一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：A）构建基因表达模块，所述基因表达模块包括青蒿酸生产相关的基因、所述青蒿酸生产相关的基因上游的启动子和所述青蒿酸生产相关的基因下游的终止子；B）将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。本发明的方法具有简单快速高效的优点，避免了多级的克隆，也不需要依赖酶切位点，多片段共同转化，同源重组效率高，可以明显缩短工程菌构建时间。
【专利说明】一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法。
【背景技术】
[0002]青蒿素(artemisinin)是中国科学家于20世纪70年代从传统中草药青蒿或称黄花蒿(Artemisia annuaL.)中分离提纯的抗痕有效单体，其化学本质是含有“过氧桥”结构(1，2，4-三噁烷环)的倍半萜内酯。以青蒿素为母核经人工半合成获得的青蒿素琥珀酸酯(青蒿琥酯)、青蒿素甲醚(蒿甲醚)、青蒿素乙醚(蒿乙醚)和双氢青蒿素等青蒿素类药物,血中溶解性好,生物利用度高,对氯喹抗性疟疾及致命性脑型疟有特效，已成为世界卫生组织(WHO)倡导的“基于青蒿素的联合疗法”(artemisinin-based combinationtherapies’ACTs)首选的抗疟新药，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚复方已被列入WHO “基本药品目录”。
[0003]目前而言青蒿素的来源主要有4种方式:
[0004]第一种是直接从青蒿中提取，这是目前青蒿素的主要来源。但是青蒿的分布地域狭窄，青蒿中青蒿素的含量很低，因此天然来源的青蒿素已不能满足日益增长的需要。
[0005]第二种方式是通过化学全合成来生产青蒿素，这种方式成本高，难度大，目前还不能投入生产，基本上处 于试验阶段。
[0006]第三种方式是通过细胞培养来生产青蒿素，研究报道，实验室培养的青蒿发状根中青蒿素的含量能达550mg/L，但要进行商业化生产还有很多工作要做。
[0007]第四种方式是通过代谢工程来生产青蒿素，在模式菌构建青蒿酸生物合成途径，利用重组的模式菌生产青蒿酸，再以青蒿酸为原料化学合成青蒿素。
[0008]经过多年研究，青蒿素的生物合成基本已经阐明，主要包括三个阶段:第一步是乙酰辅酶A形成法尼基焦磷酸(FPP);第二步是通过FPP合成倍半萜紫穗槐_4，11-二烯；最后一步是由紫穗槐-4，11-二烯合成青蒿酸或二氢青蒿酸。进而形成青蒿素(图1)。
[0009]2003年，Mart in等在大肠杆菌中导入9个基因，这9个基因包括合成MVA (甲羟戊酸)的编码基因以及ADS(紫穗槐-4，11-二烯合酶)基因，通过在大肠杆菌中重建MVA途径和紫穗槐-4，11-二烯合成途径，使其产生了青篙素关键中间产物紫穗槐_4，11-二烯(MartinVJj Pitera DJj Withers ST，et al.Engineering a mevalonate pathway in Escherichiacoli for production of terpenoids.Nat Biotechnol，2003，21:796-803)。
[0010]2006年，Lindahl等在酿酒酵母中导入含ADS基因的质粒或将ADS基因整合到酵母染色体上，分别获得600和100μ g/L紫穗槐-4，11-二烯。这是第一次在真核生物中生产出青篙素体，为今后利用酵母生产青篙素前体提供了可能(Lindahl Ann-Louise, Olsson ME., Merche P，et al，Production of the artemisinin preceursor amorpha—4，11—dieneby engineered Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology Letter，2006，28:571-580)。
[0011]同年，R0 DK等以酿酒酵母为宿主菌，导入ADS、CYP71AV1基因，重建了青篙酸的代谢途径，并通过培养条件优化，获得115mg/L青蒿酸(Ro DK, Paradise EM., Ouellet M etal, Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineerdyeast, Nature, 2006, 440:940-943)。
[0012]2007年，专利申请CN200710187922.8公开了导入HMG_CoA、ADS合酶和FPP合酶
以及其他基因的方法构建青蒿酸生产菌。
[0013]根据上述文献，虽然可以构建出青蒿酸基因工程菌，但是构建时需要依次将青蒿酸表达相关的基因整合于酵母菌染色体上，涉及多级克隆，且依赖于合适的酶切位点选择，操作繁琐，周期长。
【发明内容】
[0014]为了克服现有技术中的不足，本发明旨在提供一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法。
[0015]本发明的产青蒿酸基因工程菌的构建方法，包括以下步骤:
[0016]A)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括青蒿酸生产相关的基因、所述青蒿酸生产相关的基因上游的启动子和所述青蒿酸生产相关的基因下游的终止子；
[0017]B)将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。 [0018]根据本发明，所述步骤A)中所述基因表达模块还包括抗性基因、所述抗性基因上游的启动子和所述抗性基因下游的终止子。
[0019]根据本发明，所述步骤A)中所述构建基因表达模块包括以下步骤:
[0020]Al)通过PCR扩增获得所述青蒿酸生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述青蒿酸生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段；
[0021]A2)以所述青蒿酸生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述青蒿酸生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段为模板，通过重叠PCR扩增获得基因表达模块。
[0022]根据本发明的优选实施例，所述步骤A)中所述青蒿酸生产相关的基因为ads、amo和 cpr。
[0023]根据本发明的优选实施例,所述ads、amo和cpr来源于青蒿。
[0024]根据本发明的优选实施例，所述步骤A)中所述启动子选自ADHlp、TEFlp、TPIlp和PGKlp。
[0025]根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于酿酒酵母。
[0026]根据本发明的优选实施例，所述步骤A)中所述终止子选自TKLlt、ADHlt、EN02t和TDH2t。
[0027]根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于酿酒酵母。
[0028]根据本发明的优选实施例，所述抗性基因为ble基因。
[0029]根据本发明的优选实施例，所述抗性基因来源于pGAPZ α A。
[0030]本发明的有益效果:将外源基因片段同时转入酵母细胞内，利用酵母自身胞内生物质系统一步将各片段组装，并进一步同源整合到设计的染色体位置，具有简单快速高效的优点，避免了多级的克隆，也不需要依赖酶切位点，多片段共同转化，同源重组效率高，1-2周即可获得工程菌株，这种良好的酵母基因工程方法可以明显缩短工程菌构建时间。按照本发明的方法获得的基因工程菌的青蒿酸的发酵产量可达到大约1-1.5g/L，具有良好的工业应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为青蒿(Artemisiae annuae)的青蒿素合成途径示意图,其中，ADS代表紫穗槐-4，11- 二烯合酶，AMO代表紫穗槐-4，11- 二烯P450单加氧酶，CPR代表细胞色素P450氧化还原酶。
图2为PCR程序I。
图3为PCR程序2。
图4为Overlap PCR程序。
【具体实施方式】
[0032]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
[0033]实施例1、实验方案及引物设计
[0034]本实施例的实验方案设计如下: [0035]在酿酒酵母BY4742 (购自 EUROSCARF，编号 Y10000，菌株信息:MAT a ；his3 Δ I ；Ieu2 Δ O ；lys2 Δ O ；ura3 Δ O)中表达来自于青蒿的青蒿素合成途径的3个基因ads(GenBank:DQ241826)、amo (GenBank:DQ872632)和 cpr (GenBank:DQ984181 )，经酵母偏爱密码子优化，并同时表达ble基因(Zeocin抗性基因)作为筛选标记，选择酵母染色体δ位点作为整合位点，各基因模块在染色体上的整合组装顺序如图1所示。将各启动子和基因分别编号，如表1所示。
[0036]表1、各启动子和基因编号
[0037]
【权利要求】
1.一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: A)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括青蒿酸生产相关的基因、所述青蒿酸生产相关的基因上游的启动子和所述青蒿酸生产相关的基因下游的终止子； B)将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中所述基因表达模块还包括抗性基因、所述抗性基因上游的启动子和所述抗性基因下游的终止子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中所述构建基因表达模块包括以下步骤: Al)通过PCR扩增获得所述青蒿酸生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述青蒿酸生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段； A2)以所述青蒿酸生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述青蒿酸生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段为模板，通过重叠PCR扩增获得基因表达模块。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中所述青蒿酸生产相关的基因为ads、amo和cpr。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述ads、amo和cpr来源于青蒿。
6.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中所述启动子选自ADHlp、TEFlp、TPIlp 和 PGKlp。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述启动子来源于酿酒酵母。
8.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中所述终止子选自TKLlt, ADHlt,EN02t和 TDH2t。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述终止子来源于酿酒酵母。
10.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述抗性基因为ble基因。
11.如权利要求 10所述的方法，其特征在于，所述抗性基因来源于pGAPZaA。
【文档编号】C12R1/865GK103981110SQ201310048422
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年2月7日 优先权日:2013年2月7日
【发明者】魏维, 戈梅, 孙新强, 罗敏玉, 肖彩霞, 夏兴, 盛保伟, 金一平 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司, 浙江医药股份有限公司新昌制药厂