专利名称：新的kf－1040物质和制备该物质的方法
技术领域：
本发明涉及具有脂代谢抑制活性的新的KF-1040物质以及制备该物质的方法。
现有技术若干抗肥胖药物和治疗高脂血症的药物已经是公知的。例如，作用于中枢神经系统的食欲抑制剂抑制食欲而减少脂质合成，然而由于它降低食欲而可能对健康是有害的。因此，期望研制出一种新的无副作用的抗肥胖药物或治疗高脂血症的药物。
另一方面，近来已经研究清楚构成生物膜脂类之一的鞘磷脂的水解涉及由细胞因子，例如白介素1β或肿瘤坏死因子α[Y.A.Hannun,生物化学杂志，(J.Biol.Chem.)269,3125-3128(1994)和R.Kolesnick和D.W.Golde，细胞(Cell),77,325-328(1994)]介导的胞内信号转导，和T细胞激活基础上的胞内信号转导[L.M.Boucher等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)18,2059-2068(1995)和A.Ochi(越智厚雄)，医学免疫学(Medical Immunol.)28,397-401(1994)]，并且其在例如动脉硬化、炎症、血栓等疾病以及涉及这些疾病的免疫调节机制中发挥作用。然而，在实践中从鞘磷脂酶(一种鞘磷脂的水解酶)的特异性和强效抑制剂的观点上，还未曾研制出用于该类疾病的任何预防或治疗药物。
发明目的近年来，与生活方式有关的疾病患者人群的增加给治疗和预防医学领域带来大量问题。特别是，基于近来营养过量饮食习惯的三酰基甘油蓄积引起的肥胖和高脂血症类疾病常会导致更严重的疾病，例如动脉硬化、脂肪肝、高血压、冠心病、中风、胆囊疾病、骨关节炎、呼吸问题和某些类型的癌症。
肥胖指主要由甘油三酯构成的储藏脂肪在体内过量堆积的物理状态，其归因于三酰基甘油的增量合成，导致脂肪在脂肪组织中异常性堆积。还认为三酰基甘油血症由三酰基甘油在肠和肝中合成亢进引发，并因此导致伴随血液中高浓度三酰基甘油的脂蛋白血症。因此，推测对涉及三酰基甘油选择性合成的二酰基甘油酰基转移酶表现抑制作用的任何物质可能具有抑制三酰基甘油在脂肪组织和血液中蓄积的能力，并可能对治疗上述疾病有效。
在这种情况下，认为值得在肥胖和高脂血症以及例如动脉硬化等来源于它们的退化性疾病的治疗中，提供一种具有抑制二酰基甘油∶酰基转移酶活性的物质。
另外，还期望具有抑制导致鞘磷脂(一种生物膜构成脂类)水解的鞘磷脂酶活性的物质，可以用作抗动脉硬化、抗血栓和抗炎的药物，以及用作基于迄今为止未曾发现的新的功能性机制的免疫抑制剂的药物。
技术方案本发明人对于微生物产生的代谢产物进行了研究，发现在培养海草中分离出的一种新鉴定的真菌菌株KF-1040的培养基中产生了具有抑制二酰基甘油酰基转移酶和鞘磷脂酶活性的物质。然后从上述培养基中分离并纯化出上述能够抑制脂代谢的活性物质，并基于此确定了它们的化学结构，化学结构由下面给出的式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示。式(Ⅰ)和(Ⅱ)代表的物质未曾公开，因此本发明人将它们分别命名为“KF-1040物质A”和“KF-1040物质B”，它们被总称为“KF-1040物质”。
基于上述认识完成了本发明，本发明涉及KF-1040物质，它包括下列式(Ⅰ)代表的KF-1040物质A 和下列式(Ⅱ)代表了KF-1040物质B 本发明进一步涉及制备新的KF-1040物质的方法，包括培养属于胶霉属(粘帚霉属，Gliocladium)并具有在培养基中产生KF-1040物质A和/或KF-1040物质B能力的微生物，使产生的KF-1040物质A和/或KF-1040物质B在培养基中累积，和从培养基中分离KF-1040物质A和/或KF-1040物质B。
本发明还涉及制备KF-1040物质的方法，其中属于胶霉属并具有产生KF-1040物质A和/或KF-1040物质B能力的微生物是胶霉sp.KF-1040(Gliocladium sp.KF-1040，FERM BP-6251)。本发明进一步涉及属于胶霉属并具有产生KF-1040物质A和/或KF-1040物质B能力的微生物。
具有产生由式(Ⅰ)和(Ⅱ)代表的KF-1040物质能力的微生物(在下文中称为“KF-1040物质生产真菌”)属于胶霉属，例如本发明人分离出来的真菌菌株胶霉sp.KF-1040是一个最有效地适用于本发明的例子。该生产菌KF-1040的分类学特征如下1．形态学特征该菌株在含50％海水(盐浓度为3.4％)的培养基，例如土豆葡萄糖琼脂、玉米粉琼脂、麦芽提取液琼脂、三浦琼脂和海水淀粉琼脂等培养基中生长相对较好，分生孢子的着生也良好。
玉米粉琼脂培养基上生长的菌落在显微镜下观察表明，菌丝是透明的并有隔膜。分生孢子呈毛笔状(penicillate)和轮状(verticillate)。毛笔状分生孢子(长度为100-200μm)直立或从基部菌丝分支，在顶端或在分支处形成若干大小为2.5-3.0μm×10-23μm的毛笔状轮生瓶梗，其上形成分生孢子块。
另一方面，轮状分生孢子(长度为25-50μm)从基部菌丝向上直立，在顶端或在分支瓶梗处形成大小为3.0-5.0μm×17-25μm的拉长的长颈瓶状或向上收敛的圆锥状物，其上形成单一分生孢子块。对于毛笔状分生孢子，分生孢子无色，形状为椭球形或拉长的椭球形，大小为2.5-3.0μm×3.0-5.0μm，其末断较少有尖锐顶端。对于轮状分生孢子，分生孢子无色，形状为椭球形或拉长的椭球形，大小为2.5-3.0μm×6.0-8.5μm。2．各种培养基上的培养学特征所述菌株在25℃培养14天条件下，在各种培养基上培养状况的目视观察结果如下表1所示。表1
3．生理特征(1)最佳生长条件本菌株的最佳生长条件为pH4-8，温度17-27℃,*海水浓度0-50％。
*使用盐浓度为3.4％的天然海水。(2)生长条件菌株的生长范围pH3-10，温度9-32℃,*海水浓度0-200％。
*使用盐浓度为3.4％的天然海水。(3)性质需氧。
按照上面所示的本发明菌株KF-1040的形态学特征、培养状况和生理性质，本发明人将该菌株与已知真菌进行了比较，鉴定它是属于胶霉属的菌株，同时将其命名为胶霉sp.KF-1040。该菌株于1998年2月6日在工业技术院生命工学工业技术研究所保藏，保藏号为FERM P-16629，之后按照布达佩斯条约转换保藏的要求，于1998年2月12日通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(位于日本茨城县筑波市东1丁目，1番3号)由原始保藏再次保藏，受理号为FERM BP-6251。
作为本发明应用的KF-1040物质生产真菌，上述胶霉sp.KF-1040菌株是一个例举，还包括属于胶霉属并且生产由前面给出的式(Ⅰ)和(Ⅱ)所代表的KF-1040物质(下文中只要没有具体说明，应完整地理解为“KF-1040物质”)的任何菌株，包括自然突变体，X-射线和紫外线照射得到的人工突变体和通过例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和2-氨基嘌呤突变处理得到的人工突变体，融合菌株和基因操作菌株。
在本发明的实际应用中，属于胶霉属的KF-1040物质生产真菌在培养基中培养。作为适于生产KF-1040物质的营养源，应用含微生物可同化碳源、微生物可同化氮源，以及如果需要，包括无机盐和维生素等添加剂的营养培养基。作为碳源，可以单独或组合加入糖类，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、糊精和淀粉，以及植物油，例如大豆油等。
作为氮源，可以单独或组合应用蛋白胨、酵母提取物、肉汤提取物、大豆粉、棉子粉、玉米浸提液、麦芽提取物、酪蛋白、氨基酸、脲、铵盐和硝酸盐等。另外，必要时可以加入盐例如磷酸盐、镁盐、钙盐、钠盐和钾盐和重金属盐例如铁盐、锰盐、铜盐、钴盐和锌盐等，维生素和适于生产KF-1040物质的其它物质。
对于培养，当遇到严重的起泡现象，如果需要可以加入消泡剂，例如，液体石蜡、动物油、植物油、硅酮和表面活性剂等。培养优选在液体培养基中进行，不过液体和固体培养基均可使用，只要含有上面列出的营养源。在小规模生产中，摇瓶培养即可满意。对于工业化生产大量目的物质，优选通气搅拌培养，如同在其它发酵产品中应用的一样。
在大罐中培养的情况下，优选按照如下方式进行，即首先将生产真菌接种到相对较小量的培养基中培养，以避免真菌生长延迟，然后将培养混合物转移到大罐中，以实现生产培养。其中，用于预培养和生产培养的培养基组合物可以彼此相同也可以不同。如果需要，可以改变用于预培养和生产培养的培养基组合物。
在通气搅拌条件下进行培养的情况下，可以应用相关方法中的通过涡轮或其它方式的机械搅拌，发酵罐的旋转或振摇、抽吸振荡和鼓气泡等方法。通气的空气应灭菌后通入。
培养温度可以在KF-1040物质生产真菌能够生产KF-1040物质的范围内充分调整，通常在20-30℃温度范围内，优选在27℃左右进行培养。通常在pH5-8，优选pH7左右进行培养。培养时间可以按照每种具体培养条件改变，通常为10-20天。
以这种方式生产的KF-1040物质存在于其菌丝体和培养物滤液中。为了从培养的生物体中纯化KF-1040物质，用水混溶性有机溶剂，例如丙酮对全部培养生物体进行提取，对提取物进行真空蒸发，除去有机溶剂，然后，用与水不混溶有机溶剂例如乙酸乙酯提取得到的残留物。
除了上述提取方法，用于纯化脂溶性物质的已知操作，例如，吸附色谱、凝胶过滤色谱、薄层色谱、离心逆流分布色谱、高效液相色谱可以适当组合或循环应用，以使KF-1040物质分离成单一成分物质，并纯化它们。
本发明的KF-1040物质A的物化性质如下1)性状白色粉末2)分子量776(快原子轰击质谱)3)分子式C40H72O144)比旋光度[α]D25=+62°(c=0.1，在甲醇中)5)紫外极大吸收(在甲醇中)
图1,203nm(ε=24900),220nm(ε=18000),275nm(ε=1200)6)红外极大吸收(KBr压片)图2,1637cm-1和3434cm-17)质子NMR图谱(重氢甲醇)如图3所示8)13C-NMR图谱(重氢甲醇)如图4所示9)溶剂中的溶解性可溶于甲醇、苯、氯仿和乙酸乙酯；难溶于水和己烷10)颜色反应硫酸和磷钼酸反应阳性11)酸碱性中性在考察上面给出的KF-1040物质A的物化性质、光谱分析数据后，确定KF-1040物质A的化学结构如下列结构式(Ⅰ)表示
本发明的KF-1040物质B的物化性质如下1)性状白色粉末2)分子量818(快原子轰击质谱)3)分子式C42H74O154)比旋光度[α]D25=+120°(c=0.1，在甲醇中)5)紫外极大吸收(在甲醇中)图5,204nm(ε=43000),218nm(ε=30300),272nm(ε=2900)6)红外级大吸收(KBr压片)图6,1633cm-1和3417cm-17)质子NMR图谱(重氢甲醇)如图7所示8)13C-NMR图谱(重氢甲醇)如图8所示9)溶剂中的溶解性可溶于甲醇、苯、氯仿和乙酸乙酯；难溶于水和己烷10)颜色反应硫酸和磷钼酸反应阳性11)酸碱性中性在考察上面给出的KF-1040物质B的物化性质、光谱分析数据后，确定KF-1040物质B的化学结构如下列结构式(Ⅱ)表示 既然上面的描述涉及KF-1040物质A和KF-1040物质B的各种详细物化性质，发现尚未有文献报道具有对应上面鉴定特征性质的任何化合物。因此，确定KF-1040物质是新物质。
下面讨论KF-1040物质A和KF-1040物质B的生物学性质。
(1)对来源于大鼠的二酰基甘油∶酰基转移酶的抑制作用通过部分修正的Mayorek和Bar-Tana法[生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260:6528-6532(1985)]确定二酰基甘油∶酰基转移酶的活性。
基于此，由大鼠肝制备的微粒体碎片用作酶源。向含有8mMMgCl2、1mg/ml牛血清白蛋白和2.5mM氟磷酸二异丙酯的175mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中加入0.75mM二油酰甘油和30μM[1-14C]-棕榈酰-CoA(0.02μCi)，总体积调整到200μl，然后，将酶反应混合物在23℃保温15分钟。用氯仿/甲醇(1/2)混合液提取总脂，然后用TLC(应用Kieselgel GF254,80/20/1的石油醚/二乙醚/乙酸做展开剂)分离各脂成分，随后利用RI辐射扫描仪(RADIOSCANNER,AMBIS System Inc.)确定三酰基甘油组分的放射性，以确定二酰基甘油∶酰基转移酶的活性。
计算相应于抑制50％酶的药物浓度，得出KF-1040物质A的值为16μg/ml,KF-1040物质B的值为9.0μg/ml。
(2)对在人源细胞(来源于人Burkitt淋巴瘤的Raji细胞)中形成三酰基甘油的抑制作用按照Tomada(供田)等[生物化学杂志(J.Biol.Chem.),266:4214-4219(1991)]的方法，利用人源细胞(来源于人伯基特淋巴瘤的Raji细胞)，评价上述物质对三酰基甘油形成的影响。
将含有[1-14C]-油酸(0.02μCi)，浓度为2.7×106个细胞/毫升的Raji细胞分散液，填补到总体积为200μl，然后在37℃反应30分钟。用氯仿/甲醇(2/1)混合物提取总脂。然后按照上述实验(1)“对来源于大鼠的二酰基甘油∶酰基转移酶的抑制作用”的同样方式进行随后的步骤。
计算相应于50％抑制三酰基甘油形成的药物浓度，得出KF-1040物质A的值为10μg/ml,KF-1040物质B的值为10μg/ml。
(3)对大鼠脑来源的中性鞘磷脂酶的抑制作用按照修正的Murakami和Arima法[神经化学杂志(J.Neurochem.),52,611-618,(1989)]，评价上述物质对来源于大鼠脑的中性鞘磷脂酶的影响。
基于此，将由大鼠脑制备的膜组分用作酶源，向其中加入20mMHEPES-NaOH缓冲液(pH7.4)、6.5mM MgCl2、0.1％Triton X-100和25μM[N-甲基-3H]-鞘磷脂(0.006μCi)，将混合物总体积补充到50μl。37℃反应30分钟后，向反应混合物中加入200μ1氯仿/甲醇混合物(1/2体积比)，以使反应产物[3H]-磷酸胆碱从起始材料[3H]-鞘磷脂中分离出来。将上清液层50μl提取到小瓶中。通过液体闪烁计数器定量测定[3H]-磷酸胆碱的量，以评价中性鞘磷脂酶的活性。
计算相应于50％抑制该酶的KF-1040物质的浓度，得出KF-1040物质A的值为4.2μg/ml,KF-1040物质B为6.1μg/m1。
(4)对来源于人胎盘的酸性鞘磷脂酶的影响按照经部分调整的Jones等的方法[生化杂志(Biochem.Journal),195,373-382(1981)]，评价上述物质对来源于人胎盘的酸性鞘磷脂酶的影响。
基于此，来源于人胎盘的酸性鞘磷脂酶(Sigma公司产品)用作酶源，向其中加入250mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)、0.1％NP-40(Sigma公司)、25μM[N-甲基-3H]-鞘磷脂(0.006μCi)和各种浓度的上述物质，将混合物总体积补充到50μl。37℃反应30分钟后，向反应混合物中加入200μl氯仿/甲醇混合物(2/1体积比)，以使反应产物[3H]-磷酸胆碱从起始材料[3H]-鞘磷脂中分离出来。将上清液层50μl提取到小瓶中。通过液体闪烁计数器定量测定[3H]-磷酸胆碱的量，以评价酸性鞘磷脂酶的活性。
计算相应于50％抑制该酶的KF-1040物质的浓度，得出KF-1040物质A的值为48μg/ml,KF-1040物质B为24μg/ml。
如上所述，本发明的新物质表现抑制二酰基甘油∶酰基转移酶和鞘磷脂酶的活性，因此，可用于预防和治疗关于动脉硬化、肥胖、血栓、炎症和免疫功能紊乱类疾病的患者。
附图简述图1显示本发明的KF-1040物质A的紫外吸收光谱(甲醇中)。
图2显示本发明的KF-1040物质A的红外吸收光谱(KBr压片)。
图3显示本发明的KF-1040物质A的质子NMR图谱(在重甲醇中)。
图4显示本发明的KF-1040物质A的13C-NMR图谱(在重甲醇中)。
图5显示本发明的KF-1040物质B的紫外吸收光谱(甲醇中)。
图6显示本发明的KF-1040物质B的红外吸收光谱(KBr压片)。
图7显示本发明的KF-1040物质B的质子NMR图谱(在重甲醇中)。
图8显示本发明的KF-1040物质B的13C-NMR图谱(在重甲醇中)。
得到的培养基用作培养种子。60个容量为1000ml的Roux摇瓶装入溶解有100g/l土豆和1.0％葡萄糖的50％天然海水制备得到的300ml液体培养基(pH6.0)。灭菌放凉后，将3ml培养种子在无菌条件下接种到各摇瓶中，然后将接种混合物在静止状态于27℃培养16天。
向总培养液中加入18升丙酮，充分搅拌，然后减压浓缩，用乙酸乙酯提取浓缩液体。减压浓缩提取层，由此获得2.2克粗产品。将该粗产品溶解于少量乙腈，然后将得到的溶液过30％乙腈水溶液填充的ODS柱(200g，由Senshu科学公司提供，ODS-SS-1020T)。用50％乙腈水溶液冲洗柱后，用60％乙腈水溶液然后用70％乙腈水溶液洗脱柱。通过减压浓缩从洗脱液中得到87mg物质A和104mg物质B的粗产品。
每种粗产品经高效液相色谱(Shiseido Capsulepack,ODS-SG柱，20mm×250mm，流速=6.0ml/min；检测应用70％乙腈水洗脱液于215nm UV)分离。分别收集保留时间为17分钟的物质A的洗脱组分，和保留时间为23分钟的物质B的洗脱组分。通过除去有机溶剂并用乙酸乙酯提取水层处理各组分，由此得到16mg KF-1040物质A和40mg KF-1040物质B。
本发明的效果如上面的详细描述，本发明的新的KF-1040物质表现二酰基甘油酰基转移酶和鞘磷脂酶抑制活性，因此预期可用于预防和治疗有关动脉硬化、肥胖、血栓、炎症和免疫功能紊乱类疾病患者。
权利要求
1．新的KF-1040物质，包括由下列式(Ⅰ)表示的KF-1040物质A，即， 和由下列式(Ⅱ)表示的KF-1040物质B，即
2．一种制备新的KF-1040物质的方法，特征在于培养属于胶霉属并具有在培养基中产生KF-1040物质A和/或KF-1040物质B能力的微生物，使产生的KF-1040物质A和/或KF-1040物质B在培养基中累积，和从培养基中收获KF-1040物质A和/或KF-1040物质B。
3．如权利要求2的方法，其中属于胶霉属并具有产生KF-1040物质A和/或KF-1040物质B能力的微生物是胶霉sp.KF-1040(FERMBP-6251)。
4．一种属于胶霉属并具有产生KF-1040物质A和/或KF-1040物质B能力的微生物。
全文摘要
制备式(Ⅰ)代表的物质KF－1040A和式(Ⅱ)代表的另一种物质KF－1040B的方法,包括培养能够生产物质KF－1040A和KF－1040B的微生物,从而在液体培养基中累积这些KF－1040A和/或KF－1040B,并从培养基中收获它们。由于它们具有抑制二酰基甘油转移酶和鞘磷脂酶的活性,上述物质用于预防和治疗动脉硬化、肥胖、血栓、炎症和免疫功能相关疾病。
文档编号C07H15/10GK1286692SQ98813172
公开日2001年3月7日 申请日期1998年2月16日 优先权日1998年2月16日
发明者大村智, 供田洋, 增间碌郎 申请人:社团法人北里研究所