一种河蚬抗氧化肽及其制备方法
一种河蚬抗氧化肽及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种河蚬抗氧化肽及其制备方法。所述的河蚬抗氧化肽是利用复合酶微波协同可控酶解技术对河蚬肉进行深度开发，制备出新型且具有抗氧化功效的抗氧化肽。本发明提高了河蚬资源的利用率，为河蚬的深度加工提供一条新的途径，提升河蚬附加值，促进农民增收，同时在促进河蚬养殖业的发展方面将取得更好的社会和经济效益。
【专利说明】一种河蚬抗氧化肽及其制备方法
[0001]
【技术领域】
本发明涉及一种河蚬抗氧化肽及其制备方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]河蚬,学名(corbicula fluminea),又称黄蚬、金紺、扁螺等,是双壳类软体动物，是我国重要的经济贝类之一。河蚬含有丰富的蛋白质(干样中粗蛋白含量达60%以上)、糖原、必需氨基酸、牛磺酸、多种维生素、以及钙、磷、铁、硒等具有特殊生理作用的矿物质，还含有活性肽等生理活性物质。
[0003]近年来，从水产蛋白中提取抗氧化活性肽的研究也逐渐展开，如已从鳞鱼、鲭鱼、巨鱿鱼皮、白虾头和黄鳍金枪鱼骨架蛋白中提取出具有显著抗氧化活性的肽段，这充分证明水产品中的优质蛋白具有制备抗氧化肽的潜力。
[0004]天然抗氧化肽是继化学性抗氧化物质如BHA、BHT、PG等和天然抗氧化活性物质如茶多酚、VC、类胡萝卜素等之后的一种新型外源性抗氧化剂，其对清除人体内自由基、抑制人体衰老具有良好的效果，而且安全无毒。抗氧化肽不仅分子质量小、容易被人体吸收，而且还有易溶解、低黏度、不易形成凝胶等良好的功能特性，故抗氧化肽正作为一种新兴抗氧化剂而逐渐受到人们推崇。
[0005]目前，河蚬资源的利用仅局限在鲜食，制成蚬干、咸蚬和罐头等粗加工方面，附加值低。
[0006]中国申请CN 102160594A公开了一种河蚬蛋白粉及其制作方法，所述方法包括以下步骤:河蚬肉清洁；绞碎成河蚬肉糜；内源酶和外源酶协同水解；灭酶；添加绿茶粉和活性炭脱色除臭；膜过滤；减压浓缩；离心喷雾干燥。该方法所得的河蚬蛋白粉，适当利用河蚬内源酶分解河蚬软体组织蛋白，结合加入外源生物酶，降低蛋白粉的苦味，提高水解度，减少了外源酶的消耗，所制备的河蚬蛋白粉，容易消化，无腥臭苦味。但上述技术方案存在酶解不充分，所得河蚬抗氧化肽的活性不高的缺陷。
[0007]因此，依然有待提出改进河蚬抗氧化肽的制备方法。
【发明内容】
[0008]本发明的第一目的在于提供一种河蚬抗氧化肽的制备方法，通过利用复合酶微波协同可控酶解技术对河蚬肉进行深度开发，制备出新型且具有抗氧化功效的河蚬抗氧化肽，不仅可提高河蚬资源的利用率，为河蚬的深度加工提供一条新的途径，提升河蚬附加值，促进农民增收，同时在促进河蚬养殖业的发展方面将取得更好的社会和经济效益。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种河蚬抗氧化肽的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:
(1)微波协同复合酶协同酶解河蚬肉，得酶解物；
(2)超滤去除酶解物中大分子蛋白；
(3)将滤过液依次通过葡萄糖凝胶G-50和G-25进行分离纯化，冷冻干燥，即得。
[0010]其中，步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:2-l:6(w/w)的料液比加水，进行匀浆，调节pH至6~8，添加河蚬肉质量的0.7%~1.5%复合蛋白酶，在微波功率70(T900W，55~60°C条件下酶解2(T35min，酶解完成后灭酶，离心，取上清液，得酶解物。
[0011 ] 优选步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉，或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按1:4 (w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至6.8~7.2，添加河蚬肉质量的1.0%~1.2%复合蛋白酶，在微波功率800W，55~60°C条件下酶解25~30min，酶解完成后100°C下灭酶15~20min，冷却到室温，4000r/min离心2(T25min，取上清液，得酶解物。
[0012]其中，所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2~3:1，优选2:1得到的混合物。所述的中性蛋白酶可采用现有技术公开的多种中性蛋白酶，包括但并不局限于中性蛋白酶(N0V0分装，CAS:9068-59-1 ACT:200000u/g EXP: 11/2014上海奥宇生物科技有限公司)。风味蛋白酶同样可采用现有技术公开的多种，包括但并不局限于、风味蛋白酶(N0V0分装，ACT:15000u/g EXP:08/2014上海奥宇生物科技有限公司)，中性蛋白酶属于一种内切酶，具有一定的切割位点；针对一些应用的实际性会复配出复合蛋白酶等，切割位点更广谱，达到完全分解的更理想效果，而风味蛋白酶，在更精细定位切割位点的情况下，分解出一些具风味的氨基酸或肽。中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比疒3:1进行酶解，是经过不同酶种类筛选试验，发现采用该比例范围内这两种酶对河蚬进行酶解得到的产物其总抗氧化能力较强，再将这两种酶按不同比例复配进行单因素试验，得到中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2:1进行酶解，酶解产物的总抗氧化能力最强。
[0013]此外，本发明步骤(1)优选采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆。
[0014]本发明所述的制备方法，步骤(2)采用超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤。
[0015]步骤(3)具体为:
将步骤(2)得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5"lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A280nm值，以管数为横坐标，每管的A280nm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，将总抗氧化能力最强的组分继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5^1mL/min,通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最强的洗脱液组分冷冻干燥，即为河蚬抗氧化肽。
[0016]更具体如:将步骤(2)得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为0.5"lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF5,将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5~lmL/min，通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tol值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最强的洗脱液组分冷冻干燥，即为河蚬抗氧化肽。
[0017]其中，所述的玻璃层析柱为02.0\100011，洗脱液的体积为48￥。
[0018]其中，步骤(3)所述的冷冻干燥为:在真空度为5~10Pa，温度为-51~_53°C的条件下进行真空冷冻干燥l(Tl2h。
[0019]本发明的第二目的在于保护上述方法制备得到的河蚬抗氧化肽。
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
(I)本发明的河蚬抗氧化肽CF2a抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达91.67%，DPPH自由基清除率达67.15%。
[0021](2)本发明制备的河蚬抗氧化肽CF2a，具有分子量小，通过葡聚糖凝胶G-75测定其分子量为1810Da，可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。
[0022](3)河蚬采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，样品破碎全过程都在4°C~6°C低温水浴中进行，保持原有物质活性和性能；且压力高达200MPa，使河蚬肉超微细化，有利于酶解时酶与底物的接触，促进酶解顺利进行。
[0023](4)本发明所提供的河蚬抗氧化肽的制备方法采用复合酶微波协同酶解，微波可以加强复合蛋白酶酶解蛋白的能力，促进酶解顺利进行，保证具有抗氧化活性的肽最大程度释放出来。酶解条件简单可控，反应条件温和，大大缩短酶解时间，且抗氧化肽得率高；所得酶解液经过简单直观的超滤杯过滤除去大分子蛋白，操作更便利。采用葡聚糖凝胶G-50和G-25对多肽进行纯化，得到的抗氧化肽羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率分别是酶解液粗肽的3.41倍和2.65倍。
[0024](5)本发明制备的抗氧化肽以河蚬为原料，价格低廉，得到的抗氧化肽能替代市售的人工合成抗氧化剂，以此降低生产成本和节约社会资源，增加河蚬的附加值，为河蚬的深加工利用开辟了新途径。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
1、速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至6.8，添加河蚬肉质量的1.0%复合蛋白酶(中性蛋白酶:风味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，55°C条件下酶解30min，酶解完成，100°C下灭酶15 min，冷却到室温，4000r/min离心20min,取出上清液。
[0026]2、步骤I得到的上清液经超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤，取滤过液。
[0027]3、将步骤2得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为0.5mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tol值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分分别命名为CF2a、CF2b、CF2c。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，组分CF2a、CF2b、CF2c清除羟自由基能力分别为91.67%,63.33%、16.80%,清除DPPH自由基的能力分别为67.15%,36.35%、15.61%。
[0028]4、收集清除自由基能力最强的洗脱液组分CF2a在真空度为5 Pa，温度为_53°C的条件下进行真空冷冻干燥12h得到粉末，即为河蚬抗氧化肽CF2a。
[0029]本实施例制备的河蚬抗氧化肽CF2a，具有分子量小，通过葡聚糖凝胶G_75测定其分子量为1810Da。此外，该河蚬抗氧化肽CF2a抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达91.67%，超过lmg/mL BHT的羟自由基清除能力(84%)。在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为65%，高于同样条件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0030]实施例2
1、速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至7.0，添加河蚬肉质量的1.1%复合蛋白酶(中性蛋白酶:风味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，58 V条件下酶解28min，酶解完成，100°C下灭酶18min，冷却到室温，4000r/min离心22min,取出上清液。
[0031]2、步骤I得到的上清液经超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤，取滤过液。
[0032]3、将步骤2得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.8mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为0.8mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tol值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分；分别命名为CF2a、CF2b、CF2c。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，组分CF2a、CF2b、CF2c清除羟自由基能力分别为87.56%,58.45%、17.82%，清除DPPH自由基的能力分别为64.78%,32.75%、16.71%。
[0033]4、收集清除自由基能力最强的洗脱液组分CF2a在真空度为8Pa，温度为_52°C的条件下进行真空冷冻干燥Ilh得到粉末，即为河蚬抗氧化肽CF2a。
[0034]实施例3
1、速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节PH至7.2，添加河蚬肉质量的1.2%复合蛋白酶(中性蛋白酶:风味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，60°C条件下酶解25min，酶解完成，100°C下灭酶20min，冷却到室温，4000r/min离心25min,取出上清液。
[0035]2、步骤I得到的上清液经超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤，取滤过液。
[0036]3、将步骤2得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分；分别命名为CF2a、CF2b、CF2c。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，组分CF2a、CF2b、CF2c清除羟自由基能力分别为88.79%,60.63%、18.94%，清除DPPH自由基的能力分别为66.54%,34.78%、17.81%。
[0037]4、收集清除自由基能力最强的洗脱液组分CF2a在真空度为10Pa，温度为_51°C的条件下进行真空冷冻干燥1h得到粉末，即为河蚬抗氧化肽CF2a。
[0038]实施例4
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中，取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:2的料液比加水，进行匀浆，调节pH至6，添加河蚬肉质量的0.7%复合蛋白酶，在微波功率700W，55 V条件下酶解20min。其中，复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比3:1得到的混合物。
[0039]本实施例所制备得到的河蚬抗氧化肽具有分子量小，容易被机体吸收；抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达87.55%,超过lmg/mL BHT的羟自由基清除能力(84%)。在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为63.61%，高于同样条件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0040]实施例5
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中，取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:6的料液比加水，进行匀浆，调节pH至8，添加河蚬肉质量的1.5%复合蛋白酶，在微波功率900W，60°C条件下酶解35min，复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2.5:1得到的混合物。
[0041]本实施例所制备得到的河蚬抗氧化肽具有分子量小，容易被机体吸收；抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达89.79%,超过lmg/mL BHT的羟自由基清除能力(84%)。在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为64.76%，高于同样条件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0042]对比例I
CN 102160594A公开的实施例1，其所制备得到的河蚬蛋白粉是一种含有多肽的混合物，纯度低；分子量大，不易被机体吸收；且活性低，其羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率分别为46.64%和32.46%ο
[0043] 上述实施例中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施例仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中专业技术人员对本发明的技术方案作出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种河蚬抗氧化肽的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)微波协同复合酶协同酶解河蚬肉，得酶解物； (2)超滤去除酶解物中大分子蛋白； (3)将滤过液依次通过葡萄糖凝胶G-50和G-25进行分离纯化，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:2-1:6的料液比加水，进行匀衆，调节pH至6~8，添加河蚬肉质量的0.7%~1.5%复合蛋白酶，在微波功率70(T900W，55~60°C条件下酶解2(T35min，酶解完成后灭酶，离心，取上清液，得酶解物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉，或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:4的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至6.8~7.2，添加河蚬肉质量的1.0%~1.2%复合蛋白酶，在微波功率800W，55~60°C条件下酶解25~30min，酶解完成后100°C下灭酶15~20min，冷却到室温，4000r/min离心2(T25min，取上清液，得酶解物。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于:所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2~3:1得到的混合物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)采用超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤。
6.根据权利要求1 -5任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)具体为: 将步骤(2)得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5~lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A280nm值，以管数为横坐标，每管的A280nm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，将总抗氧化能力最强的组分继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5^1mL/min,通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分；分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最强的洗脱液组分冷冻干燥，即为河蚬抗氧化肽。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:所述的玻璃层析柱为Φ2.0X 100cm，洗脱液的体积为4BV。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述的冷冻干燥为:在真空度为5~10Pa，温度为-51~_53°C的条件下进行真空冷冻干燥l(Tl2h。
9.权利要求1-8任一方法所制备的的河蚬抗氧化肽。
【文档编号】C07K1/16GK104131060SQ201410383112
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】刘晶晶, 韩曜平, 王雪锋, 戴阳军, 金林烽 申请人:常熟理工学院
【专利摘要】本发明公开了一种河蚬抗氧化肽及其制备方法。所述的河蚬抗氧化肽是利用复合酶微波协同可控酶解技术对河蚬肉进行深度开发，制备出新型且具有抗氧化功效的抗氧化肽。本发明提高了河蚬资源的利用率，为河蚬的深度加工提供一条新的途径，提升河蚬附加值，促进农民增收，同时在促进河蚬养殖业的发展方面将取得更好的社会和经济效益。
【专利说明】一种河蚬抗氧化肽及其制备方法
[0001]
【技术领域】
本发明涉及一种河蚬抗氧化肽及其制备方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]河蚬,学名(corbicula fluminea),又称黄蚬、金紺、扁螺等,是双壳类软体动物，是我国重要的经济贝类之一。河蚬含有丰富的蛋白质(干样中粗蛋白含量达60%以上)、糖原、必需氨基酸、牛磺酸、多种维生素、以及钙、磷、铁、硒等具有特殊生理作用的矿物质，还含有活性肽等生理活性物质。
[0003]近年来，从水产蛋白中提取抗氧化活性肽的研究也逐渐展开，如已从鳞鱼、鲭鱼、巨鱿鱼皮、白虾头和黄鳍金枪鱼骨架蛋白中提取出具有显著抗氧化活性的肽段，这充分证明水产品中的优质蛋白具有制备抗氧化肽的潜力。
[0004]天然抗氧化肽是继化学性抗氧化物质如BHA、BHT、PG等和天然抗氧化活性物质如茶多酚、VC、类胡萝卜素等之后的一种新型外源性抗氧化剂，其对清除人体内自由基、抑制人体衰老具有良好的效果，而且安全无毒。抗氧化肽不仅分子质量小、容易被人体吸收，而且还有易溶解、低黏度、不易形成凝胶等良好的功能特性，故抗氧化肽正作为一种新兴抗氧化剂而逐渐受到人们推崇。
[0005]目前，河蚬资源的利用仅局限在鲜食，制成蚬干、咸蚬和罐头等粗加工方面，附加值低。
[0006]中国申请CN 102160594A公开了一种河蚬蛋白粉及其制作方法，所述方法包括以下步骤:河蚬肉清洁；绞碎成河蚬肉糜；内源酶和外源酶协同水解；灭酶；添加绿茶粉和活性炭脱色除臭；膜过滤；减压浓缩；离心喷雾干燥。该方法所得的河蚬蛋白粉，适当利用河蚬内源酶分解河蚬软体组织蛋白，结合加入外源生物酶，降低蛋白粉的苦味，提高水解度，减少了外源酶的消耗，所制备的河蚬蛋白粉，容易消化，无腥臭苦味。但上述技术方案存在酶解不充分，所得河蚬抗氧化肽的活性不高的缺陷。
[0007]因此，依然有待提出改进河蚬抗氧化肽的制备方法。
【发明内容】
[0008]本发明的第一目的在于提供一种河蚬抗氧化肽的制备方法，通过利用复合酶微波协同可控酶解技术对河蚬肉进行深度开发，制备出新型且具有抗氧化功效的河蚬抗氧化肽，不仅可提高河蚬资源的利用率，为河蚬的深度加工提供一条新的途径，提升河蚬附加值，促进农民增收，同时在促进河蚬养殖业的发展方面将取得更好的社会和经济效益。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种河蚬抗氧化肽的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:
(1)微波协同复合酶协同酶解河蚬肉，得酶解物；
(2)超滤去除酶解物中大分子蛋白；
(3)将滤过液依次通过葡萄糖凝胶G-50和G-25进行分离纯化，冷冻干燥，即得。
[0010]其中，步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:2-l:6(w/w)的料液比加水，进行匀浆，调节pH至6~8，添加河蚬肉质量的0.7%~1.5%复合蛋白酶，在微波功率70(T900W，55~60°C条件下酶解2(T35min，酶解完成后灭酶，离心，取上清液，得酶解物。
[0011 ] 优选步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉，或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按1:4 (w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至6.8~7.2，添加河蚬肉质量的1.0%~1.2%复合蛋白酶，在微波功率800W，55~60°C条件下酶解25~30min，酶解完成后100°C下灭酶15~20min，冷却到室温，4000r/min离心2(T25min，取上清液，得酶解物。
[0012]其中，所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2~3:1，优选2:1得到的混合物。所述的中性蛋白酶可采用现有技术公开的多种中性蛋白酶，包括但并不局限于中性蛋白酶(N0V0分装，CAS:9068-59-1 ACT:200000u/g EXP: 11/2014上海奥宇生物科技有限公司)。风味蛋白酶同样可采用现有技术公开的多种，包括但并不局限于、风味蛋白酶(N0V0分装，ACT:15000u/g EXP:08/2014上海奥宇生物科技有限公司)，中性蛋白酶属于一种内切酶，具有一定的切割位点；针对一些应用的实际性会复配出复合蛋白酶等，切割位点更广谱，达到完全分解的更理想效果，而风味蛋白酶，在更精细定位切割位点的情况下，分解出一些具风味的氨基酸或肽。中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比疒3:1进行酶解，是经过不同酶种类筛选试验，发现采用该比例范围内这两种酶对河蚬进行酶解得到的产物其总抗氧化能力较强，再将这两种酶按不同比例复配进行单因素试验，得到中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2:1进行酶解，酶解产物的总抗氧化能力最强。
[0013]此外，本发明步骤(1)优选采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆。
[0014]本发明所述的制备方法，步骤(2)采用超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤。
[0015]步骤(3)具体为:
将步骤(2)得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5"lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A280nm值，以管数为横坐标，每管的A280nm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，将总抗氧化能力最强的组分继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5^1mL/min,通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最强的洗脱液组分冷冻干燥，即为河蚬抗氧化肽。
[0016]更具体如:将步骤(2)得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为0.5"lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF5,将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5~lmL/min，通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tol值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最强的洗脱液组分冷冻干燥，即为河蚬抗氧化肽。
[0017]其中，所述的玻璃层析柱为02.0\100011，洗脱液的体积为48￥。
[0018]其中，步骤(3)所述的冷冻干燥为:在真空度为5~10Pa，温度为-51~_53°C的条件下进行真空冷冻干燥l(Tl2h。
[0019]本发明的第二目的在于保护上述方法制备得到的河蚬抗氧化肽。
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
(I)本发明的河蚬抗氧化肽CF2a抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达91.67%，DPPH自由基清除率达67.15%。
[0021](2)本发明制备的河蚬抗氧化肽CF2a，具有分子量小，通过葡聚糖凝胶G-75测定其分子量为1810Da，可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。
[0022](3)河蚬采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，样品破碎全过程都在4°C~6°C低温水浴中进行，保持原有物质活性和性能；且压力高达200MPa，使河蚬肉超微细化，有利于酶解时酶与底物的接触，促进酶解顺利进行。
[0023](4)本发明所提供的河蚬抗氧化肽的制备方法采用复合酶微波协同酶解，微波可以加强复合蛋白酶酶解蛋白的能力，促进酶解顺利进行，保证具有抗氧化活性的肽最大程度释放出来。酶解条件简单可控，反应条件温和，大大缩短酶解时间，且抗氧化肽得率高；所得酶解液经过简单直观的超滤杯过滤除去大分子蛋白，操作更便利。采用葡聚糖凝胶G-50和G-25对多肽进行纯化，得到的抗氧化肽羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率分别是酶解液粗肽的3.41倍和2.65倍。
[0024](5)本发明制备的抗氧化肽以河蚬为原料，价格低廉，得到的抗氧化肽能替代市售的人工合成抗氧化剂，以此降低生产成本和节约社会资源，增加河蚬的附加值，为河蚬的深加工利用开辟了新途径。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
1、速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至6.8，添加河蚬肉质量的1.0%复合蛋白酶(中性蛋白酶:风味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，55°C条件下酶解30min，酶解完成，100°C下灭酶15 min，冷却到室温，4000r/min离心20min,取出上清液。
[0026]2、步骤I得到的上清液经超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤，取滤过液。
[0027]3、将步骤2得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为0.5mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tol值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分分别命名为CF2a、CF2b、CF2c。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，组分CF2a、CF2b、CF2c清除羟自由基能力分别为91.67%,63.33%、16.80%,清除DPPH自由基的能力分别为67.15%,36.35%、15.61%。
[0028]4、收集清除自由基能力最强的洗脱液组分CF2a在真空度为5 Pa，温度为_53°C的条件下进行真空冷冻干燥12h得到粉末，即为河蚬抗氧化肽CF2a。
[0029]本实施例制备的河蚬抗氧化肽CF2a，具有分子量小，通过葡聚糖凝胶G_75测定其分子量为1810Da。此外，该河蚬抗氧化肽CF2a抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达91.67%，超过lmg/mL BHT的羟自由基清除能力(84%)。在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为65%，高于同样条件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0030]实施例2
1、速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至7.0，添加河蚬肉质量的1.1%复合蛋白酶(中性蛋白酶:风味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，58 V条件下酶解28min，酶解完成，100°C下灭酶18min，冷却到室温，4000r/min离心22min,取出上清液。
[0031]2、步骤I得到的上清液经超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤，取滤过液。
[0032]3、将步骤2得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.8mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为0.8mL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tol值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分；分别命名为CF2a、CF2b、CF2c。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，组分CF2a、CF2b、CF2c清除羟自由基能力分别为87.56%,58.45%、17.82%，清除DPPH自由基的能力分别为64.78%,32.75%、16.71%。
[0033]4、收集清除自由基能力最强的洗脱液组分CF2a在真空度为8Pa，温度为_52°C的条件下进行真空冷冻干燥Ilh得到粉末，即为河蚬抗氧化肽CF2a。
[0034]实施例3
1、速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节PH至7.2，添加河蚬肉质量的1.2%复合蛋白酶(中性蛋白酶:风味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，60°C条件下酶解25min，酶解完成，100°C下灭酶20min，冷却到室温，4000r/min离心25min,取出上清液。
[0035]2、步骤I得到的上清液经超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤，取滤过液。
[0036]3、将步骤2得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，分别命名为CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，将总抗氧化能力最强的CF2继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸懼水为洗脱液，流速为lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tlnm值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分；分别命名为CF2a、CF2b、CF2c。分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，组分CF2a、CF2b、CF2c清除羟自由基能力分别为88.79%,60.63%、18.94%，清除DPPH自由基的能力分别为66.54%,34.78%、17.81%。
[0037]4、收集清除自由基能力最强的洗脱液组分CF2a在真空度为10Pa，温度为_51°C的条件下进行真空冷冻干燥1h得到粉末，即为河蚬抗氧化肽CF2a。
[0038]实施例4
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中，取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:2的料液比加水，进行匀浆，调节pH至6，添加河蚬肉质量的0.7%复合蛋白酶，在微波功率700W，55 V条件下酶解20min。其中，复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比3:1得到的混合物。
[0039]本实施例所制备得到的河蚬抗氧化肽具有分子量小，容易被机体吸收；抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达87.55%,超过lmg/mL BHT的羟自由基清除能力(84%)。在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为63.61%，高于同样条件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0040]实施例5
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中，取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:6的料液比加水，进行匀浆，调节pH至8，添加河蚬肉质量的1.5%复合蛋白酶，在微波功率900W，60°C条件下酶解35min，复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2.5:1得到的混合物。
[0041]本实施例所制备得到的河蚬抗氧化肽具有分子量小，容易被机体吸收；抗氧化活性高，lmg/mL的反应体系羟基自由基清除率达89.79%,超过lmg/mL BHT的羟自由基清除能力(84%)。在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为64.76%，高于同样条件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0042]对比例I
CN 102160594A公开的实施例1，其所制备得到的河蚬蛋白粉是一种含有多肽的混合物，纯度低；分子量大，不易被机体吸收；且活性低，其羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率分别为46.64%和32.46%ο
[0043] 上述实施例中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施例仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中专业技术人员对本发明的技术方案作出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种河蚬抗氧化肽的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)微波协同复合酶协同酶解河蚬肉，得酶解物； (2)超滤去除酶解物中大分子蛋白； (3)将滤过液依次通过葡萄糖凝胶G-50和G-25进行分离纯化，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:2-1:6的料液比加水，进行匀衆，调节pH至6~8，添加河蚬肉质量的0.7%~1.5%复合蛋白酶，在微波功率70(T900W，55~60°C条件下酶解2(T35min，酶解完成后灭酶，离心，取上清液，得酶解物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)具体为:取新鲜河蚬肉，或速冻河蚬肉经流水解冻浙干后，按重量比1:4的料液比加水，采用低温超高压连续流细胞破碎仪进行匀浆，调节pH至6.8~7.2，添加河蚬肉质量的1.0%~1.2%复合蛋白酶，在微波功率800W，55~60°C条件下酶解25~30min，酶解完成后100°C下灭酶15~20min，冷却到室温，4000r/min离心2(T25min，取上清液，得酶解物。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于:所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶与风味蛋白酶按质量比2~3:1得到的混合物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)采用超滤膜切割分子量为3KD的杯式过滤器过滤。
6.根据权利要求1 -5任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)具体为: 将步骤(2)得到的滤过液通过装有葡聚糖凝胶G-50的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5~lmL/min,通过自动部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A280nm值，以管数为横坐标，每管的A280nm值为纵坐标作图，得到含有5个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到5个不同的组分，将总抗氧化能力最强的组分继续通过装有葡聚糖凝胶G-25的玻璃层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5^1mL/min,通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管,每管3mL,分别测定每管的A28tlnm值，以管数为横坐标，每管的A28tol值为纵坐标作图，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并同一分离峰的洗脱液，得到3个不同的组分；分别测定3个组分羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最强的洗脱液组分冷冻干燥，即为河蚬抗氧化肽。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:所述的玻璃层析柱为Φ2.0X 100cm，洗脱液的体积为4BV。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述的冷冻干燥为:在真空度为5~10Pa，温度为-51~_53°C的条件下进行真空冷冻干燥l(Tl2h。
9.权利要求1-8任一方法所制备的的河蚬抗氧化肽。
【文档编号】C07K1/16GK104131060SQ201410383112
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】刘晶晶, 韩曜平, 王雪锋, 戴阳军, 金林烽 申请人:常熟理工学院
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0访客 来自[中国] 2023年03月20日 16:27做的很详细做的很详细做的很详细做的很详细
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