一种从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法，其中，该方法包括用酶对蚕沙进行酶解，其中，所述酶选自由维素酶、半纤维素酶、果胶酶、三酰基甘油酰基水解酶和蛋白酶所组成的组中的一种或多种。采用本发明提供的方法，能有效的降解蚕沙原料中的纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质、脂肪类成分。而且酶用量少、处理工艺简单、易操作、耗时短、叶绿素提取率高、成品叶绿素铜钠盐纯度高、对环境无污染、提高了叶绿素铜钠盐的收率在很大程度上缩短了叶绿素的提取时间，减少了溶剂的使用量，降低了后续制备叶绿素铜钠盐过程中的困难，节约了生产成本。
【专利说明】一种从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法。
【背景技术】
[0002]从蚕沙中提取出叶绿素然后经过一系列的反应可以制备出叶绿素铜钠盐，其作为金属卟啉的一种，与叶绿素相比，不仅稳定性增强，也有很好的水溶性，便于使用。而且叶绿素铜钠盐以其本身特有的结构特点和衍生物中所螯合的营养元素在对需要着色、改善或保持天然绿色的食品着色以及提高食品本身使用价值上具有得天独厚的优势，因此被广泛应用于食品添加剂、化妆品添加剂、着色剂、药品、光电转换材料等领域。叶绿素铜钠盐作为一种安全的食品添加剂和着色剂，可用于汽水、糖果、果味粉、果子露、配制酒、罐头、糕点等食品中，也可用于牙膏的着色等。同时研究发现，叶绿素铜钠盐还具有一定的保健功能，如:消炎、促进肝功能恢复等功能，对治疗口腔溃疡、祛除口臭有明显疗效，故在医药工业中，叶绿素铜钠盐成为生产治疗肝炎、胃病及十二指肠溃疡药物的重要原料 。
[0003]目前以蚕沙为原料生产叶绿素铜钠盐的方法主要有以下几种工艺流程:
[0004]1、原料除杂一粉碎一提取一浓缩分离一铜代一皂化成盐一除杂一干燥一叶绿素铜钠盐产品；
[0005]2、原料除杂一粉碎一提取一浓缩一一次皂化一酸化铜代一二次皂化一精制一干
燥一叶绿素铜钠盐产品；
[0006]3、原料除杂一粉碎一加铜化物提取一浓缩一皂化成盐一溶剂洗涤一干燥一叶绿
素铜钠盐产品。
[0007]这三种工艺的程序大致相同，前两种工艺的主要区别在于皂化和铜代的先后顺序；第三种工艺是将铜代反应与提取工艺同步进行，能有效的降低叶绿素的损耗。
[0008]但是由于蚕沙中含有大量纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质等大分子物质，增加了叶绿素的提取难度、一般需要使用大量溶剂来完成对蚕沙原料的提取，这一方面增加了生产的成本和时间消耗，同时由于溶剂为丙酮，丙酮的大量使用也增加了对环境的污染，不利于环保。
[0009]因此有必要开发一种以蚕沙为原料的处理工艺简单、易操作、耗时短、成本投入少、对环境污染程度低的叶绿素铜钠盐制备方法。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于克服现有的叶绿素铜钠盐生产方法中存在的上述缺陷，提供一种能够在提取前有效的去除蚕沙中的纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质、脂肪等大分子物质，处理工艺简单、易操作、耗时短、成本投入少、丙酮使用量少、对环境污染程度低的从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法。
[0011]为了达到以上目的，本发明提供了一种从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法，其中，该方法包括用酶对蚕沙进行酶解，[0012]其中，所述酶选自由维素酶、半纤维素酶、果胶酶、三酰基甘油酰基水解酶和蛋白酶所组成的组中的一种或多种。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点在于:利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、三酰基甘油酰基水解酶中的一种或多种酶对干燥的蚕沙原料进行预处理，能有效的降解原料中的纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质、脂肪类成分。而且酶用量少、处理工艺简单、易操作、耗时短、对环境无污染，在很大程度上缩短了叶绿素的提取时间，减少了溶剂的使用量，降低了后续制备叶绿素铜钠盐过程中的困难，节约了生产成本。另外，依照本发明所提供的方法，叶绿素浓缩膏中叶绿素含量高，成品叶绿素铜钠盐纯度高。并且该方法易实现工业化，能明显提高经济效益。
【具体实施方式】[0014]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0015]一种从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法，其中，该方法包括用酶对蚕沙进行酶解，
[0016]其中，所述酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、三酰基甘油酰基水解酶和蛋白酶所组成的组中的一种或多种。
[0017]其中，所述蚕沙为蚕蛾科动物家蚕蛾(Bombyx mori L.)幼虫的干燥粪便，呈短圆柱形小粒，长2-5毫米，直径1.5-3毫米。本发明对产生蚕沙的蚕龄阶段没有特别的限制，可以为第一至第五蚕龄阶段的蚕沙。
[0018]其中，所述纤维酶可以由外切β-葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和β -葡萄糖苷酶等具有纤维素降解能力的酶组成，本发明中所使用的纤维素酶可以为购买的市售纤维素酶成品例如纤维素复合酶成品，优选的，所述纤维素酶选自由外切β_葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和葡萄糖苷酶所组成的组中的一种或多种。
[0019]在本发明的一种实施方式中，以纤维素酶的总量为基准，外切β_葡聚糖酶的含量为1.0X 10-3-9 X IO-2摩尔％、内切β-葡聚糖酶的含量为1.2 X 10-3-7.6 X IO-2摩尔％、木聚糖酶的含量为8Χ 10_4-1.2Χ 10-1摩尔％、β -葡萄糖苷酶的含量为1.0X 10-3-1.5Χ 10-1摩尔％。
[0020]其中，所述半纤维素酶可以由木糖酶、阿拉伯木聚糖酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶和半乳糖苷酶等具有半纤维素降解能力的酶组成，其中阿拉伯木聚糖酶包括内切β -1, 4-D木聚糖酶(EC3.2.1.8)、外切0-1，4-木聚糖酶化03.2.1.37)和β-木糖苷酶中的一种或多种。本发明中所使用的半纤维素酶可以为购买的市售半纤维素酶成品，例如半纤维素复合酶成品。优选的，所述半纤维素酶选自由木糖酶、阿拉伯木聚糖酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶和半乳糖苷酶所组成的组中的一种或多种。
[0021]在本发明的一种实施方式中，以半纤维素酶的总量为基准，阿拉伯木聚糖酶的含量为1.0X10_3-8.0Χ10—2摩尔％，葡萄糖苷酶的含量为5.0Χ10-3-1.1父10_2摩尔％，甘露聚糖酶的含量为3.0X 10-3-1.5X 10_2摩尔％，半乳糖苷酶的含量为8.0X 10^-3.0X 10_2摩尔％。
[0022]其中，所述果胶酶可以由原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶等具有果胶降解能力的酶组成，本发明中所使用的果胶酶可以为购买的市售果胶酶成品，例如果胶酶复合酶成品。
[0023]优选的，所述果胶酶选自由原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸水解酶和果胶裂合酶所组成的组中的一种或多种。
[0024]在本发明的一种实施方式中，以果胶酶的总量为基准，所述原果胶酶的含量为3.0X 10-3-1.5 X Kr2摩尔％、果胶甲酯水解酶的含量为1.0X 10-3-1.2X 10-2摩尔%、果胶酸水解酶的含量为1.0X 10_3-8X 10_3摩尔％、果胶裂合酶的含量为8.0X 10_4-6.5Χ 10_3摩尔％。
[0025]其中，所述蛋白酶可以由巯基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等能够酶解蚕沙中的蛋白类物质的酶组成，本发明中所使用的蛋白酶可以为购买的市售的蛋白酶成品，例如蛋白酶复合酶成品。优选的，所述蛋白酶为巯基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶中的一种或多种。
[0026]在本发明的一种实施方式中，以蛋白酶的总量为基准，巯基蛋白酶的含量为
8.0X 10-4-8.0 X 10-2摩尔％、天冬氨酸蛋白酶的含量为1.0 X 10-3_6.55 X 10-2摩尔％、丝氨酸/苏氨酸蛋白酶的含量为1.0Χ10_3-5.0Χ10_2摩尔％、金属蛋白酶的含量为1.0Χ10-3-8.0Χ10-2 摩尔 ％。
[0027]其中，所述三酰基甘油酰基水解酶(CAS号:9001-62-1)能使脂肪水解为脂肪酸和甘油，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
[0028]其中，在本发明所提供的方法中，相对于100g的蚕沙，水的用量为20_65g、纤维素酶的用量为0.01-0.20g半纤维素酶的用量为0.008-0.15g、果胶酶的用量为0.005-0.15g、三酰基甘油酰基水解酶的用量为0.005-0.lg，蛋白酶的用量为0.003-0.18g。
[0029]优选的，相对于100g的蚕沙，水的用量为35_60g、纤维素酶的用量为0.05-0.18g、半纤维素酶的用量为0.02-0.10g、果胶酶的用量为0.01-0.10g、三酰基甘油酰基水解酶的用量为0.01-0.06g，蛋白酶的用量为0.005-0.15g。
[0030]在本发明中，为了获得最佳的酶解效果，可以根据不同时期、不同蚕龄蚕沙的化学成分来调配酶的种类及含量。
[0031]当所述蚕沙为第一蚕龄阶段的蚕沙时，所述酶可以包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、果胶酶和三酰基甘油酰基水解酶；
[0032]其中，相对于100g的蚕沙，水的用量为20_65g、纤维素酶的用量为0.05-0.lg、半纤维素酶的用量为0.03-0.075g、果胶酶的用量为0.02-0.08g、三酰基甘油酰基水解酶的用量为0.008-0.02g、蛋白酶的用量为0.03-0.07g。
[0033]其中，当所述蚕沙为第二蚕龄阶段的蚕沙时，所述酶可以包括纤维素酶、蛋白酶、果胶酶；相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.05-0.12g、果胶酶的用量为0.07-0.15g、蛋白酶的用量为0.06-0.lg。
[0034]其中，当所述蚕沙为第三蚕龄阶段的蚕沙时，所述酶可以包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶；相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.05-0.llg、半纤维素酶的用量为0.05-0.08g、果胶酶的用量为0.02-0.05g。
[0035]其中，当所述蚕沙为第四蚕龄阶段的蚕沙时，所述酶可以包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和三酰基甘油酰基水解酶；相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.01-0.03g、半纤维素酶的用量为0.003-0.008g、果胶酶的用量为0.01-0.04g、三酰基甘油酰基水解酶的用量为0.02-0.08g。
[0036]其中，当所述蚕沙为第五蚕龄阶段的蚕沙时，所述酶可以包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶；相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.02-0.07g、半纤维素酶的用量为0.01-0.054g、果胶酶的用量为0.05-0.13g。
[0037]本发明所提供的方法可以包括以下步骤:
[0038](I)将蚕沙与酶和水在25_40°C下接触并酶解2_8h获得酶解产物；
[0039](2)将酶解产物造粒，获得直径为0.2-0.8cm、长度为l_2cm的蚕沙颗粒；
[0040](3)用丙酮提取蚕沙颗粒中的叶绿素，获得提取液；
[0041](4)对提取液进行皂化处理获得皂化液；
[0042](5)对皂化液进行酸化置铜处理获得叶绿素铜钠盐。
[0043]其中，为了提高酶解的效率，所述蚕沙优选为经过粉碎处理的直径为
0.005-0.02cm的粉末状蚕沙。
[0044]其中，步骤(1)可以按以下方式进行，将酶与水按比例混合后与蚕沙接触并搅拌混匀获得蚕沙泥，将蚕沙泥置于25-40°C的恒稳环境中水解2-8h，反应期间控制温度并适时搅拌，以便使酶解反应更为充分。
[0045]本发明中对于接触和搅拌的方法没有特别的限制，可以将酶与水预先配成酶液，再采用边喷淋边搅拌的方式使酶、水和蚕沙充分的接触。
[0046]其中，当所述酶在包括蛋白酶的情况下还包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、三酰基甘油酰基水解酶中的一种或多种时，为了避免蛋白酶对维素酶、半纤维素酶、果胶酶、三酰基甘油酰基水解酶的酶解，所述方法包括先将蚕沙与纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和三酰基甘油酰基水解酶中的一种或多种接触并酶解2_5h后再加入蛋白酶进行酶解3_6h。
[0047]其中，步骤(2)可以按以下方式进行，为了有效降低提取过程中的损耗，可以对酶解产物进行再造粒，先将含水量高的酶解产物烘干至含水量在20%-45%之间，再使用高速造粒机制成直径为0.2-0.8cm、长度为l-2cm的颗粒状物质。整个过程中酶解产物处于高速旋转状态，温度控制在90-120°C之间，时间为3-10min。此步骤要严格把握好加热温度与加热时间，温度过高、时间超长均会严重影响叶绿素的提取率。
[0048]其中，步骤(3)可以按以下方式进行，优选采用70%_90%的丙酮为溶剂对完成造粒后的蚕砂颗粒进行回流提取:回流提取的温度为45-60°C、时间为1.5-2.5h、料液比为1:2-3.5、累计提取3-5次，最后测定出提取液中的叶绿素含量。
[0049]其中，步骤(4)可以按以下方式进行，将步骤(3)获得的提取液用旋转蒸发仪在50-60°C下真空浓缩，得到叶绿素浓缩膏，再进行皂化。皂化条件为:加5%-20%的NaOH-95%乙醇溶液，皂化温度为45-75°C，皂化时间为0.5-3.0h，反应中叶绿素浓缩膏与NaOH-乙醇溶液的质量比在1:4-1:12的范围内。整个皂化过程进行不断搅拌，搅拌速度为100-150r/min0
[0050]其中，步骤(5)可以按以下方式进行，先用1:1 (氯化氢与水的比)的HCl溶液调节皂化液的PH值为2.5-4，再向其中填加10%-25%CuS04溶液，在65-75°C下恒温搅拌
0.5-1.5h。反应完全后加入20%的NaOH溶液成盐，搅拌30min，过滤，得到叶绿素铜钠盐粗品；其中相对于100ml的皂化液，CuSO4溶液的添加量为4-15ml ;相对于100ml的皂化液20%的NaOH的添加量为6-8ml。[0051]本发明还可以包括对叶绿素铜钠盐粗品的提纯步骤，所述提纯步骤可以按照本领域常用的方法进行，例如，所述提纯步骤可以包括:溶剂洗涤法、重结晶法、萃取法、膜分离法、大孔树脂吸附法等。
[0052]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
[0053]蚕沙来源于云南曲靖蚕种的干燥粪便。
[0054]纤维素酶复合酶制剂购自河北百味生物科技有限公司，半纤维素酶复合酶制剂购自河北百味生物科技有限公司，果胶酶复合酶制剂购自北京优利保生物科技有限公司，蛋白酶复合酶制剂购自北京优利保生物科技有限公司，三酰基甘油酰基水解酶购自北京优利保生物科技有限公司。本发明中各复合酶的组成成分见表1。
[0055]表1
[0056]
【权利要求】
1.一种从蚕沙中提取叶绿素铜钠盐的方法，其特征在于，该方法包括用酶对蚕沙进行酶解， 其中，所述酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、三酰基甘油酰基水解酶和蛋白酶所组成的组中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白酶选自由巯基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶所组成的组中的一种或多种；所述纤维素酶选自由外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和葡萄糖苷酶所组成的组中的一种或多种；所述半纤维素酶选自由木糖酶、阿拉伯木聚糖酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶和半乳糖苷酶所组成的组中的一种或多种；所述果胶酶选自由原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶所组成的组中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括以下步骤: (1)将蚕沙与酶和水在25-40°C下接触并酶解2-8h获得酶解产物； (2)将酶解产物造粒，获得直径为0.2-0.8cm、长度为l_2cm的蚕沙颗粒； (3)用丙酮提取蚕沙颗粒中的叶绿素，获得提取液； (4)对提取液进行皂化处理获得皂化液； (5)对皂化液进行酸化置铜处理获得叶绿素铜钠盐。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.01-0.2g、半纤维素酶的用量为0.008-0.15g、果胶酶的用量为0.005-0.15g、三酰基甘油酰基水解酶 的用量为0.005-0.lg、蛋白酶的用量为0.003-0.18g。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述方法包括先将蚕沙与纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和三酰基甘油酰基水解酶中的一种或多种接触并酶解2-5h后再加入蛋白酶进行酶解3-6h。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述蚕沙为第一蚕龄阶段的蚕沙，所述酶包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、果胶酶和三酰基甘油酰基水解酶； 其中，相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.05-0.lg、半纤维素酶的用量为0.03-0.075g、蛋白酶的用量为0.03-0.07g、果胶酶的用量为0.02-0.08g、三酰基甘油酰基水解酶的用量为0.008-0.02g。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述蚕沙为第二蚕龄阶段的蚕沙，所述酶包括纤维素酶、果胶酶和蛋白酶； 相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.05-0.12g、果胶酶的用量为0.07-0.15g、蛋白酶的用量为0.06-0.lg。
8.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述蚕沙为第三蚕龄阶段的蚕沙，所述酶包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶； 相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.05-0.llg、半纤维素酶的用量为0.05-0.08g、果胶酶的用量为0.02-0.05g。
9.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述蚕沙为第四蚕龄阶段的蚕沙，所述酶包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和三酰基甘油酰基水解酶； 相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.01-0.03g、半纤维素酶的用量为0.003-0.008g、果胶酶的用量为0.01-0.04g、三酰基甘油酰基水解酶的用量为.0.02-0.08g。
10.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述蚕沙为第五蚕龄阶段的蚕沙，所述酶包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶； 相对于100g的蚕沙，水的用量为20-65g、纤维素酶的用量为0.02-0.07g、半纤维素酶的用量为0.01-0.054g、果胶酶的用量为0.05-0.13g。
【文档编号】C07D487/22GK103641837SQ201310571845
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】罗立梅, 代刚, 王晓云, 李磊, 欧敏功, 杨巡纭 申请人:云南瑞宝生物科技有限公司