本发明涉及一种具有蛋白转录因子转录调控域与蛋白转导域的融合蛋白，以及一种含有该物质的转录因子功能抑制剂。
背景技术：
转录因子是一种用于控制基因转录的组分，它可通过与DNA中特定序列的结合或与其他因子的结合而调节转录活性。如果这种结合或相互作用未正确进行，有可能引发与转录因子的失常或缺陷有关的各种疾病。
在1998年，首次报导了蛋白转导域(Protein Transduction Domain:PTD)的特性，即部分HIV-TAT蛋白质可有助于将生物反应调节剂输送到细胞内。迄今已发现约50种不同的蛋白转导域，且Tat、VP22、Antp HP4和Hph-1已时常用于基础和治疗研究。已证明，这些PTD可有效地将大于120kDa的蛋白质在短时间内输送到细胞内，且DNA/RNA或无法送达的化合物可通过蛋白转导域而被转导到细胞内。蛋白转导域是一种新颖的药物输送系统，用于促进生物反应调节剂跨越BBB(Blood Brain Barrier，血脑屏障)通过细胞内传递被输送到脑内，或通过诸如皮肤、鼻腔或眼部等局部给药途径被输送到体内。
因此，基于如下事实，即转录因子通过其与DNA或其他蛋白质的相互作用而发挥作用，本发明人实现了生成含有部分转录因子和蛋白转导域的融合蛋白。
技术实现要素：
发明目的
本发明旨在提供一种转录因子功能抑制剂，其中含有蛋白转导域与转录因子的转录调控域，以及提供一种用于治疗与转录因子的失常或缺陷有关的疾病的药物组合物，其中含有上述融合蛋白以及药学上可接受的赋形剂。
此外，本发明旨在提供一种用于治疗与人体内转录因子的失常或缺陷有关的疾病的方法，包括给患者服用有效量的含有蛋白转导域与转录因子的转录调控域的融合蛋白。
此外，本发明旨在提供一种含有蛋白转导域与转录因子的转录调控域的融合蛋白，编码该融合蛋白的核酸，含有该核酸的载体，以及包含该载体的宿主细胞。
此外，本发明旨在提供一种用于生成融合蛋白的方法，包括在宿主细胞中表达载体的步骤，且该载体含有编码转录因子的转录调控域的基因以及编码蛋白转导域的基因。
技术方案
在本发明的一实施方式中，“转录调控域”(TMD，Transcription Modulation Domain:interactome)是指转录因子的一部分，这部分转录因子参与到与在转录过程中起重要作用的分子或因子的功能性互动中，这些分子或因子例如，但不限于，DNA、RNA、转录共激活剂、转录抑制因子、增强子结合因子或配体，或这部分转录因子参与到二聚/多聚(dimerization/multimerization)过程或核定位(nuclear localization)中。
在一实施方式中，本发明提供一种转录因子功能抑制剂，该抑制剂包括含有蛋白转导域和转录因子的转录调控域的融合蛋白。进一步地，实施方式中的转录因子从下列集合中选出：RORγt(Retinoic acid-related orphan receptor gammat，维甲酸相关孤儿受体伽马t)、Tbet(T-box 21，T-框21)、GATA-3(GATA binding protein3，GATA结合蛋白3)、FOXP3(Forkhead box P3，叉头框P3)、RORα4(Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4，维甲酸相关孤儿受体阿尔法4)、HIF-1/2α(Hypoxia inducible factor 1/2α，缺氧诱导因子1/2α)、STAT(Signal transducers and activators of transcription，信号转导物和转录激活物)、PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、p53、AP-1、NFκB(nuclear factor kappa-B，核因子卡帕-B)、NKx2.5(NK2transcription factor related,locus 5，NK2转录因子相关，位点5)、FOXO(Forkhead box O，叉头框O)、RELA(v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，v-rel禽网状内皮组织增殖病毒致癌基因同源物A)和Runx(runt-related transcription factor，侏儒相关转录因子)。进一步地，实施方式中的转录因子从下列集合中选出：RORγt(Retinoic acid-related orphan receptor gammat)、Tbet(T-box 21)、GATA-3(GATA binding protein3)和FOXP3(Forkhead box P3)。进一步地，实施方式中的蛋白转导域从下列集合中选出：HP4、Hph-1、Mph-1、Sim-2、Tat、VP22、Antp(Antennapedia，控制触角的基因)、Pep-1(peptide，缩氨酸)、PTD-5、R9(arginine，精氨酸)、7R和CTP(Cytoplasmic transduction peptide，细胞质转导肽)。实施方式中的蛋白转导域可具有序列编号为1的氨基酸序列。实施方式中的转录因子的转录调控域可以是DNA结合结构域或蛋白质相互作用结构域。转录因子的转录调控域包括从下列集合中选出的一或多种：螺旋-转折-螺旋(Helix-turn-helix)结构域、锌指(Zinc finger)结构域、亮氨酸拉链(Leucine zipper)结构域、翼状螺旋(Winged helix)结构域、翼状螺旋环螺旋(Winged helix turn helix)结构域、螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix)结构域、HMG-框(HMG-box)结构域和叉头(forkhead)结构域。转录因子的转录调控域包括从下列集合中选出的一或多种：与DNA相互作用的域、RNA、转录共激活因子、转录抑制因子、增强子结合因子和配体、参与到二聚/多聚(dimerization/multimerization)过程中的域以及参与到核定位(nuclear localization)中的域。实施方式中的转录因子的转录调控域可具有序列编号为2至6的序列。实施方式中的融合蛋白可具有序列编号为7至11的序列。
在一实施方式中，本发明提供一种含有蛋白转导域与转录因子的转录调控域的融合蛋白。进一步地，实施方式中的转录因子从下列集合中选出：RORγt(Retinoic acid-related orphan receptor gammat)、Tbet(T-box 21)、GATA-3(GATA binding protein3)、FOXP3(Forkhead box P3)、RORα4(Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4)、HIF-1/2α(Hypoxia inducible factor 1/2α)、STAT(Signal transducers and activators of transcription)、PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)、p53、AP-1、NFκB(nuclear factor kappa-B)、NKx2.5(NK2transcription factor related,locus 5)、FOXO(Forkhead box O)、RELA(v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A)和Runx(runt-related transcription factor)。进一步地，实施方式中的转录因子从下列集合中选出：RORγt(Retinoic acid-related orphan receptor gammat)、Tbet(T-box 21)、GATA-3(GATA binding protein3)和FOXP3(Forkhead box P3)。进一步地，实施方式中的蛋白转导域从下列集合中选出：HP4、Hph-1、Mph-1、Sim-2、Tat、VP22、Antp(Antennapedia)、Pep-1(peptide)、PTD-5、R9(arginine)、7R和CTP(Cytoplasmic transduction peptide)。实施方式中的蛋白转导域可具有序列编号为1的氨基酸序列。实施方式中的转录因子的转录调控域可以是DNA结合结构域或蛋白质相互作用结构域。转录因子的转录调控域包括从下列集合中选出的一或多种：螺旋-转折-螺旋(Helix-turn-helix)结构域、锌指(Zinc finger)结构域、亮氨酸拉链(Leucine zipper)结构域、翼状螺旋(Winged helix)结构域、翼状螺旋环螺旋(Winged helix turn helix)结构域、螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix)结构域、HMG-框(HMG-box)结构域和叉头(forkhead)结构域。转录因子的转录调控域包括从下列集合中选出的一或多种：与DNA相互作用的域、RNA、转录共激活因子、转录抑制因子、增强子结合因子和配体、参与到二聚/多聚(dimerization/multimerization)过程中的域以及参与到核定位(nuclear localization)中的域。转录因子的转录调控域可具有序列编号为2至6的序列。融合蛋白可具有序列编号为7至11的序列。进一步地，本发明提供一种编码上述融合蛋白的核酸、包括该核酸的载体以及包括该载体的宿主细胞。实施方式中的蛋白转导域可具有序列编号为1的序列。转录因子的转录调控域可具有序列编号为2至6的序列。在宿主细胞中的融合蛋白可具有序列编号为7至11的序列。宿主细胞可以是BL21star(DE3)pLys S。
在一实施方式中，本发明提供一种通过表达载体而生成融合蛋白的方法，该载体将编码转录因子的转录调控域的基因与编码蛋白转导域的基因在宿主细胞中结合起来。
在一实施方式中，本发明提供一种用于治疗与转录因子的失常或缺陷有关的疾病的药物组合物，包括含有蛋白转导域与转录因子的转录调控域的融合蛋白以及药学上可接受的赋形剂。当实施方式中的转录因子是NKx2.5(NK2transcription factor related,locus 5)或HIF-1α(Hypoxia inducible factor 1α)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是一种心脏疾病。当实施方式中的转录因子是HIF-1α(Hypoxia inducible factor 1α)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是一种神经系统疾病。当实施方式中的转录因子是PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是糖尿病。当实施方式中的转录因子是RORγt(Retinoic acid-related orphan receptor gamma t)、RORα4(Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4)或FOXO(Forkhead box O)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是一种自身免疫性疾病或炎症性疾病。当实施方式中的转录因子是HIF-2α(Hypoxia inducible factor 2α)或STAT(Signal transducers and activators of transcription)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是一种自身免疫性疾病或炎症性疾病。当实施方式中的转录因子是AP-1或NFκB(nuclear factor kappa-B)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是一种血管疾病或炎症性疾病。当转录因子是p53、SP1或RELA(v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是癌症。当实施方式中的转录因子是GATA-3(GATA binding protein3)时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是哮喘或过敏症。当实施方式中的转录因子是RORγt时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)、类风湿关节炎(RA)或肠道疾病(intestinal bowel disease，IBD)。当实施方式中的转录因子是Foxp3时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是癌症或肿瘤。当实施方式中的转录因子是Tbet时，与转录因子的失常或缺陷有关的疾病可以是RA、IBD或EAE(MS)。
有益效果
根据本发明的融合蛋白可用于治疗与转录因子的失常或缺陷有关的各种疾病。
附图说明
图1显示作为依据本发明的一实施方式的蛋白质的结构：RORgt-TMD与HP4-PTD的融合蛋白(以下将被称为tRORgt-TMD)；无PTD并由此而不能进入到细胞内的RORgt-TMD本身；具有LBD(配体结合结构域)而非RORgt-TMD的融合蛋白tRORgt-LBD。
图2显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD、RORgt-TMD和tRORgt-LBD的考马斯亮蓝染色的图片。
图3显示蛋白印迹分析的图片，证实作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD可通过剂量和时间依赖方式而被转导到Jurkat T细胞内。
图4显示根据荧光显微镜的分析，作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白可被输送到HeLa细胞核内。
图5显示下列结果：tRORgt-TMD以浓度依赖方式来抑制内源性RORgt对IL-17启动子的DNA结合活性，而tRORgt-LBD和不具有PTD的RORgt-TMD以及由于在DNA结合中起关键作用的氨基酸的内部发生突变而不能与IL-17启动子结合的tRORgt-TMD(RR-AG)的突变形式则不能抑制内源性RORgt的DNA结合活性。
图6显示下列结果：作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白在由抗-CD3和抗-CD28mAb诱导的TcR激活后，选择性地抑制IL-17A从脾脏T细胞中的Th17细胞的分泌，但不影响IFN-γ从Th1细胞的分泌、IL-4从Th2细胞的分泌或IL-2活化T细胞的分泌。
图7显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白选择性地抑制CD4+CD25-CD62L+幼稚T细胞分化为Th17细胞以及IL-17A与IL-17F的表达及其从Th17细胞的分泌。然而，tRORgt-TMD不影响CD4+CD25-CD62L+幼稚T细胞分化为Th1细胞、IFN-g的表达及其从Th1细胞的分泌、CD4+CD25-CD62L+幼稚T细胞分化为Th2细胞、以及IL-13的表达及其从Th2细胞的分泌。并且tRORgt-LBD和不具有PTD的RORgt-TMD不抑制CD4+CD25-CD62L+幼稚T细胞分化为Th17细胞。此外，在参与DNA结合的氨基酸中具有tRORgt-TMD突变的tRORgt-TMD(RR-AG)可部分抑制IL-17A从TH17细胞的分泌。
图8显示下列结果：tRORgt-TMD以浓度依赖的方式抑制存在于细胞中的RORgt与IL-17A启动子的结合；且并未在具有LBD的(tRORgt-LBD)和无PTD的RORgt-TMD的融合蛋白中观察到抑制效果，但tRORgt-TMD(RR-AG)(其由于参与与DNA结合的氨基酸发生突变而不能与DNA结合)的突变形式部分抑制来自Th17细胞的IL-17A。
图9显示下列结果：当tFoxp3-TMD通过细胞内途径而传递到nTreg细胞内时，作为依据本发明的一实施方式的tFoxp3-TMD融合蛋白通过内源性Foxp3的相互竞争作用而有效降低nTreg细胞对效应物T细胞的免疫抑制功能。
图10是显示图9中结果的条形图。
图11显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白对于人类多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)的动物模型EAE具有有效的治疗和预防潜力。
图12显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞以及IL-17A从Th17细胞的分泌，且tRORgt-TMD的这种抑制活性也可抑制IFN-g从Th1细胞的分泌，这些是通过ELISA来进行分析的。
图13显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞以及IL-17A从Th17细胞的分泌，且tRORgt-TMD的这种抑制活性也可抑制IFN-g从Th1细胞的分泌，这些是通过细胞内染色(intracellular staining)来进行分析的。
图14通过可对有髓区染色的Luxol固蓝(Luxol Fast Blue)染色显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白可对在人类MS动物模型EAE中的CNS内的神经元细胞的脱髓鞘(demyelination)起到抑制作用。
图15通过苏木精-伊红(Hematoxylin&Eosin)免疫组化染色显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白可抑制炎性细胞浸润到在人类MS动物模型EAE中的CNS内。
图16通过碘酸雪夫免疫组化染色显示作为依据本发明的一实施方式的tRORgt-TMD融合蛋白可抑制炎性细胞浸润到在人类MS动物模型EAE中的CNS内。
图17显示当tGT3-TMD通过鼻内途径喷入到过敏性哮喘的动物模型的气道内时，作为依据本发明的一实施方式的tGT3-TMD融合蛋白可有效地减少一些不同的炎性和免疫细胞的浸润，这是通过细胞鉴别染色法来进行分析的。
图18显示当tGT3-TMD通过鼻内途径喷入到气道内时，作为依据本发明的一实施方式的tGT3-TMD融合蛋白通过抑制Th2特异性细胞因子IL-4和IL-5的分泌而对过敏性哮喘的动物模型具有疗效，这是通过ELISA来进行分析的。
图19显示作为依据本发明的一实施方式的tGT3-TMD融合蛋白通过有效地抑制一些不同的炎性和免疫细胞的浸润而对过敏性哮喘的动物模型具有疗效，这是通过苏木精-伊红(Hematoxylin&Eosin)染色来进行分析的。
具体实施方式
实施例1：含有蛋白转导域和转录因子的转录调控域的融合蛋白的生成、分离和净化通过PCR克隆生成用于控制RORgt的转录活性的RORgt-TMD域(序列编号：2，用于控制转录因子RORgt中的转录活性的域)或RORgt-LBD域，并通过DNA重组技术生成三个重组DNA结构(图1)，即含有HP4(序列编号：1)和RORgt-TMD的tRORgt-TMD、含有HP4和RORgt-LBD的tRORgt-LBD以及不具有HP4PTD的RORgt-TMD。三个重组的DNA克隆在pRSETb载体中，且用于改变BL21star(DE3)pLysS感受态细胞。在改变的感受态细胞经过培养之后，我们通过加入1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-半乳糖苷)来诱导对tRORgt-TMD、tRORgt-LBD和RORgt-TMD融合蛋白的表达。随后收集培养后的细胞，且在使用裂解缓冲液(10mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH8.0)溶解之后采用超声波仪进行声波处理。通过位于融合蛋白tRORgt-TMD、tRORgt-LBD或RORgt-TMD前部的6个组氨酸(Histidine)，这些融合蛋白与Ni-NTA珠结合。随后，我们将融合蛋白放入具有Ni-NTA珠的塔中，使用洗涤缓冲液(30mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH8.0)来洗塔，并随后使用洗脱缓冲液(3M咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH8.0)来分离融合蛋白。我们通过使用PD-10而将缓冲液改为10％甘油PBS，从而除去Nacl和咪唑。随后，我们通过SP珠再次净化融合蛋白，以便除去在所收集的蛋白质中的诸如LPS的内毒素。蛋白质与结合缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH7.2)中的珠结合，随后被置于塔内，采用洗脱缓冲液(2M NaCl，50mM NaH2PO4，pH8.0)来分离。最后，使用PD-10将缓冲液改为PBS除去含有融合蛋白的馏分中的NaCl，且随后在-80℃闪冻。我们通过分析在SDS-PAGE中的纯化的融合蛋白tRORgt-TMD、tRORgt-LBD或RORgt-TMD来分析这些融合蛋白的大小和纯度(图2)。
根据上述方法还制备：含有GATA-3的转录调控域(序列编号：3)的tGT3-TMD，含有Tbet的转录调控域(序列编号：4)的tTbet-TMD，以及含有Foxp3的转录调控域(序列编号：5，6)的tFoxp3-TMD(参见图1b、1c和1d)。
实施例2：对融合蛋白的细胞内传递的证实
<2-1.通过蛋白印迹分析来证实融合蛋白的细胞内传递>
我们向Jurakt T细胞或C57BL/6小鼠的脾细胞的培养基中加入各种浓度(0，100nM，200nM，500nM，1μM，2μM，5μM)的融合蛋白达1小时，或使用5uM融合蛋白来培养这些细胞达不同长度的时间(0、1、3、4、12、24和48h)。我们随后使用PBS来清洗除去未转导到细胞内的剩余融合蛋白。当细胞裂解物中的蛋白质在SDS-PAGE中分离之后，我们通过使用可识别tRORgt-TMD的mAb来确认tRORgt-TMD是否转导到细胞内(参见图3)。我们确认tRORgt-TMD以浓度依赖方式有效地转导到这些细胞内，且大部分融合蛋白在1小时内转导到细胞内，而所转导的蛋白质在转导到细胞内的48小时后开始降解。由此，由于在细胞中长时间地存在高浓度的融合蛋白，我们预期可能无细胞毒素作用。
<2-2.使用抗体证实所转导的融合蛋白输送到细胞核内>
500nM的tRORγt-TMD被转导到HeLa细胞内达1小时，随后使用PBS来清洗细胞，且在对融合蛋白具有特异性的荧光抗体存在的条件下，使用TritonX-100来使细胞膜被渗透。随后，我们确认，对所转导的融合蛋白具有特异性的抗体的荧光与使用DAPI而被染色的细胞核重叠，表明所转导的融合蛋白被输送到细胞核内(参见图4a)。
使用上述相同的实验方法，可以将图1中的含有GATA-3的转录调控域(序列编号：3)的tGT3-TMD，含有Tbet的转录调控域(序列编号：4)的tTbet-TMD，以及含有Foxp3的转录调控域(序列编号：5，6)的tFoxp3-TMD有效地转导到细胞内，甚至转导到细胞核内(参见图4b、4c和4d)。
实施例3：融合蛋白对特定转录活性的抑制影响
<3-1.对细胞因子IL-17A的抑制>
为测试tRORgt-TMD是否能竞争性地和特异性地抑制内源性RORgt对IL-17启动子区域的结合，Hela细胞被转染以DNA表达的RORgt以及由IL-17启动子驱动表达的荧光素酶(luciferase)报告DNA，且使用tRORgt-TMD来培养。我们使用脂质体来使DNA转染入Hela细胞。使用Opti-MEM(Gibco)在缺乏浆液的条件下将PLUS试剂(Invitrogen)、1μg荧光素酶报告构建体以及1μg pRORγt-N1质粒构成的混合物稀释到适当体积。在将转染混合物置于室温下达15分钟以制得复合物之后，将Hela细胞(每孔细胞数为1×105)与DNA加脂质体转染试剂复合物混合达3小时，并随后使用100nM-2μM的tRORγt-TMD、tRORγt-LBD或非转导的RORγt-TMD融合蛋白来处理过夜。我们在洗涤和萃取后使用荧光素酶检测系统(Promega)来测量荧光素酶活性(luciferase activity)。每个转染实验进行三次，且使用发光体(Promega)来测试荧光素酶的活性。tRORγt-TMD融合蛋白将荧光素酶活性降低6倍，而tRORγt-LBD或非转导RORγt-TMD对其并不影响。此外，无法通过对DNA结合起重要作用的氨基酸的突变而与DNA结合的tRORγt-TMD(RR-AG)的突变形式由于突变形式不能与IL-17启动子结合而无法阻止荧光素酶活性(图5)。因此，tRORγt-t-TMD融合蛋白特异性地抑制内源性RORγt与IL-17启动子的结合，且这种抑制功能对于IL-17启动子具有特异性。
使用与上述相同的实验方法，证实了含有GATA-3的转录调控域(序列编号：3)的tGT3-TMD，含有Tbet的转录调控域(序列编号：4)的tTbet-TMD对荧光素酶活性具有抑制作用(参见图4b和4c)。
我们从7周龄雌性C57BL/6小鼠的脾脏中分离出脾细胞，并在将脾细胞培养在12孔中之后，随即采用ELISA测量了从Th1、Th2或Th17细胞分泌的细胞因子的量，并将其涂覆以1μg/ml的抗-CD3抗体和0.5μg/ml的抗-CD28抗体达72小时。我们认为下列现象是由通过抗-CD3和抗-CD28抗体产生的TCR刺激而被诱导产生的：表示T细胞活化的IL-2分泌的增加，表示Th1特异性细胞因子的IFN-γ分泌的增加，表示Th2特异性细胞因子的IL-4分泌的增加，以及表示Th17特异性细胞因子的IL-17A分泌的增加。
为确定tRORγt-TMD融合蛋白是否能抑制内源性RORγt的功能，其可诱导IL-17A从Th17细胞的表达和分泌，我们预先使用200nM的tRORγt-TMD融合蛋白将脾细胞培养达1小时，随后洗涤细胞，以除去未转导的tRORγt-TMD。如上所述，细胞通过抗-CD3和抗-CD28抗体而受到刺激，并分析细胞因子分泌的水平。结果，tRORγt-TMD转导到细胞内并未改变IFN-γ、IL-4或IL-2分泌的水平，而IL-17A的分泌水平则以剂量依赖方式而降低。由这些结果可看出，tRORγt-TMD特异性地抑制Il-17从Th17细胞的分泌，但不影响IFN-γ从Th1细胞的分泌、IL-4从Th2细胞的分泌以及IL-2从活化T细胞的分泌(参见图6)。
<3-2.通过tRORγt-TMD而选择性地抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞>
根据在实验3-1中描述的相同规则，通过使用MACS(Magnetic Cell Sorting，磁性细胞分选)而从7周龄雌性C57BL/6小鼠的脾脏中分离出不成熟的幼稚CD4+CD25-CD62LT细胞，且这些细胞以前从未遇到过任何抗原。在使用100nM或100fM的tRORγt-TMD来治疗这些不成熟和幼稚的CD4T细胞达1小时之后，我们使用细胞因子来培养细胞达72小时，这些细胞因子可以与通过1μg/ml的抗-CD3抗体和0.5μg/ml的抗-CD28抗体而产生的TcR刺激一起，诱导幼稚T细胞分化为Th1、Th2或Th17细胞。我们加入10ng/ml的IL-12和抗-IL-4抗体来使T细胞分化为Th1细胞。我们加入IL-4、IL-5ng/ml和抗-IFN-r抗体来使幼稚T细胞分化为Th2细胞，并加入3ng/ml的TGFβ1、30ng/ml的IL-6、100ng/ml的IL-21、抗-IL-4抗体以及抗-IFN-γ抗体，以诱导幼稚T细胞分化为Th17。当在培养72小时之后采用ELISA来分析分泌到细胞上清液中的细胞因子的水平时，Th1特异性和Th2特异性细胞因子未发生变化，而已知由RORγt诱导的诸如IL-17A和IL-17F的Th17细胞特异性细胞因子则明显减少。由这些结果可看出，tRORγt-TMD可选择性地抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞以及Th17细胞特异性细胞因子的表达与分泌，其中RORγt起到决定性的作用(参见图7)。
接下来，我们研究tRORγt-TMD与由RORγt诱导表达的基因调节区的结合对于采用tRORγt-TMD来抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞而言是否是重要的。在与上述相同的实验条件下，我们采用tRORγt-TMD(RR-AG)来处理幼稚T细胞，其中对tRORgt-TMD的DNA结合具有关键作用的氨基酸而非tRORγt-TMD发生了突变。tRORγt-TMD(RR-AG)无法与由RORγt诱导的IL-17基因启动子结合，而幼稚T细胞分化为Th17细胞得到部分抑制。由该结果可看出，tRORγt-TMD不仅可阻止内源性RORgt与由RORgt诱导的基因启动子的结合，而且还抑制由RORgt在RORgt诱导基因的启动子中补充的作用组的作用，由此抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞(参见图8)。
为证实在RORγt羧基末端的配体结合域对幼稚T细胞分化为Th17细胞所起的调节作用，我们除了使用100nM的tRORγt-LBD而非tRORγt-TMD来治疗幼稚T细胞之外，采用与上述在<3-2>中相同的规则进行了实验。结果，tRORγt-LBD不影响幼稚T细胞分化为Th1、Th2或Th17细胞。我们由该结果证实，由于无PTD的ROTγt-TMD未被输送到细胞内，因而只有tRORγt-TMD可特异性地抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞。
<抑制幼稚T细胞分化为Th1细胞>
为研究tTbet-TMD是否能抑制幼稚T细胞分化为Th1细胞，我们准备了脾脏，通过使用MACS(磁性细胞分选)而从7周龄雌性C57BL/6小鼠的脾脏中分离出幼稚CD4+CD62LT细胞，且使用4uM的ttTbet-TMD将这些细胞处理达2小时。在清洗这些细胞以除去未转导的tTbet-TMD蛋白质之后，将这些细胞在IL-12(10ng/ml)和抗-IL-4(5ug/ml)存在的条件下培养达72小时，随后使用抗-CD3mAb(1ug)和抗-CD28mAb(1ug)来进行TcR刺激达72小时，且使用PMA(50ng/ml)和离子霉素ionomycin(1ug/ml)来收获和再刺激这些细胞达4小时。细胞是可渗透的，使用标记有FITCA的抗-IFN-gmAb来进行培养，并随后通过FACS来分析细胞内IFN-g的水平。由该结果可看出，采用tTbet-TMD处理过的幼稚T细胞无法分化为Th1细胞，表明tTbet-TMD抑制内源性Tbet的功能，由此对幼稚T细胞分化为Th1细胞以及Th1细胞的功能产生抑制作用。因此，tTbet-TMD可以是一种新颖的用于减轻慢性炎性反应和自身免疫性疾病的治疗物质，在这些疾病中Th1细胞发挥主导作用。
<天然调节T细胞的功能性抑制>
我们随后研究了tFoxp3-TMD是否能通过对在nTreg细胞中的内源性Foxp3的竞争性抑制而抑制nTreg细胞的免疫功能。我们准备了脾脏，通过使用MACS(磁性细胞分选)而从7周龄雌性C57BL/6只小鼠的脾脏中分离出nTreg细胞，使用表达异源MHC的BMDC(骨髓树突状细胞)来刺激nTreg细胞的增殖，并随后使用tFoxp3-TMD来处理这些细胞。采用由tFoxp3A-TMD处理过的nTreg细胞与制备为效应物T细胞的CD4+CD25-T细胞来共培养达72小时，且通过将胸苷掺入到效应物T细胞内的方法而分析了nTreg细胞对效应物T细胞的抑制免疫反应的潜力。这些结果表明，使用除tFoxp3-F-TMD之外的所有tFoxp3-TMD处理过的nTreg细胞对效应物T细胞增殖显示出相似的抑制免疫反应活性的水平，尤其是采用tFoxp3-F-TMD处理过的nTreg细胞对效应物T细胞的增殖显示出最显著的免疫抑制，其中nTreg细胞与效应物T细胞的比例为1:4。这些结果表明，参与到DNA序列识别中的tFoxp3-F-TMD中的氨基酸残基可抑制内源性Foxp3的功能，以及/或tFoxp3-F-TMD可抑制转录共激活因子的功能，由此访问由内源性Foxp3诱导的基因的启动子区域，从而抑制nTreg细胞的功能(图9)。
<诱导调节T细胞(iTreg)的功能性抑制>
我们随后研究了由不同功能性的TMD构成的tFoxp3-TMD是否能通过对在nTreg细胞中的内源性Foxp3的竞争性抑制而抑制nTreg细胞的免疫功能。我们通过使用MACS而由FoxP3-GRP-Knock-In(KI)小鼠的脾细胞中得到了CD4+T细胞，且使用FACS来进一步净化CD4+GFP-CD62L2+细胞。使用tFoxp3-TMD来处理这些细胞，并诱导这些细胞分化为iTreg细胞，且在通过抗-CD3和抗-CD28mAb进行TcR刺激达72小时之后，在TGF(10ng/ml)和IL-2(100U/ml)存在的条件下培养它们。随后，采用将胸苷掺入到效应物T细胞内的方法分析了使用tFoxp3-TMD处理过的iTreg细胞对效应物T细胞的增殖与功能的抑制免疫反应活性。在由幼稚T细胞分化出的采用tFoxp3-F-TMD处理过的iTreg细胞与由幼稚T细胞分化出的未采用tFoxp3-F-TMD处理过的iTreg细胞之间具有相近的Foxp3表达水平。这些结果表明，使用除tFoxp3-F-TMD与tFoxp3-R-TMD之外的所有tFoxp3-TMD处理过的iTreg细胞对效应物T细胞增殖显示出相近的抑制免疫反应活性的水平，不过采用tFoxp3-F-TMD或tFoxp3-R-TMD处理过的iTreg细胞对效应物T细胞的增殖显示出最显著的免疫抑制，其中nTreg细胞与效应物T细胞的比例为1:4。这些结果表明，参与到DNA序列识别中的tFoxp3-F-TMD中的氨基酸残基可抑制内源性Foxp3的功能，以及/或tFoxp3-F-TMD可抑制转录共激活因子的功能，由此访问由内源性Foxp3诱导的基因的启动子区域，从而抑制iTreg细胞的功能。并且在采用由R(repressor，抑制因子)域而非F(Forkhead binding，叉头结合)域构成的tFoxp3-R-TMD来处理iTreg细胞之后，iTreg细胞对效应物T细胞的抑制免疫反应潜力可受到抑制，该结果表明tFoxp3-R-TMD有效地抑制了内源性Foxp3在与DNA结合无关的iTreg细胞中的转录活性和功能。
然而，使用其他tFoxp3-TMD处理过的iTreg细胞无法削弱iTreg细胞对效应物T细胞的抑制免疫反应功能。因此，参与DNA序列识别的tFoxp3-F-TMD中的氨基酸残基可抑制内源性Foxp3的功能，以及/或tFoxp3-F-TMD可抑制转录共激活因子的功能，由此访问由内源性Foxp3诱导的基因的启动子区域，从而抑制nTreg细胞和iTreg细胞的功能(图10)。
实施例4：tRORγt-TMD融合蛋白在EAE动物模型中的疗效
<4-1.tRORγt-TMD在EAE动物模型中的疗效分析>
为分析tRORγt-TMD在人类多发性硬化症MS的动物模型(EAE，experimental autoimmune encephalomyelitis实验性自身免疫性脑脊髓炎)中的对于Th17细胞起到重要作用的疾病的疗效，使用6周龄C57BL/6小鼠来产生EAE动物模型。小鼠已有2周的稳定期，且将500ng的百日咳毒素注射到小鼠的腹腔内，随后将150ng的MOG肽与200ug的CFA注射到皮下脂肪内。通常，行为反应是从注射后的第9天开始的。首先是尾部瘫痪，接着是后腿瘫痪，且在严重疾病阶段出现前肢瘫痪。对每个症状进行评分，以评估疾病的进展(1分：尾部轻微瘫痪；2分：尾部完全瘫痪，且后腿轻微瘫痪；3分：一条后腿完全瘫痪；4分：两条后腿均完全瘫痪；5分：两条后腿均完全瘫痪，且前腿轻度瘫痪；6分：死亡)。从疾病诱导的第二天起每周三次将50μg的tRORγt-TMD注射到腹腔内。结果表明，使用tRORγt-TMD处理过的小鼠的发病率降低了50％，且将疾病的严重程度降低至最低。未经处理过的小鼠的发病率为100％，且疾病的严重程度为3.05±0.23，而使用tRORγt-TMD处理过的小鼠的严重程度为0.55±0.27。这些结果表明，tRORγt-TMD对EAE(MS动物模型)在Th17细胞起到重要作用的疾病方面具有显著的疾病预防效果。
为研究tRORγt-TMD对Th17以细胞介导方式诱发和维持的EAE所具有的疗效，开始每周三次将50ug的tRORγt-TMD注射到EAE小鼠的腹腔内，该小鼠疾病症状进展到一条后腿完全瘫痪，临床得分为3。EAE临床得分就在注射了tRORγt-TMD之后显著降低，且EAE症状几乎在第22天就完全消失。因此，tRORγt-TMD对主要由Th17细胞诱导的EAE自身免疫疾病具有预防和治疗的效果(图11)。
<4-2.tRORγt-TMD在治疗效力方面对EAE的细胞学作用机制>
准备从EAE小鼠的脾脏中分离出的显示出使用tRORγt-TMD后的疗效的CD4+T细胞，并使用用于诱导EAE的抗原肽MOG对其进行再刺激。小鼠体内的CD4+T细胞在MOG肽识别之后已分化为特异性CD4+T细胞亚群，由此当使用相同的抗原肽进行再刺激时，分化的CD4+T细胞可分泌出对T细胞亚群具有特异性的细胞因子。在EAE诱导之后的第10天，从自EAE诱导后的第2天起使用tRORγt-TMD处理过的小鼠体内得到脾细胞，且使用40μg/ml的MOG肽进行再刺激达48小时。当采用ELISA对在脾细胞的培养上清液中的细胞因子的水平进行分析时，从Th17细胞分泌的IL-17A细胞因子以及从Th1细胞分泌的IGN-g明显减少(图12)。从以下实验中获得了相似的结果，其中使用Golgi PLUG来处理脾细胞，以避免细胞因子分泌，并使用对每个细胞因子具有特异性的荧光抗体通过细胞内染色(intracellular staining)和FACS来分析细胞内细胞因子的水平(图13)。因此，tRORγt-TMD对EAE的预防和疗效是由于内源性RORgt的特异性功能抑制，从而导致对细胞因子分泌的抑制，例如IL-17从Th17细胞的分泌。通过RORgt来抑制Th17细胞的分化和功能可导致对诸如IFN-g的Th1细胞因子分泌的抑制，该事实表明Th17细胞可被激活，且在EAE的初始阶段以及在随后的Th1细胞的活性和功能中发挥主导作用。
<4-3.tRORγt-TMD对EAE的疗效的组织学分析>
为对tRORγt-TMD对EAE的疗效进行组织学分析，在第21天收获小鼠的脊髓，此时未经处理的小鼠的EAE临床得分最高，且检测脱髓鞘的水平。使用Luxol固蓝(Luxol Fast Blue)对有髓鞘的组织区域进行染色，以使在EAE后期具有严重脱髓鞘的组织不能被染色。使用tRORγt-TMD治疗过的EAE小鼠的脊髓的髓鞘形成状态与正常小鼠的类似。当使用H&E和PAS染色对炎性细胞的浸润程度进行研究时，在EAE诱导小鼠体内观察到炎性细胞严重浸润到脊髓中，但对经tRORγt-TMD治疗的EAE小鼠并未显示出任何显著水平的炎性细胞向脊髓内的浸润。综合所有这些结果可知，tRORγt-TMD通过抑制内源性RORgt的功能而对EAE发挥疗效，由此对幼稚T细胞分化为Th17细胞以及Th17细胞的功能产生抑制作用，例如IL-17在体外和体内的分泌(图14、15和16)。
实施例5：tGT3-TMD对过敏性哮喘的疗效
<5-1.tGT3-TMD对过敏性哮喘的疗效的细胞分析>
为研究tGT3-TMD对由Th2细胞诱导的过敏性哮喘的体内疗效，通过在第1天和第14天向6周龄BALB/c小鼠的腹腔内注射100ug的OVA和20mg的氢氧化铝而产生过敏性哮喘的动物模型。并且在第21、22和23天向鼻内途径喷入75ug的tGT3-TMD，以向肺内和支气管空间内输送tGT3-TMD，且将150ug的OVA用于抗原刺激。在注射之后的第25天，从BAL液中收获细胞，且对各种炎性和免疫细胞的数量进行计数。tGT3-TMD治疗显著减少了各种炎性和免疫细胞的数量(图17)。并且根据过敏性哮喘的动物模型来准备脾脏T细胞，由此显示通过tGT3-TMD治疗以及使用抗-CD3和抗-CD28进行再刺激所具有的疗效。由于这些脾脏T细胞暴露于体内的OVA抗原，因而可在体外抗原激发之后分泌出Th2细胞特异性细胞因子。当采用ELISA来研究Th2特异性细胞因子在培养上清液中的水平时，在使用tGT3A-TMD治疗过的小鼠体内IL-2、IL-5和IL-13的分泌明显减少(图18)。
<5-2.tGT3-TMD对过敏性哮喘的疗效的组织学分析>
为通过免疫组织化学的方法来对tGT3-TMD对肺和支气管炎症的严重程度的疗效进行组织学分析，使用tGT3A-TMD来处理OVA诱导的过敏性哮喘的动物模型，将肺和支气管组织保存在甲醛溶液中达24小时，随后使用PBS进行洗涤，并除去RBC，且制备石蜡组织切片。当使用H&E和PAS来对这些石蜡组织切片进行染色时，在使用tGT3-TMD治疗过的小鼠体内的肺和支气管组织的组织学状态相比于在未经治疗且观察到严重组织破坏的小鼠体内的肺和支气管组织的组织学状态更接近常态。并且炎性细胞的浸润程度明显降低。这些结果表明，tGT3-TMD抑制内源性GATA-3的功能，且抑制Th2细胞的免疫功能，从而对过敏性哮喘具有疗效(图19)。
实施例6：tRORγt-TMD或tGT3-TMD的急性毒性分析
急性毒性测试采用的是由韩国实验分配中心(Korean Experimental Distribution Center)供应的6周龄无特定病原体(specific pathogen free，SPF)SD鼠。
对每个实验组中的两只鼠，在进行单次口服1g/kg的本发明的融合蛋白tRORgt-TMD或tGT3-TMD之后，对动物死亡率，临床症状和体重变化进行检测，并进行血液和血液生化测试，且在进行尸检时对每个器官和肺的异常情况进行视觉检查。
其结果是，在以试验物质给药的鼠中未观察到临床异常和死亡，且未检测到体重变化、血液和血液生化测试中的细胞毒性以及尸检异常。因此，使用1g/kg注射而进行的tRORgt-TMD给药未造成任何毒性，且tRORgt-TMD应为安全试剂，其口服给药的最小致死剂量(LD50)超过1g/kg。
含有本发明的融合蛋白的每种组合物可制成诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、糖浆剂、气雾剂的传统口服制剂、外用药、栓剂或无菌注射液。具体地，诸如传统填料、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂的稀释剂或赋形剂可用于制剂的制备。用于口服给药的固体制剂例如包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂，可通过向本发明的蛋白质中加入至少一或多种诸如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、明胶的赋形剂而制备。此外，除传统赋形剂之外，还可使用诸如硬脂酸镁或滑石粉等润滑剂。用于口服给药的液体制剂例如包括混悬剂、口服溶液剂、乳剂、糖浆剂，可在制备时除加入诸如水和液体石蜡等传统稀释剂之外，还可加入一些诸如润湿剂、增甜剂、矫味剂、防腐剂的赋形剂。示例性的非肠道制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。示例性的非水溶剂和混悬剂包括丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油以及诸如油酸乙酯的可注射酯。Witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可缓冲液、月桂(laurinum)、甘油明胶等可用作栓剂基质。
此外，本发明的蛋白质的剂量可随患者的年龄、性别和体重而变化。通常，每天可服用一次或数次0.001-500mg/kg、优选为0.1-100mg/kg的剂量。此外，蛋白质的剂量可随给药途径、疾病的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少。因此，剂量并不旨在在任何方面限制本发明的范围。
上文已结合具体实施例对本发明作了描述。本领域技术人员会理解的是，本发明可在未脱离本发明的本质特征的范围内采用其他变化后的实现方式。因此，必须从其说明性方面而非其限制性方面来考虑这些公开的实施例。在所附权利要求中而非上述说明中给出了本发明的范围，且在该范围内的所有变化均应被解释为包括在本发明中。
工业应用
本发明中的融合蛋白可用于治疗与转录因子的失常或缺陷有关的各种疾病。
序列列表
序列编号：1表示蛋白转导域，
序列编号：2至6表示转录因子的转录调控域，
序列编号：7至11表示融合蛋白。