专利名称：黄芪均多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中药技术领域的制备方法，特别涉及一种黄芪均多糖的制 备方法。
背景技术：
多糖是一类天然高分子化合物，是由醛糖或酮糖通过甙键连接在一起的多聚
物。自上世纪70年代发现多糖及糖复合物参与细胞的各种生命现象的调节以来，
人们不断发现多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血等
多种生物活性。并且由于多糖没有明显的毒副作用，对多糖生物资源的开发利用
和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。
黄底为豆科植物膜荚黄萬Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.或蒙古黄
贫Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge) Hsiao的干
燥根，素以"补气诸药之最"著称，是一种常用的扶正中药。性味甘、微温，
归脾、肺经，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。黄芪含有多糖、
蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、苷类、微量元素等多种生物活性物质，其中
黄芪多糖(Astragaluspolysaccharides, APS)是黄芪主要的生物活性成分之一，
具有免疫调节、降血糖、抗肿瘤、促进骨髓造血干细胞增殖和双向调节血糖等作用。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利CN101020721A公布了一种制备高 纯度粗黄芪多糖的方法，恒温微波提取后离心，上清液活性炭脱色，醇沉，凝胶 过滤层析即得；中国专利CN101029086 A则公布了一种联合应用微波提取、微 滤、超滤和醇沉技术来制备黄芪多糖的方法。尚未进一步发现分子量明确、多糖 组成清楚的黄芪均多糖制备方法的公开文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种黄芪均多糖的制备方法。 本发明的方法得到的多糖平均分子量约为9000，完全酸水解后只含有葡萄糖一种单糖单元；本发明的方法简单快速，成本低廉。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤 步骤一，取黄芪粗粉，用3倍量体积分数的乙醇回流脱脂1.5h，其中乙醇为 体积分数为95%的乙醇；过滤，药渣中加入为药渣6 12倍量体积分数的水回流
提取90min，过滤，重复提取2次，合并滤液；
步骤二，取滤液，浓縮至滤液体积的1/5 1/10，得到浓縮液，在浓縮液中 加入体积分数为95%的乙醇，搅拌，直至溶液中的乙醇的体积分数为50% 80%， 沉淀，静置过夜，离心或过滤，收集沉淀物，洗涤，6(TC真空干燥，即得黄芪粗 多糖；
步骤三，利用步骤二得到的黄茛粗多糖制备20g丄"的黄芪粗多糖水溶液，
按照黄芪粗多糖与胃蛋白酶的摩尔比为1: 1 1: 5的比例向黄芪粗多糖水溶液
中加入胃蛋白酶，37。C下酶解3 7小时，煮沸10min，离心，得到上清液；
步骤四，按上清液与Sevage试剂体积比为4: 1 6: 1的比例，在上清液中加 入Sevage试剂，其中Sevage试剂具体为氯仿与正丁醇按体积比为4: 1配制 而成；振摇萃取，离心并收集上层水相溶液，重复操作3 6次；
步骤五，在步骤四得到的水相溶液中加入二乙氨基乙基纤维素，使二乙氨基 乙基在水相溶液中的重量百分比为0.5% 1.5%,煮沸10 20min，过滤，得到 滤液，将滤液浓縮至步骤三中的黄芪粗多糖水溶液体积的1/10，浓缩液用截流分 子量为3000的透析袋进行透析，透析3d，在透析后的溶液中加入体积分数为95% 的乙醇，直至溶液中乙醇的体积分数为80%，沉淀，静置过夜，离心或过滤，收 集沉淀物，洗涤，6(TC真空干燥，即得精制黄芪多糖；
步骤六，取精制黄芪多糖，超声水溶解，二乙氨基乙基弱阴性离子交换柱层 析分离，去离子水洗脱，流速为0.8 1.2mL，min—、苯酚硫酸法检测，合并490 nm 处有吸收的部分，浓缩，冷冻干燥，得到白色固体物；
步骤七，将步骤六中得到的白色固体物加水溶解，经凝胶柱层析纯化分离， 去离子水洗脱，流速为8 10 mL，h—1， HPLC-ELSD监测，根据液相图谱合并保 留时间最长的对称峰部分，浓缩，冷冻干燥，即得黄疾均多糖。
步骤二和步骤五中，所述洗涤为，先用无水乙醇洗一次，再用丙酮洗一次， 重复两次。步骤三中，所述胃蛋白酶酶活力^1200U/g。 所述柱层析用水为去离子水。
本发明中，将黄芪粗粉经乙醇回流脱脂后，加水回流提取，在水提取浓縮液 中加入乙醇，沉淀，过滤，收集沉淀，干燥，得到黄芪粗多糖；粗多糖经除蛋白、 脱色素、透析脱盐处理后，经二乙氨基乙基(DEAE)弱阴离子交换树脂柱层析
分离，去离子水洗脱，根据苯酚-硫酸法检测结果，合并洗脱液，浓縮、冷冻干 燥得到黄芪多糖，然后用水溶解，经凝胶柱层析分离纯化，去离子水洗脱，用
HPLC-ELSD (高效液相色谱-蒸发光散射检测)监测，合并保留时间最长的呈单 一对称峰的部分，即得黄芪均多糖。
本发明具有如下的有益效果本发明的方法得到的多糖平均分子量约为 9000，完全酸水解后只含有葡萄糖一种单糖单元；本发明的方法简单快速，成本 低廉。
图1为所得到的黄芪均多糖的HPLC图谱。
具体实施例方式
以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案
为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于
下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，
或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中，弱阴离子交换树脂可为英国Whatman公司生产的DEAE
Cellulose,美国GE Healthcare Bio-Science AB公司生产的DEAE Sepharose Fast
Flow,或瑞典Pharmacia公司生产的DEAE Sephadex A-50。
凝胶柱层析填料可为美国GE Healthcare Bio-Science AB公司生产的 Sephacryl S-200或者Sephadex G-150,或者瑞典Pharmacia公司生产的Superose 12 PG。
实施例1
取黄芪药材粗粉500g，加入1500mL95。/。乙醇(v/v)回流脱脂1.5h，过滤， 残渣中加入3000 mL水回流提取三次，每次90 min。提取液趁热过滤，合并滤 液，减压浓縮至1800mL。 4°。下向浓縮液中加入95%乙醇(v/v)，搅拌，调节溶液中乙醇的浓度为50% (v/v)，静置过夜。离心，收集沉淀，先用无水乙醇洗一 次，再用丙酮洗一次，重复两次，6(TC真空干燥，得棕黄色粉末状黄芪粗多糖 25g，提取得率为5%。
取粗多糖20 g配制成20g丄—i水溶液1000 mL，加入胃蛋白酶20g， 37'C下 酶解3h，煮沸10min使多余蛋白酶变性沉出，离心除去。在所得到的上清溶液 中加入Sevage试剂(氯仿正丁醇的体积比=4: 1) 250 mL，振摇萃取，离心， 收集上层水相溶液，重复该过程3次。向上层水相溶液中加入5g DEAE (二乙 氨基乙基)纤维素至DEAE的重量百分数为0.5%,煮沸10min，过滤，除去纤 维素，滤液浓缩至约100mL。浓缩液用截流分子量为3000的透析袋进行透析， 共3d。在透析后的溶液中加入95% (v/v)乙醇溶液，调节溶液中的乙醇浓度为 80% (v/v)进行沉淀；静置过夜，离心或过滤，收集沉淀物，无水乙醇、丙酮交 替洗涤两次，6(TC真空干燥，得精制黄芪多糖2.4g，得率为6%。。
取0.5g精制黄芪多糖超声水溶解，进行DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子 交换柱层析，去离子水洗脱，流速为0.8mlrmin";苯酚硫酸法检测，合并490 nm 处有吸收部分，浓缩，冷冻干燥，得到白色粉末状黄芪多糖85mg。将黄芪多糖 水溶后经Sephacryl S-200凝胶柱层析纯化分离，去离子水洗脱，流速为8 mL七—1， 收集水洗脱液，HPLC-ELSD监测，合并保留时间最长的单一对称峰部分，浓縮， 冷冻干燥，即得白色黄芪多糖34mg，最终得率为0.41%。。
所得黄芪多糖经HPLC-ELSD HPGPC法测定，平均分子量为9000; 5 mL 1 mol丄"H2S04 100'C下水浴封管水解6h后，用纸层层析与标准品进行对照的方法 检査，水解液中只含有D-葡萄糖，表明该黄芪多糖只由葡萄糖组成，为均多糖。
黄芪均多糖的分子量测定和完全酸水解多糖组成的测定方法为
分子量测定以Sigma-AldichDextran Standard 5000、 12000、 25000、 50000、 80000作为标准品做标准曲线，采用HPLC-ELSD HPGPC (高效凝胶渗透色谱) 法测定多糖分子量，得其平均分子量为9000;
多糖组成的确定5mg精制多糖溶解于5mLl moH^硫酸溶液中，100'C 水浴下封管水解6h;碳酸钡中和，离心，上清液进行纸层层析分析，以D-葡萄 糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖作为对照，乙酸乙 酯-吡啶-醋酸-水(体积比为，5:5:1:3)为展开剂展开，取出晾干，喷以苯胺-邻苯二甲酸溶液显色，结果多糖水解液仅在与D-葡萄糖Rf值一致的地方出现相应 色点，表明该多糖由D-葡萄糖组成。 实施例2
取黄芪药材粗粉500g，加入1500mL95。/。乙醇(v/v)回流脱脂1.5h,过滤， 残渣中加入4500mL水回流提取三次，每次90min。提取液趁热过滤，合并滤液， 减压浓縮至1800mL。 4'C下向浓縮液中加入95。/。乙醇(v/v)，搅拌，调节溶液醇 浓度为65。/。(v/v)，静置过夜。离心，收集沉淀，无水乙醇、丙酮交替洗涤两次， 6CTC真空干燥，得棕黄色粉末状黄芪粗多糖50g，提取得率为10%。
取粗多糖20g配制成20 g1—1水溶液lOOOmL，加入胃蛋白酶60g (m/m)， 37。C下酶解5h，煮沸10min使多余蛋白酶变性沉出，离心除去。在所得到的上 清溶液中加入Sevage试剂(氯仿正丁醇的体积比=4: 1) 200mL，振摇萃取， 离心，收集上层水相溶液。重复该过程4次。向上层水相溶液中加入10gDEAE 纤维素至重量百分浓度为1.0%，煮沸15min，过滤除去纤维素，滤液浓縮至约 100 mL。浓縮液用截流分子量为3000的透析袋进行透析，共3d。在透析后的溶 液中加入95% (v/v)乙醇溶液，调节溶液醇浓度为80% (v/v)进行沉淀；静置 过夜，离心或过滤，收集沉淀物，无水乙醇、丙酮交替洗涤两次，60'C真空干燥， 即得精制黄芪多糖1.8g，得率为9%。。
取0.5g黄芪精制多糖超声水溶解，进行DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子 交换柱层析，去离子水洗脱，流速为l.Omlymin—'。苯酚硫酸法检测，合并490 nm 处有吸收部分，浓縮，冷冻干燥，得到白色粉末状黄芪多糖90mg。将黄芪多糖 水溶后经Sephacryl S-200凝胶柱层析纯化分离，去离子水洗脱，流速为9 mL七—、 收集水洗脱液,HPLC-ELSD监测，合并保留时间最长的单一对称峰部分，浓縮， 冷冻干燥，即得白色黄芪多糖37mg，得率为0.67Q;。
所得黄芪多糖经HPLC-ELSD HPGPC法测定，平均分子量为卯00; 5 mL 1 mol丄"H2S04 10(TC下水浴封管水解6h后，用纸层层析与标准品进行对照的方法 检査，水解液中只含有D-葡萄糖，表明该黄芪多糖只由葡萄糖组成，为均多糖。
实施例3
8取黄芪药材粗粉500g，加入1500mL95。/。乙醇(v/v)回流脱脂1.5h，过滤, 残渣中加入6000mL水回流提取三次，每次90min。提取液趁热过滤，合并滤液， 减压浓縮至1800mL。 4 °〇下向浓縮液中加入95%乙醇(v/v)，搅拌，调节溶液 醇浓度为80%，静置过夜。离心，收集沉淀，无水乙醇、丙酮交替洗涤两次，60 C真空干燥，得棕黄色粉末状黄芪粗多糖75 g，得率为15%。
取粗多糖20g配制成20 g丄—1水溶液1000mL，加入胃蛋白酶100g， 37°〇下 酶解6h，煮沸lOmin使多余蛋白酶变性沉出，离心除去。在所得到的上清溶液 中加入Sevage试剂(氯仿正丁醇的体积比=4: 1) 150mL，混合物剧烈振摇20 30min，离心，收集上层水相溶液。重复该过程6次。在上层水相溶液中加入15 gDEAE纤维素至重量百分浓度为1.5%，煮沸10min，过滤除去纤维素，滤液浓 缩至约100mL。浓縮液用截流分子量为3000的透析袋进行透析，共3d。向透析 后的溶液中加入95% (v/v)乙醇溶液，调节溶液醇浓度为80% (v/v)进行沉淀； 静置过夜，离心或过滤，收集沉淀物，无水乙醇、丙酮交替洗涤两次，6(TC真空 干燥，即得黄芪精制多糖1.5g，精制得率为11%。。
取0.5g黄芪精制多糖超声水溶后通过DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交 换柱层析，用去离子水洗脱，流速为1.2mL，min—1，洗脱8 h。苯酚硫酸法检测， 合并490nm处有吸收部分，浓縮，冷冻干燥，得到白色粉末状黄芪多糖100 mg。 将黄芪多糖水溶后经Sephacryl S-200凝胶柱层析分离，去离子水洗脱，流速为 lOmL七-1，收集水洗脱液，HPLC-ELSD监测，合并保留时间最长的单一对称峰 部分，浓縮，冷冻干燥，即得白色黄芪多糖40mg，得率为0.9%。。
所得黄芪多糖经HPLC-ELSD HPGPC法测定，平均分子量为9000; 5 mL 1 mol'i;1 H2S04 10(TC下水浴封管水解6h后，用纸层层析与标准品进行对照的方 法检査,水解液中只含有D-葡萄糖，表明该黄芪多糖只由葡萄糖组成，为均多糖。
实施例4
本实例步骤同实施例3，，不同之处在于，其中的DEAE弱阴离子交换柱填 料为DEAE Cellulose,凝胶色谱填料为Sephacryl S-200 。最终得白色黄芪均多糖 37mg，得率0.84%0。
实施例5
9本实例步骤同实施例3，，不同之处在于，其中的DEAE弱阴离子交换柱填 料为DEAE Sepharose Fast Flow,凝胶色谱填料为Superose 12 PG,最终得白色 黄芪均多糖41mg，得率0.91%。。
实施例6
本实例步骤同实施例3，，不同之处在于，其中的DEAE弱阴离子交换柱填 料为DEAE Sephadex A-50，凝胶色谱填料为Sephadex G-150，最终得白色黄芪 均多糖42mg，得率0.95%。。
权利要求
1、一种黄芪均多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，取黄芪粗粉，用3倍量体积分数的乙醇回流脱脂1.5h，其中乙醇为体积分数为95％的乙醇；过滤，药渣中加入为药渣6～12倍量体积分数的水回流提取90min，过滤，重复提取2次，合并滤液；步骤二，取滤液，浓缩至滤液体积的1/5～1/10，得到浓缩液，在浓缩液中加入体积分数为95％的乙醇，搅拌，直至溶液中的乙醇的体积分数为50％～80％，沉淀，静置过夜，离心或过滤，收集沉淀物，洗涤，60℃真空干燥，即得黄芪粗多糖；步骤三，利用步骤二得到的黄芪粗多糖制备20g·L-1的黄芪粗多糖水溶液，按照黄芪粗多糖与胃蛋白酶的摩尔比为1∶1～1∶5的比例向黄芪粗多糖水溶液中加入胃蛋白酶，37℃下酶解3～7小时，煮沸10min，离心，得到上清液；步骤四，按上清液与Sevage试剂体积比为4∶1～6∶1的比例，在上清液中加入Sevage试剂，其中Sevage试剂具体为氯仿与正丁醇按体积比为4∶1配制而成；振摇萃取，离心并收集上层水相溶液，重复操作3～6次；步骤五，在步骤四得到的水相溶液中加入二乙氨基乙基纤维素，使二乙氨基乙基在水相溶液中的重量百分比为0.5％～1.5％，煮沸10～20min，过滤，得到滤液，将滤液浓缩至步骤三中的黄芪粗多糖水溶液体积的1/10，浓缩液用截流分子量为3000的透析袋进行透析，透析3d，在透析后的溶液中加入体积分数为95％的乙醇，直至溶液中乙醇的体积分数为80％，沉淀，静置过夜，离心或过滤，收集沉淀物，洗涤，60℃真空干燥，即得精制黄芪多糖；步骤六，取精制黄芪多糖，超声水溶解，二乙氨基乙基弱阴性离子交换柱层析分离，去离子水洗脱，流速为0.8～1.2mL·min-1，苯酚硫酸法检测，合并490nm处有吸收的部分，浓缩，冷冻干燥，得到白色固体物；步骤七，将步骤六中得到的白色固体物加水溶解，经凝胶柱层析纯化分离，去离子水洗脱，流速为8～10mL·h-1，HPLC-ELSD监测，根据液相图谱合并保留时间最长的对称峰部分，浓缩，冷冻干燥，即得黄芪均多糖。
2、 根据权利要求1所述的黄芪均多糖的制备方法，其特征是，步骤二和步 骤五中，所述洗涤为，先用无水乙醇洗一次，再用丙酮洗一次，重复两次。
3、 根据权利要求1所述的黄芪均多糖的制备方法，其特征是，步骤三中， 所述胃蛋白酶酶活力》1200U/g 。
4、 根据权利要求1所述的黄芪均多糖的制备方法，其特征是，所述柱层析 的用水为去离子水。
全文摘要
一种中药技术领域的黄芪均多糖的制备方法，包括如下步骤取黄芪粗粉，回流脱脂，过滤，再加水回流提取，浓缩，沉淀，离心或过滤，收集沉淀物，洗涤，真空干燥，即得黄芪粗多糖；黄芪粗多糖水溶液，加入胃蛋白酶酶解，煮沸，离心，得上清液，加入Sevage试剂，振摇萃取，收集上层水相溶液，加入二乙氨基乙基纤维素，过滤，浓缩，透析，沉淀，离心或过滤，洗涤，干燥，得精制黄芪多糖；精制多糖经两次柱层析分离纯化，水洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得黄芪均多糖。本发明得到的多糖平均分子量约为9000，完全酸水解后只含有葡萄糖单糖单元。
文档编号C08B37/00GK101555290SQ20091005077
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者牟鲁霞, 伟 贾, 赵爱华 申请人:上海交通大学