品化重组a干扰素(市售，美国R&D Systems)稀释为最佳工作浓度5 ii g/mL,每孔加100 ii L抗原稀释液，37°C温育I小时后，以胶带封口，于4°C过夜，倒尽板孔中液体，吸干孔内残余反应液，加满洗涤液过一次，再注满洗涤液缓缓晃动2min，倾去，反复五次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。自然干燥后以胶带封口，此为重组a干扰素包被的酶标板，加封闭液300iU，37°C孵育1.5小时，洗涤5次；采血及稀释血清:捏住鼠尾，75%酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20 u L, 2000rpm离心30min，取上清I y L加入999 y L抗体稀释液混匀，并进行体积倍比稀释，从1: 100至1: 3200，将稀释的被检血清每孔加入100 yL，同时取小鼠免疫前血清1: 100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37°C孵育I~1.5小时，洗涤5次。将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG (上海亿欣生物科技有限公司)稀释到1: 10000，每孔加100μ L，37°C孵育1.5小时，洗涤5次；加邻苯二胺溶液100 y L/孔，室温暗处15分钟，每孔加终止液100 u L观察结果，OPD氧化后的产物呈橙红色，用酶联免疫检测仪记录492nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值的5倍，可用于细胞融合。
[0034]实施例3小鼠脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液的制备
[0035]取免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出脾脏，放入盛有10mL不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至IOmL玻璃离心管中，800rpm水平离心10min，去上清。同法用不完全培养基10mL洗涤细胞I次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10mL不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1 X108个细胞。将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37°C水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到IOmL离心管中，800rpm水平离心lOmin，弃上清，IOmL完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50mL培养瓶中，置37°C、5% C02培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天，将I瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，IOmL不完全培养基重悬，细胞计数，约为5.5X107。
[0036]取一只未免疫的Balb/c小鼠，摘眼球放血处死，体积分数为75%乙醇浸泡消毒5min,剪开小鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50mL离心管中。同法用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心IOmin,去上清，IOmL不完全培养基重悬细胞并计数。
[0037]融合前将PEG1500置于37 °C培养箱中预温，吸取IX IO7个骨髓瘤细胞悬液和I X IO8个脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1: 10)至一个50mL离心管中，补加30mL不完全培养基，充分混匀，1000rpm离心lOmin，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37°C水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50% PEG1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在Imin左右加完，然后静置90s，逐滴加入37°C预温的不完全培养基30ml终止融合，3min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37°C培养箱中静置5min，取出离心管，1000rpm离心5min，弃去上清，加入IOmL HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按IOOii L/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37°C，5% CO2培养箱中培养。
[0038]融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100 y L，第14天换HT培养基培养。融合后10~14天，待细胞长到满培养孔的1/2孔底时，采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；将商品化重组a干扰素(市售，美国R&D Systems)包被酶标板(0.5 ii g/孔),4°C过夜,洗漆缓冲液洗漆5次,每次5min,拍干液体，每孔加入封闭液300iU，37°C孵育2h，加入IOOii L细胞培养上清，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培上清，空白对照用洗涤液，37°C孵育2h ;洗涤酶标板:每孔加A IOOuL效价为1: 10000 (体积)稀释的HRP标记的羊抗小鼠IG抗体，37°C孵育2h ;洗漆，拍干液体，加新鲜配制的邻苯二胺溶液100 u L/孔，室温暗处反应10~15分钟，加终止液每孔100 U L终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
[0039]结果为以a干扰素的表位肽段为抗原，免疫BALB/C小鼠，融合成功后，经克隆化和ELISA筛选后，得到分泌a干扰素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其细胞培养上清效价达到1: 51200。这株杂交瘤细胞经数次冻存，体外传代培养3个月以上仍能稳定分泌抗体。
[0040]如上所示的筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，制备饲养细胞，用IOmL不完全培养基重悬，收集阳性克隆细胞并计数，用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/20mL，取一块预先已加有滋养细胞的96孔细胞培养板，加入200 u L细胞悬液，将剩下的阳性克隆细 胞转移到24孔板中扩大培养，收集细胞液氮冻存，同时将培养板在37°C，5% CO2培养箱培养，第3天后显微镜下观察细胞生长情况，10天后用ELISA法检测效价，并将最强的阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100%，即可定株；测取定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价后再将定株的杂交瘤细胞扩大培养,并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCCNO:C201242，其可稳定分泌所述单克隆抗体。杂交瘤细胞的冻存要求细胞每支安瓿含IXlO6以上，采用专用细胞冻存液保存；细胞复苏是在Imin内于37°C水浴中快速使冻存的细胞解冻，并将细胞用完全培养液洗涤两次后，移入已制备好的饲养层细胞培养瓶进行培养；细胞传代在细胞复苏培养两天左右后，细胞开始快速分裂生长，隔天1: 4比例传代。传代时不需要胰酶，在传代过程中得到的上清培养液可以与最后抗体收集液的一起进行抗体纯化。抗体的纯选用HiTrap rProtein A HP柱接入AKTA Explorer纯化抗体，经SDS-PAGE检测纯度大于95%。纯化的抗体用间接ELISA法检测效价达1: 128000，初步说明获得的单克隆抗体对a干扰素分子有较高结合能力，分装冷冻保存，待后续使用。[0041]应用商品化重组a干扰素(市售,美国R&D Systems)作为抗原标准品,通过免疫印迹方法鉴定所制备单抗的有效性，结果显示抗a干扰素单抗结合a干扰素处可见清洗条带。本实施例的实验步骤详见《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编)。
[0042]实施例4中和抗体的检测
[0043]50例慢性病毒性肝炎患者，a IFN治疗包括使用a IFN2a25例，a IFN2b25例。治疗剂量均为3mU/次，每周3次，肌肉注射。疗程6个月，随访6个月。治疗前及治疗开始后每月末定期采血，直到随访结束。并以20名健康人血清作对照。测定细胞采用人羊膜Wish细胞株，攻击病毒选用水泡性口炎病毒(VSV)。a IFN2a (Referon):瑞士 Roch公司生产；a IFN2b (Intron A):美国 Scheing-Plough 公司生产。
[0044]一传统检测方法
[0045]测定干扰素中和抗体采用抗病毒中和生物测定法，以VSV攻击Wish细胞，观察干扰素对细胞的保护作用。细胞病变程度分为0~4级，以细胞出现3级或3级以上病变为阳性标准，血清最高稀释倍数作为其效价。并设置有关对照。对治疗血清予以相应亚型的a IFN进行中和试验，以测定中和抗体，对照组则以上述2种亚型的a IFN进行中和试验以测定中和抗体。对结果采用四格表的X2检验及确切概率法进行统计学处理。
[0046]干扰素中和抗体的产生率，对照组20名健康人中，中和抗体全部阴性。治疗组50例患者中，共有8例NA阳性，总检出率为16%。
[0047]二本发明的方法
[0048]检测抗INF- a中和抗体试剂盒的制备:采用竞争法原理进行试剂盒的制备。具体方法为:调节抗INF- a的所述多克隆抗体浓度2 u g/ml进行酶标板(聚苯乙烯)包被，用10%小牛血清进行封闭，并用HRP标记的抗INF-a生物学活性的单克隆抗体(所述杂交瘤细胞分泌)作为检测标志物，采用一步法进行检测；所述HRP标记的酶标a干扰素多克隆抗体稀释度为1: 10000条件下性价比最高。
[0049]干扰素中和抗体的产生率，对照组20名健康人中，中和抗体全部阴性。治疗组50例患者中，共有8例NA阳性，总检出率为16%。
[0050]实施例5信号传导通路
[0051]在得到保藏号为CCTCC NO:C201242的杂交瘤细胞株后，将其分泌的单克隆抗体能特异性抑制干扰素受体及信号传导通路关键分子STAT1，JAK3的磷酸化作用，进行干扰信号传导通路实验，通过WB实验，进一步确定其生物学特异性。WB实验结果如图1所示，图1-A为关键分子STATl的Western-Blot图，条带“Ab”人羊膜细胞经浓度为100ng/mL的a -干扰素和IOii g/mL的单克隆抗体诱导后的裂解产物，条带为人羊膜细胞仅经浓度为100ng/mL的a -干扰素诱导后的裂解产物；图1-B为关键分子JAK3的Western-Blot图，条带“Ab”人羊膜细胞经浓度为lOOng/mL的a -干扰素和10 u g/mL的单克隆抗体诱导后的裂解产物，条带为人羊膜细胞仅经浓度为lOOng/mL的a-干扰素诱导后的裂解产物。[0052]实施例6 a干扰素单克隆抗体作为包被抗体的试剂盒
[0053]含有所述的a干扰素单克隆抗体的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括:固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液，所述用于包被所述固相载体的抗体为所述的单克隆抗体，所述酶标抗体为酶标a干扰素多克隆抗体。
[0054]用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释所述a干扰素单克隆抗体包被酶标板，IOOiil/孔，4°C 过夜，用洗液(0.05% PBST，pH7.4)洗 3 次；5% BSA 封闭，200 iil/孔，37°C孵育2h后洗3次；加入商品化a干扰素抗原和待测血清样本，100 iU/孔，标准品做倍比稀释。37°C孵育Ih后洗3次；加入抗a干扰素多抗，IOOy L/孔，37°C孵育Ih后洗3次；再加入HRP标记的a干扰素多克隆抗体(上海亿欣生物科技有限公司)，37°C孵育45min后用洗涤液(0.1% PBST，pH7.4)洗 6 次；加 TMB 底物，100 U I/ 孔，37°C显色 IOmin,以 2mol/L硫酸终止反应，在酶标板450nm处测吸光度值(OD45tl)。
[0055]用棋盘滴定法确定各抗体的最佳工作浓度，将所述a干扰素单克隆抗体按照I: 2000、I: 1000OU: 50000稀释3个浓度包被酶标板，阳性对照(0.5 ii g/ml市售重组a干扰素为标准品)和阴性对照(PBS)为样品，多抗按1: 2000、1: 5000,1: 10000稀释3个浓度，HRP标记的a干扰素多克隆抗体按实际说明书推荐稀释度，按照上述实验步骤操作，确定抗体的最佳工作浓度。然后将HRP标记的a干扰素多克隆抗体倍比稀释，再次做棋盘滴定。阳性对照OD45tl值在1.5左右，阴性对照OD45tl值小于0.1的条件下为最佳，初次结果不理想，可进一步缩小或扩大稀释度以取得抗原抗体的最佳反应浓度。结果:在捕获抗体(a干扰素单抗)稀释度为1: 10000、和所述HRP标记的酶标a干扰素多克隆抗体稀释度为1: 5000条件下该ELISA检测方法的性价比最高。
[0056]在上述优化条件下，对20例以上应用INF- a治疗的临床标本(血清)，检测结果均为阳性。
[0057]用不同方法(生物学活性抗体检测法与细胞病变抑制法)检测INF- a生物学活性及其中和抗体，利用统计学方法分析两种方法的优越性与可靠性。
[0058]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.分泌抗人a干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于:所述生物保藏编号为CCTCC NO:C201242o
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的a干扰素单克隆抗体。
3.权利要求2所述的a干扰素单克隆抗体制备检测a干扰素的诊断试剂中的应用。
4.含有酶标权利要求2所述的a干扰素单克隆抗体的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括:固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液，其特征在于:所述用于包被所述固相载体的抗体为抗a干扰素多克隆抗体，所述酶标抗体为酶标a干扰素单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于:所述显色底物为TMB，所述酶标抗体为HRP标记的a干扰素单克隆抗体。
6.检测a干扰素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: A含有包被抗体的固相载体的制备 将抗a干扰素多克隆抗体包被至固相载体上，用洗涤液洗去杂质； B孵育 将样本添加至固相载体中，与所述a干扰素单克隆抗体孵育至充分结合，形成抗原-抗体结合物；将所述酶标抗体与所述抗原-抗体结合物孵育至充分结合，洗去杂质； C检测 加入显色底物，检测光强度。
7.根据权利要求6所述的检测a干扰素的方法，其特征在于:步骤A中，所述a干扰素多克隆抗体的包被浓度≤1g/mL。
8.根据权利要求6所述的检测a干扰素的方法，其特征在于:步骤B中，所述样本为血清作50倍体积稀释。
9.含有权利要求2所述的a干扰素单克隆抗体的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括:固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液，其特征在于:所述用于包被所述固相载体的抗体为权利要求2所述的单克隆抗体，所述酶标抗体为酶标a干扰素多克隆抗体。
10.两种抗体的联合应用，其特征在于:抗a干扰素多克隆抗体作和酶标的权利要求2所述a干扰素单克隆抗体联合在检测a干扰素的间接竞争ELISA法的应用。
【文档编号】C07K16/24GK103484434SQ201310270514
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】朱艮苗 申请人:朱艮苗