一种甲氧苄啶半抗原t2制备完全抗原的方法及应用的制作方法
【专利摘要】一种甲氧苄啶半抗原T2制备完全抗原的方法及应用，属于生物化工【技术领域】。本发明的甲氧苄啶半抗原T2是利用嘧啶核一端的氨基衍生出活性羧基，经过纯化得到单一特异性结构的甲氧苄啶羧基衍生物（TMP-HS），该衍生物为甲氧苄啶半抗原T2，将半抗原T2与载体蛋白偶联后形成甲氧苄啶完全抗原。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法及胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的甲氧苄啶残留。
【专利说明】-种甲氧节惦半抗原T2制备完全抗原的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甲氧予巧半抗原T2制备完全抗原的方法及应用，属于生物化工
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] S甲氧予胺嚼巧（Trimethoprim，TMP )，又名甲氧予巧，和二甲氧予胺嚼巧 (Diaveridine，DVD)都是一种二氨基嚼巧类的二氨叶酸还原酶抑制剂，白色结晶型粉末，不 溶于水，微溶于氯仿、己醇、丙丽，但易溶于冰己酸等有机酸。本身抗菌能力较弱，因此常不 单独使用，但与賴胺类、巧喃类、唾诺丽类等抗生素联合使用，可大幅度增强抗生素的应用 效果，可治疗鸡白痴、禽霍乱、细菌性感染等畜禽疾病。但抗生素和协同增效剂的过度使用 和不合理用药，使药物过量残留于动物性食物中，从而对人体健康造成危害。我国农业部 和欧盟、日本等都对TMP在动物组织中的最大残留限量值(MRL)做出了规定，其中我国规 定TMP的标志性残留物是其本身，其在畜禽肌肉、肝肾、脂肪W及鱼肉、皮等组织中的MRL 值为50yg/kg，欧盟明确规定其不能用于蛋类，日本规定其在鱼类、鸡组织中的MRL值为 50 y g/kg。
[0003] TMP和DVD的结构式如下：
【权利要求】
1. 一种甲氧苄啶半抗原T2的制备方法，其特征在于： 甲氧苄啶半抗原T2结构简式为：
步骤为：100mL三颈瓶中依次加入IOmL吡啶、3.2 g对氨基苯甲酸、5mg 4-二甲氨基 吡啶，60°C水浴加热磁力搅拌至溶液澄清；另以IOmL吡啶溶解2.9 g甲氧苄啶并滴加到所 述三颈瓶中，继续搅拌反应3天；采用薄层色谱法，以甲醇：四氢呋喃：三氯甲烷体积比为 I : 1 : 5作为展开剂监控反应进程；减压0.092 MPa、60°C蒸馏IOmin将溶剂全部蒸走，得 到黄色油状物；继续滴加质量体积比为10%的NaHCO3水溶液至不再产生浑浊，过滤并调节 上清液在pH5. 0酸性条件下重结晶析出白色固体，7500 r/min离心8min，滤饼60°C烘干即 为甲氧苄啶半抗原T2。
2. 用权利要求1所述方法制得的甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法，其 特征在于：将甲氧苄啶半抗原T2与载体蛋白偶联后制备得到甲氧苄啶完全抗原。
3. 根据权利要求2所述用甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法，其特征在 于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白0VA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH 或人血清白蛋白HAS中的一种。
4. 根据权利要求3所述用甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法，其特征在 于：制备50 : 1及100 : 1两种甲氧苄啶完全抗原T2-ZD-BSA，步骤为： (1) 甲氧苄啶半抗原T2的活化：将甲氧苄啶半抗原T2用DMF溶解，按甲氧苄啶半抗原 T2 :盐酸摩尔比1 : 2.5混合，盐酸溶液的浓度为謂，在41：下预冷3〇1^11后，逐滴添加新 配制的质量体积比为10%的亚硝酸钠溶液，以淀粉-碘化钾试纸检测呈蓝黑色，继续搅拌 反应2h，得到活化的甲氧苄啶半抗原T2溶液； (2) 载体蛋白BSA溶液的配制：取BSA，按甲氧苄啶半抗原T2 : BSA摩尔比分别为50 : 1及100 : 1，用〇. IM pH9. 6的碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的BSA浓度大于3mg/mL，且 碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5 : 1，得到BSA溶液； (3) 完全抗原的制备：将步骤（1)所得14. 5mg/mL活化的甲氧苄啶半抗原T2溶液ImL慢 速滴加到步骤（2)所得22mg/mL BSA溶液I. 5mL及3mL中，室温下反应12h ;用PBS缓冲液 透析3天，期间换水8次，即得到50 : 1及100 : 1的两种甲氧苄啶完全抗原T2-ZD-BSA。
5. 根据权利要求3所述用甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法，其特征在 于：制备免疫原T2-GA-BSA及包被原T2-GA-0VA的步骤为： (1) 甲氧苄啶半抗原T2的活化：将甲氧苄啶半抗原T2用DMF溶解，按甲氧苄啶半抗原 T2 :戊二醛反应摩尔比为1 : 1.5,在4°C下，搅拌反应2h，再在室温25°C下反应12h，得到 活化的甲氧苄啶半抗原T2溶液； (2) 载体蛋白溶液的配置：取BSA及0VA，甲氧苄啶半抗原T2 : BSA/0VA的摩尔比均为 100 : 1，用0. IM pH9. 6的碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸 盐缓冲液与DMF的体积比例为5 : 1，得到载体蛋白BSA/OVA溶液； (3)甲氧节陡完全抗原的制备：将步骤（1)制备的14. 5mg/mL活化的甲氧节陡半抗原 T2溶液lmL，慢速滴加到步骤（2)制备的22mg/mL蛋白BSA溶液3mL及OVA溶液3mL中，室 温下反应24h，用PBS缓冲液透析3天，期间换水8次，即得到甲氧苄啶免疫原T2-GA-BSA及 包被原 T2-GA-0VA。
6.用权利要求2、3、4或5所述方法制备的甲氧苄啶完全抗原的应用，其特征在于：通 过甲氧苄啶完全抗原免疫得到多克隆抗体和/或单克隆抗体，用于检测甲氧苄啶。
【文档编号】C07K1/107GK104341357SQ201410510573
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】匡华, 徐乃丰, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学