碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸的制作方法
【专利摘要】一种碱提酸沉法从青蒿素生产废料中分离二氢青蒿酸，是以青蒿素生产废液或废膏为原料，真空浓缩挥干生产废液或废膏中的残余溶剂，先用碱性溶液超声提取，合并提取液，去沉淀，取上清液，于上清提取液中加入酸性溶液，收集沉淀，用干净的蒸馏水冲洗沉淀，冷冻干燥获得干燥的二氢青蒿酸产品。本发明首次建立了从青蒿素生产废料中分离二氢青蒿酸的方法，采用超声波辅助提取法，有效提高提取效率与回收率；并采用冷冻干燥法，有效解决了传统干燥方法引起的二氢青蒿酸产品降解的问题，产品纯度达72%以上，回收率高，达90%以上；生产量大，容易实现产业化生产。
【专利说明】碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种二氢青蒿酸的制备方法，具体涉及一种采用碱提酸沉法从青蒿素生产废料中分离二氢青蒿酸的方法。
【背景技术】
[0002]青蒿素是我国发现的第一个被国际公认并有的自主知识产权的天然药物，也是我国惟一被WHO认可的按西药研究标准开发的中药。目前市场上的青蒿素均由我国生产，对我国中药产业的发展起着重要地推动作用。自世界卫生组织将青蒿素认定为目前最安全、有效的抗疟药物，并作为治疗疟疾首先用药后，青蒿素的市场需求急剧增长。疟疾是流行范围最广、历史最长、危害最大的人类寄生虫传染病，长期以来一直是第三世界国家发病率和死亡率最高的病种之一。据世界卫生组织的报告，目前全世界至少有25亿人口生活在疟疾区，每年全球死于疟疾的人数超过300万(其中一半为5岁以下儿童)。随着全球气温变暖及环境破坏加剧等原因，近年疟疾的发病率呈上升趋势。WHO根据对抗疟疾药物的需求推测，青蒿素类药品每年的销售额为15亿美元。但由于青蒿素含量低，导致青蒿素生产成本高、市场价格高，非洲、东南亚、中东等发展中国家的大部分疟疾患者根本无力购买青蒿素类药品，所以造成了青蒿素在抗疟疾方面应用受到很大限制。我国青蒿素产业也因此受到严重影响，青蒿素的市场价格从每公斤7000元跌至不到2000元，青蒿素企业已无利润空间甚至亏损，许多青蒿素生产厂家逼迫停产或转产。与此同时，发展中国家尤其是非洲南部国家陷入了抗疟药物严重短缺的困境。
[0003]因此，降低生产成本是拓展青蒿素市场、提高产品竞争力的核心所在。低成本生产青蒿素的研究受到国内外普遍关注。因在黄花蒿中，二氢青蒿酸的含量为青蒿素的6倍左右，如果将二氢青蒿酸完全转化为青蒿素则青蒿素的含量将提高6倍左右，青蒿素生产成本将得到突破性降低。目前，二氢青蒿酸转化青蒿素的方法取得了重要进展，Seeberger和L6vesque使用Vapourtec流动合成仪作为合成反应平台，外加紫外照射这样的光化学反应的方式将(二氢)青蒿酸体外转化获得了青蒿素，该研究成果在2012年的国际权威杂志《Angewandte Chemie》上发表。在(二氢)青蒿酸体外转化取得突破后，(二氢)青蒿酸的规模化制备成了低成本生产青蒿素的关键。美国加州大学伯克利分校Jay Keasling教授和他的研究小组将来源于高等青蒿的青蒿素合成酶(ADS)和新型细胞色素P450单加氧酶基因(CYP71AV1)植入酵母，酵母会把代谢中产生的中间化合物改造成青蒿酸。他们利用酵母天然的甲羟戊酸途径，该途径在正常情况下通过糖类代谢产生乙酰辅酶A来合成留醇；而在他们所合成的代谢途径中，甲羟戊酸途径被用来大量产生中间体法尼焦磷酸盐(FPP)，而法尼焦磷酸盐接下来可被在酵母中表达的ADS和CYP71AV1催化产生青蒿酸。这一工作的难度在于对来自酵母、青蒿多种基因及其代谢途径的组装与精密调控。Keasling教授的这一研究成果也于2006年在世界权威杂志《NATURE》上发表。2010年，Wageningen大学Harro教授及其研究团队采用转基因烟草GVicoiia/?a benthamiana)合成了前体青蒿酸。然而，尽管上述异源合成青蒿酸的方法取得阶段性进展，但由于成本高至今尚未能产业化开发。在青蒿素的生产过程中，二氢青蒿酸也被同时从植物体中提取出来，但在青蒿素的进一步分离纯化过程中，二氢青蒿酸被留在生产废液中，并没有再加以利用，造成了资源的大量浪费。因此，研究从青蒿素生产废液中分离二氢青蒿酸的方法对充分利用黄花蒿资源、提高产品附加值与降低青蒿素生产成本有非常重要的意义，目前尚无相关文献报道。
[0004]
【发明内容】
:
本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种碱提酸沉法从青蒿素生产废料中分离二氢青蒿酸，该法是取青蒿素生产废液或废膏，挥干残余溶剂，先用碱性溶液超声提取，合并提取液，去沉淀，在提取液中加入酸性溶液，收集沉淀，用干净的蒸馏水冲洗沉淀，冷冻干燥获得干燥的二氢青蒿酸产品。该法制率高、周期短、成本低。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，该方法包括如下步骤，结合参见图1:
A、以青蒿素生产废料为原料，真空浓缩至生产废料中的残余溶剂挥干，得浓缩物；其中，上述青蒿素生产废料指青蒿素生产废液或废膏；所述青蒿素生产废液中残余溶剂的挥干是采用真空浓缩的方法回收溶剂，浓缩温度为33-40°C，真空浓缩生产废液至有机溶剂全部挥干，再加入等体积的甲醇或无水乙醇，在33-40°C，继续真空浓缩直至溶液全部挥干；所述青蒿素生产废膏中残余溶剂的挥干是于生产废膏中加入等体积的甲醇或无水乙醇，33-40 V下，真空浓缩至溶液全部挥干。
[0006]B、碱液超声提取:以0.2%-0.6%质量体积浓度的碱性溶液为提取剂，按3_5g浓缩物加Iml碱性溶液的比例进行超声提取2次，超声功率80-115瓦，超声时间40_60min，超声温度为30-50°C ;其中，所述碱性溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠溶液，该氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液皆为分析纯。
[0007]C、去沉淀:超声提取完毕，合并二次提取液，室温条件下采用离心或过滤去沉淀，收集上清液，得到澄清的提取溶液；其中，离心去沉淀是以3000rpm/min离心10_15min，去沉淀；过滤去沉淀是真空抽滤去沉淀。
[0008]D、加酸沉淀:于上述澄清提取溶液中加入0.3-2mol/L的酸性溶液，并不断搅拌，直到溶液PH值为1.0-4.5，室温放置直至沉淀完全析出；其中，该酸性溶液为盐酸、硫酸或磷酸溶液，该盐酸、硫酸或磷酸皆为分析纯。
[0009]E、冲洗沉淀:收集沉淀，使用蒸馏水冲洗沉淀2次，蒸馏水的每次使用量按Ig沉淀加2ml蒸馏水的比例添加；
F、干燥沉淀:将冲洗后的沉淀于_21°C预冻10-24h，真空条件下，于冷冻干燥机上进行冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%，所得产品即为二氢青蒿素产品。
[0010]本发明具有如下优点:本发明以青蒿素生产废料为原料，进行回收利用；首次建立了从青蒿素生产废料中分离二氢青蒿酸的方法，本方法采用超声波辅助提取法，有效提高提取效率与回收率；并采用冷冻干燥法，有效解决了传统干燥方法引起的二氢青蒿酸产品降解的问题；产品纯度达72%以上，回收率高，达90%以上；周期短、成本低，生产量大，容易实现产业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明方法的流程图。
[0012]图2是二氢青蒿酸产品含量分析气相色谱图。
[0013]【具体实施方式】:
下面，本发明将以实施例进行作进一步地说明，但是本发明并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
[0014]实施例1
取青蒿素生产废液20L，33°C真空浓缩至有机溶剂挥干，加入450mL甲醇，40°C真空浓缩至溶液全部挥干，称取残渣，重2.3Kg ;加入11.5L质量体积浓度为0.2%的氢氧化钠溶液，80瓦超声提取2次，超声温度为50°C，每次60min，合并2次提取液，室温下3000rpm离心lOmin，去沉淀，收集上清液，得澄清提取溶液，于澄清提取溶液中加入lmol/L的盐酸溶液，并不断搅拌，直到溶液PH值为4.5，室温放置直至沉淀完全析出，倒去上清液，收集沉淀，150 mL蒸馏水冲洗沉淀2次，冲洗后的沉淀于_21°C预冻10h，真空冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%，即得二氢青蒿素产品，重量为62.53g。
[0015]产品检测采用气相检测法(方法参考文献[Tian N et al.Simultaneousisolat1n of artemisinin and its precursors from Artemisia annua L.bypreparative RP-HPLC.B1med Chromatogr.2012，26 (6): 7OS-13.]),具体如下:称取 10mg产品，溶解于50mL乙腈中，进气相色谱仪检测。色谱条件:FID检测器，HP-5.0弹性石英毛细管柱(30mX0.32mmX0.25μπι)，高纯氮气(99.999%)为载气，流速3mL/min，高纯氮气40mL/min尾吹，进样口温度235 °C，检测器温度285 °C，分流比1: 1，进样量I μ L，外标法定量。柱升温程序:初始温度180°C，以6°C /min升至220°C后，保持3 min,以30°C /min升至280°C,保持lOmin。检测结果表明如图2所示,二氢青蒿酸含量为81.17%。
[0016]实施例2
取青蒿素生产废膏5kg，加入410mL无水乙醇，40°C真空浓缩至溶剂全部挥干，称取残渣，重3.7Kg ;加入11.1L质量体积浓度为0.6%的碳酸氢钠溶液，90瓦超声提取2次，每次50min,超声温度为45°C,合并2次提取液,室温下3000rpm离心12min,去沉淀，收集上清液，得澄清提取溶液；于澄清提取溶液中加入0.5mol/L的硫酸溶液，并不断搅拌，直到溶液pH值为3.2，室温放置直至沉淀完全析出，倒去上清，收集沉淀，190mL蒸馏水冲洗沉淀2次，将冲洗后的沉淀于_21°C预冻15h，真空冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%，即得二氢青蒿素产品，产品重85.lg，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)表明，二氢青蒿酸含量为73.61%。
[0017]实施例3
取青蒿素生产废膏4kg，加入350 mL甲醇，33°C真空浓缩至溶剂全部挥干，称取残渣，重2.9Kg ;加入11.6L质量体积浓度为0.5%的磷酸二氢钠溶液，100瓦超声提取2次，每次45min,超声温度为40°C,合并2次提取液,室温下3000rpm离心15min,去沉淀，收集上清液，得澄清提取液，在澄清提取溶液中加入2mol/L的磷酸溶液，并不断搅拌，直到溶液pH值为1.0，室温放置直至沉淀完全析出，倒去上清，收集沉淀，150mL蒸馏水冲洗沉淀2次，将冲洗的的沉淀于_21°C预冻24h，真空冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%，即得二氢青蒿素产品，产品重72.5g，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)表明，二氢青蒿酸含量为78.57%。
[0018]实施例4
取青蒿素生产废液10L，40°C真空浓缩至有机溶剂挥干，加入220mL无水乙醇，33°C真空浓缩至溶液全部挥干，称取残渣，重1.5Kg ;加入6.0L质量体积浓度为0.3%的磷酸钠溶液，95瓦超声提取2次，每次55min，超声温度为30°C，合并提取液，室温下3000rpm离心13min,去沉淀，收集上清液，得澄清提取液，于澄清提取溶液中加入0.3mol/L的硫酸溶液，并不断搅拌，直到溶液PH值为3.0，室温放置直至沉淀完全析出，倒去上清，收集沉淀，90mL蒸馏水冲洗沉淀2次，将冲洗后的沉淀于_21°C预冻20h，真空冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%，即得二氢青蒿素产品，产品重40.5g,经气相色谱检测(方法与实施例1相同)表明，二氢青蒿酸含量为75.13%。
[0019]实施例5
取青蒿素生产废膏8kg，加入700mL甲醇，35°C真空浓缩至溶剂全部挥干，称取残渣，重5.7Kg ;加入20.8L质量体积浓度为0.4%的磷酸氢二钠溶液，115瓦超声提取2次，每次40min，超声温度为50°C，合并2次提取液，真空抽滤，去沉淀，收集澄清过滤液，于澄清提取溶液中加入1.2mol/L的硫酸溶液，并不断搅拌，直到溶液pH值为4.5，室温放置直到沉淀完全析出，倒去上清，收集沉淀，300mL蒸馏水冲洗沉淀2次，将冲洗后沉淀于_21°C预冻10h，真空冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%，即得二氢青蒿素产品，产品重143.2g，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)表明，二氢青蒿酸含量为76.33%。
[0020]实施例6
取青蒿素生产废膏2kg，加入175mL无水乙醇，38°C真空浓缩至溶剂全部挥干，称取残渣，重1.5Kg ;加入7.5L质量体积浓度为0.3%的碳酸钠溶液，85瓦超声提取2次，每次50min,超声温度为40°C,合并2次提取液,室温下3000rpm离心1min,去沉淀,收集上清液，得澄清提取溶液，于澄清提取溶液中加入1.7mol/L的盐酸，并不断搅拌，直到溶液pH值为
2.5，室温放置直至沉淀完全析出，倒去上清，收集沉淀，300mL蒸馏水冲洗沉淀2次，将冲洗后的沉淀于_21°C预冻20h，真空冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%，即得二氢青蒿素产品，产品重36.1g,经气相色谱检测(方法与实施例1相同)表明，二氢青蒿酸含量为80.15%。
【权利要求】
1.一种碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，该方法包括如下步骤: A、以青蒿素生产废料为原料，真空浓缩至生产废料中的残余溶剂挥干，得浓缩物； B、碱液超声提取:以0.2%-0.6%质量体积浓度的碱性溶液为提取剂，按3-5g浓缩物加Iml碱性溶液的比例进行超声提取2次，超声功率80-115瓦，超声时间40_60min，超声温度为 30-50 0C ； C、去沉淀:超声提取完毕，合并二次提取液，室温下去沉淀，收集上清液，得到澄清的提取溶液； D、加酸沉淀:于上述澄清提取溶液中加入0.3-2mol/L的酸性溶液，并不断搅拌，直到溶液PH值为1.0-4.5，室温放置直至沉淀完全析出； E、冲洗沉淀:收集沉淀，使用蒸馏水冲洗沉淀2次，蒸馏水的每次使用量按Ig沉淀加2ml蒸馏水的比例添加； F、干燥沉淀:将冲洗后的沉淀于_21°C预冻10-24h，真空冷冻干燥，直至产品水分含量低于1%。
2.如权利要求1所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述A步骤中的青蒿素生产废料指青蒿素生产废液或废膏。
3.如权利要求2所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述青蒿素生产废液中残余溶剂的挥干是于33-40°C，真空浓缩生产废液至有机溶剂全部挥干，再加入等体积的甲醇或无水乙醇，在33-40°C，继续真空浓缩直至溶液全部挥干。
4.如权利要求2所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述青蒿素生产废膏中残余溶剂的挥干是于生产废膏中加入等体积的甲醇或无水乙醇，33-40 V下，真空浓缩至溶液全部挥干。
5.如权利要求1所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤B中的碱性溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠溶液，其中，氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液皆为分析纯。
6.如权利要求1所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤C中的室温下去沉淀是于室温下，采用离心或过滤去沉淀。
7.如权利要求6所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述离心去沉淀是以3000rpm/min离心10_15min,去沉淀。
8.如权利要求6所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述过滤去沉淀是真空抽滤去沉淀。
9.如权利要求1所述的碱提酸沉法分离青蒿素生产废料中二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤D中的酸性溶液为盐酸、硫酸或磷酸溶液，其中，盐酸、硫酸或磷酸皆为分析纯。
【文档编号】C07C51/48GK104262137SQ201410486319
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】刘硕谦, 曹娟, 廖欢, 周兰, 杨威, 田冬铭, 吴敦超 申请人:湖南农业大学