双特异性T细胞活化抗原结合分子的制作方法

本发明总体上涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。此外，本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明双特异性抗原结合分子的方法，以及在治疗疾病时使用这些双特异性抗原结合分子的方法。背景在多种临床环境下经常需要选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，癌疗法的主要目的是特异性摧毁肿瘤细胞，同时留下健康的细胞和完整不受损害的组织。实现这个目的的一种有吸引力方式是诱导针对肿瘤的免疫反应，使得免疫效应细胞如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒T淋巴细胞(CTL)攻击并摧毁肿瘤细胞。CTL构成免疫系统的最强有力效应细胞，然而它们不能由常规治疗性抗体Fc结构域介导的效应细胞机制活化。在这个方面，近年来如下双特异性抗体日益引起兴趣，其设计成以一条“臂”结合靶细胞表面上的抗原，并且以第二“臂”结合T细胞受体(TCR)复合物的活化性不变组分。这种抗体与其两种靶的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间短暂相互作用，造成任何细胞毒T细胞的活化和靶细胞的后续裂解。因此，免疫反应再指向靶细胞并且不依赖于靶细胞呈递肽抗原或T细胞特异性，其中所述靶细胞呈递肽抗原或T细胞特异性与通常的MHC限制型CTL活化相关。在这种情况下关键是当靶细胞向CTL呈递双特异性抗体时，仅活化CTL，即模拟了免疫突触。特别想要的是：不需要淋巴细胞预先调节或共刺激以激发靶细胞的高效溶解的双特异性抗体。已经开发了几种双特异性抗体样式并且研究了它们对T细胞介导的免疫疗法的适用性。这些抗体样式当中，已经非常充分地表征了所谓的BiTE(双特异性T细胞衔接体(bispecificTcellengager))分子并且它们已经在临床环境下显示某种前景(综述见Nagorsen和ExpCellRes317,1255-1260(2011))。BiTE是其中两个scFv分子通过柔性接头融合的串联scFv分子。正在评价T细胞衔接作用的其他双特异性样式包括双体抗体(diabody)(Holliger等人,ProtEng9,299-305(1996))及它们的衍生物，如串联双体抗体(Kipriyanov等人,JMolBiol293,41-66(1999))。更近的发展是所谓的DART(双亲和力再指向)分子，其是基于双体抗体样式，但是以起到额外稳定作用的C末端二硫键为特征(Moore等人,Blood117,4542-51(2011))。所谓的三体瘤，其是完整杂合小鼠/大鼠IgG分子并且目前还在临床试验中评价，代表一种较大尺寸的样式(综述见Seimetz等人CancerTreatRev36,458-467(2010))。正在开发的多种样式显示归属于免疫疗法中T细胞再指向和活化的巨大潜力。然而，产生适用于此的双特异性抗体的任务无论如何并非不重要，其涉及不得不解决的与抗体效力、毒性、适用性和可生产性相关的众多挑战。小构建体如，例如BiTE分子-尽管能够有效地交联效应细胞和靶细胞－具有非常短的血清半寿期，需要将它们通过连续输注施用至患者。在另一方面，类IgG样式－尽管具有半寿期长的巨大益处-遭遇与IgG分子固有的天然效应子功能相关的毒性。对于成功的治疗性开发而言，它们的免疫原性潜力构成IgG样双特异性抗体、尤其非人类样式的另一个不利特征。最后，在总体开发双特异性抗体时的一个巨大挑战是产生以临床上够用的量和纯度产生双特异性抗体构建体，原因在于共表达时，不同特异性的抗体重链和轻链错误配对，这降低了正确装配的构建体的产率并产生可能与所需双特异性抗体难以分离的众多无功能的副产物。鉴于与目前可用于T细胞介导的免疫疗法的双特异性抗体相关的难题和缺点，仍需要这类分子的新颖改进样式。本发明提供设计用于T细胞活化和再指向的双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子组合了良好有效性和可生产性及低毒性和有利药代动力学特性。特别地，提供了新双特异性抗原结合分子，它们包含具有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。也提供了包含单结构域可变重链的新双特异性抗原结合分子。这些新分子具有优点：它们可以以较少的副产物产生，原因是在分别包含锚蛋白基序或单结构域可变重链的结合物和包含抗体重链和轻链的结合物之间不存在错误配对。还提供了新的双特异性抗原结合分子，所述分子包含借助静电转向效应促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。由此促进Fc结构域的正确链缔合并且在产生这些分子期间更少的不利副产物出现。发明简述在一个方面本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分包含单结构域抗原结合分子。在一个实施方案中，所述单结构域抗原结合分子是单结构域可变重链。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换，和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分由单结构域可变重链组成。在一个方面本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在这样的一个实施方案中，能够与T细胞活化抗原特异性结合的所述第一抗原结合部分是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中第二抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在这样的一个实施方案中，所述第二抗原部分包含一种包含两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域。在一个具体实施方案中，不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分存在于T细胞活化性双特异性抗原结合分子中(即T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供与T细胞活化抗原单价结合)。在具体的实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。在一个实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。在这样的一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是单结构域可变重链。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，其中所述交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；c)第二抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和d)第三抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在这样的一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在这样的一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是一种包含两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，其中所述交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；c)第二抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中所述含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和d)第三抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述第一抗原结合部分与T细胞活化抗原结合并且所述第二和第三抗原结合部分与相同的靶细胞抗原结合。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgGFc结构域。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域。在具体的实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。在具体的实施方案中，Fc结构域包含促进第一和第二Fc结构域亚基缔合的修饰。在一个这样的特定实施方案中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3结构域内部产生可安置在第二亚基的CH3结构域内部腔中的突出部分，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3结构域内部产生腔，在所述腔内部可安置第一亚基的CH3结构域内部的突出部分。在一个具体实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，Fc结构域显示降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在某些实施方案中，与非工程化的Fc结构域相比，Fc结构域经工程化以具有对Fc受体降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个实施方案中，Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc结构域中减少与Fc受体结合和/或效应子功能的一种或多种氨基酸置换在选自L234、L235和P329的一个或多个位置处。在具体的实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能的三个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L234A、L235A和P329G。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域，尤其人IgG1Fc结构域。在其他实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能的两个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L235E和P329G。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域，尤其人IgG4Fc结构域。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域，尤其人IgG4Fc结构域，并且包含氨基酸置换L235E和S228P(SPLE)。在一个实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是人FcγRIIa、FcγRI和/或FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个方面本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，所述分子包含第一和第二抗原结合部分，所述抗原结合部分之一是能够与T细胞活化抗原特异性结合的Fab分子并且另一个抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子；其中第一抗原结合部分是(a)其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接的单链Fab分子或(b)其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子；并包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，其中已经修饰所述第一亚基和所述第二亚基以包含静电上有利于异二聚体形成的一个或多个带电荷的氨基酸。在一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变E356K、E357K和D399K并且所述第二亚基包含氨基酸突变K370E、K409E和K439E。在一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变K392D、K409D并且所述第二亚基包含氨基酸突变E356K、D399K(DDKK)。在一个具体实施方案中，不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分存在于T细胞活化性双特异性抗原结合分子中(即T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供与T细胞活化抗原单价结合)。在具体的实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。在甚至更具体的实施方案中，第一抗原结合部分是其中Fab轻链和Fab重链的恒定区交换的交换Fab分子。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。在这样的一个实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在另一个这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在又一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab轻链的C末端与第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合。在这样的实施方案中，其中第一抗原结合部分是交换Fab分子并且其中(i)第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合或(ii)第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链额外地可以彼此融合、任选地通过肽接头彼此融合。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在另一个实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子。在这样的一个实施方案中，第三抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合分子的第二和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在另一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合分子的第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分可以直接融合或通过合适的肽接头融合。在一个实施方案中，第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分。在一个具体实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgGFc结构域。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域。在具体的实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。在一个具体实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，Fc结构域显示降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在某些实施方案中，与非工程化的Fc结构域相比，Fc结构域经工程化以具有对Fc受体降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个实施方案中，Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc结构域中减少与Fc受体结合和/或效应子功能的一种或多种氨基酸置换在选自L234、L235和P329的一个或多个位置处。在具体的实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能的三个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L234A、L235A和P329G。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域，尤其人IgG1Fc结构域。在其他实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能的两个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L235E和P329G。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域，尤其人IgG4Fc结构域。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域，尤其人IgG4Fc结构域，并且包含氨基酸置换L235E和S228P(SPLE)。在一个实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是人FcγRIIa、FcγRI和/或FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个具体实施方案中，双特异性抗原结合分子能够与之结合的T细胞活化抗原是CD3。在其他实施方案中，双特异性抗原结合分子能够与之结合的靶细胞抗原是肿瘤细胞抗原。在一个实施方案中，靶细胞抗原选自：黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CD19、CD20和CD33。根据本发明的另一个方面，提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。本发明还涵盖由本发明多核苷酸编码的多肽。本发明还提供包含本发明的分离多核苷酸的表达载体，和包含本发明的分离多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，尤其哺乳动物细胞。在另一个方面，提供一种产生本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括步骤a)在适于表达T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞和b)回收T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明方法产生的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明还提供一种包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和可药用载体的药物组合物。本发明还涵盖了使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物用作药物。在一个方面提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物根据用于治疗有需求的个体中的疾病。在一个具体实施方案中，该疾病是癌症。还提供本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于制造治疗有需求的个体中疾病的药物的用途；并提供了治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含可药用形式的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个具体实施方案中，该疾病是癌症。在以上实施方案的任一者中，个体优选地是哺乳动物，尤其是人。本发明也提供一种用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在T细胞、尤其细胞毒T细胞存在下接触。附图简述图1：本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的(TCB)的示例性构型。(A)“1+1IgGscFab，单臂”，和(B)“1+1IgGscFab，单臂倒置”分子的图示。在“1+1IgGscFab，单臂”分子中，靶向T细胞的Fab的轻链通过接头与重链融合，而“1+1IgGscFab，单臂倒置”分子在靶向肿瘤的Fab中具有接头。(C)“2+1IgGscFab”分子的图示。(D)“1+1IgGscFab”分子的图示。(E)“1+1IgGCrossfab”分子的图示。(F)“2+1IgGCrossfab”分子的图示。(G)具有Crossfab和Fab组分备选顺序(“倒置”)的“2+1IgGCrossfab”分子的图示。(H)“1+1IgGCrossfab轻链(LC)融合分子的图示。(I)“1+1CrossMab”分子的图示。(J)“2+1IgGCrossfab，连接的轻链”分子的图示。(K)“1+1IgGCrossfab，连接的轻链”分子的图示。(L)“2+1IgGCrossfab、倒置、连接的轻链”分子的图示。(M)“1+1IgGCrossfab、倒置、连接的轻链”分子的图示。黑点：Fc结构域中促进异二聚化的任选修饰。图2：非还原(A)和还原(B)的“1+1IgGscFab，单臂”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:1、3、5)及非还原(C)和还原(D)的“1+1IgGscFab，单臂倒置”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:7、9、11)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。图3：“1+1IgGscFab，单臂”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:1、3、5)(A)和“1+1IgGscFab，单臂倒置”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:7、9、11)(B)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图4：非还原(A)和还原(B)的“1+1IgGscFab，单臂”(抗EGFR/抗huCD3)(参见SEQIDNO:43、45、57)及非还原(C)和还原(D)的“1+1IgGscFab，单臂倒置”(抗EGFR/抗huCD3)(参见SEQIDNO:11、49、51)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。图5：“1+1IgGscFab，单臂”(抗EGFR/抗huCD3)(参见SEQIDNO:43、45、47)(A)和“1+1IgGscFab，单臂倒置”(抗EGFR/抗huCD3)(参见SEQIDNO:11、49、51)(B)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图6：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“1+1IgGscFab，单臂倒置”(抗FAP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:11、51、55)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“1+1IgGscFab，单臂倒置”(抗FAP/抗huCD3)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图7：(A)非还原(泳道2)和还原(泳道3)的“2+1IgGscFab，P329GLALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、21、23)；(B)非还原(泳道2)和还原(泳道3)的“2+1IgGscFab，LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、17、19)；(C)非还原(泳道2)和还原(泳道3)的“2+1IgGscFab，wt”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、13、15)；及(D)非还原(泳道2)和还原(泳道3)的“2+1IgGscFab，P329GLALAN297D”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、25、27)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。图8：(A)“2+1IgGscFab，P329GLALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、21、23)；(B)“2+1IgGscFab，LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、17、19)；(C)“2+1IgGscFab，wt”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、13、15)；和(D)“2+1IgGscFab，P329GLALAN297D”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、25、27)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图9：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1IgGscFab，P329GLALA”(抗EGFR/抗huCD3)(参见SEQIDNO:45、47、53)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgGscFab，P329GLALA”(抗EGFR/抗huCD3)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图10：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1IgGscFab，P329GLALA”(抗FAP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:57、59、61)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgGscFab，P329GLALA”(抗FAP/抗huCD3)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图11：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“1+1IgGCrossfab，Fc(扣)P329GLALA/Fc(结)wt”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、29、31、33)的SDSPAGE(4-12％Tris-乙酸盐(A)或4-12％Bis/Tris(B)，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“1+1IgGCrossfab，Fc(扣)P329GLALA/Fc(结)wt”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图12：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:3、5、29、33)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图13：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗cyCD3)(参见SEQIDNO:3、5、35、37)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗cyCD3)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图14：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1IgGCrossfab，倒置”(抗CEA/抗huCD3)(参见SEQIDNO:33、63、65、67)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgGCrossfab，倒置”(抗CEA/抗huCD3)的分析性大小排阻色谱(Superdex20010/300GLGEHealthcare；2mMMOPSpH7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。图15：(A)“(scFv)2-Fc”和“(dsscFv)2-Fc”(抗MCSP(LC007)/抗huCD3(V9))的热稳定性。动态光散射，按0.05℃/分钟以25-75℃的温变率所测量。黑色曲线：“(scFv)2-Fc”；灰色曲线：“(dsscFv)2-Fc”。(B)“2+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:5、21、23)和“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:3、5、29、33)的热稳定性。动态光散射，按0.05℃/分钟以25-75℃的温变率所测量。黑色曲线：“2+1IgGscFab”；灰色曲线：“2+1IgGCrossfab”。图16：用于(A)测定多种Fc突变体与人FcγRIIIa的相互作用和(B)T细胞双特异性构建体与肿瘤靶和人CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)的同时结合的Biacore测定法设置。图17：T细胞双特异性构建体与人MCSP的D3结构域和人CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)的同时结合。(A)“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)，(B)“2+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:5、21、23)。图18：T细胞双特异性构建体与人EGFR和人CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)的同时结合。(A)“2+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:45、47、53)，(B)“1+1IgGscFab，单臂”(参见SEQIDNO:43、45、47)，(C)“1+1IgGscFab，单臂倒置”(参见SEQIDNO:11、49、51)，和(D)“1+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:47、53、213)。图19：通过FACS测量的“(scFv)2”分子(50nM)与Jurkat细胞上表达的CD3(A)或与Colo-38细胞上的MCSP(B)结合。与未处理的细胞和仅用第二抗体染色的细胞相比，绘制平均荧光强度。图20：通过FACS测量的“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)构建体(50nM)与Jurkat细胞上表达的CD3(A)或与Colo-38细胞上的MCSP(B)结合。与用参比抗CD3IgG(如所示)处理的细胞、未处理的细胞和仅用第二抗体染色的细胞相比，绘制平均荧光强度。图21：“1+1IgGscFab，单臂”(参见SEQIDNO:1、3、5)和“1+1IgGscFab，单臂倒置”(参见SEQIDNO:7、9、11)构建体(50nM)与Jurkat细胞上表达的CD3(A)或与Colo-38细胞上的MCSP(B)结合。与用参比抗CD3或抗MCSPIgG(如所示)处理的细胞、未处理的细胞和仅用第二抗体染色的细胞相比，绘制平均荧光强度。图22：“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)双特异性构建体和相应的抗MCSPIgG与Colo-38细胞上的MCSP的剂量依赖性结合，如通过FACS所测量。图23：与1nM的“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)或“(scFv)2”CD3-MCSP双特异性构建体在Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下温育后，人T细胞上不同活化标志物的表面表达水平，如所示(PBMC对肿瘤细胞的E:T比率＝10:1)。描述了分别15小时或24小时温育后CD8+T细胞上早期活化标志物CD69(A)或晚期活化标志物CD25(B)的表达水平。图24：与1nM的“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)或“(scFv)2”CD3-MCSP双特异性构建体在Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下温育后，人T细胞上晚期活化标志物CD25的表面表达水平，如所示(E:T比率＝5:1)。描述了5天温育后CD8+T细胞(A)上或CD4+T细胞(B)上晚期活化标志物CD25的表达水平。图25：在表达人MCSP的MV-3肿瘤靶细胞(E:T比率＝3:1)存在或不存在下与所示浓度的“2+1IgGCrossfab”双特异性构建体(靶向食蟹猴CD3和人MCSP；参见SEQIDNO:3、5、35、37)温育43小时后，晚期活化标志物CD25在来自两只不同动物(cynoNestor，cynoNobu)的食蟹猴CD8+T细胞上的表面表达水平。作为对照，使用参比IgG(抗食蟹猴CD3IgG，抗人MCSPIgG)或非生理刺激物PHA-M。图26：在U87MG肿瘤细胞(E:T比率＝5:1)存在下被“2+1IgGscFab，LALA”CD3-MCSP双特异性构建体(参见SEQIDNO:5、17、19)活化18.5小时的人泛T细胞分泌的IFN-γ水平。作为对照，施用相应的抗CD3IgG和抗MCSPIgG。图27：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的“2+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:5、21、23)、“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“(scFv)2”双特异性分子和相应IgG活化20小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图28：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化20小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。比较了差异在于其Fc结构域(具有野生型Fc结构域(参见SEQIDNO:5、13、15)，或经突变以取消(NK)效应细胞功能的Fc结构域：P329GLALA(参见SEQIDNO:5、21、23)、P329GLALAN297D(参见SEQIDNO:5、25、27))的“2+1IgGscFab”构建体和“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)构建体。图29：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下对Colo-38肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述人泛T细胞用CD3-MCSP双特异性“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)构建体、“(scFv)2”分子或相应的IgG处理18.5小时。图30：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下对Colo-38肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述人泛T细胞用CD3-MCSP双特异性“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)构建体、“(scFv)2”分子或相应的IgG处理18小时。图31：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的CD3-MCSP双特异性“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)构建体、“(scFv)2”分子或相应IgG活化23.5小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图32：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的CD3-MCSP双特异性“1+1IgGscFab，单臂”(参见SEQIDNO:1、3、5)、“1+1IgGscFab，单臂倒置”(参见SEQIDNO:7、9、11)或“(scFv)2”构建体或相应IgG活化19小时情况下，对Colo-38肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图33：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下对Colo-38肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述人泛T细胞用“1+1IgGscFab”CD3-MCSP双特异性构建体(参见SEQIDNO:5、21、213)或“(scFv)2”分子处理20小时。图34：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化21小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。比较了CD3-MCSP双特异性“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“1+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、29、31、33)构建体、“(scFv)2”分子和相应的IgG。图35：通过用135ng/ml或1.35ng/ml“2+1IgGCrossfab”CD3-MCSP双特异性构建体(参见SEQIDNO:3、5、29、33)活化人T细胞(E:T比率＝25:1)所诱导的对不同靶细胞(MCSP阳性Colo-38肿瘤靶细胞、衍生自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞，或来自胎盘的周细胞；如所示)的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图36：与人PBMC和不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”)或糖工程化抗MCSPIgG(GlycoMab)共培养时，21小时温育过夜后测量的对Colo-38肿瘤靶细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。效应细胞对靶细胞比率设置在25:1(A)，或如所述变动(B)。PBMC从新鲜血液(A)或从暗黄覆盖层(B)分离。图37：靶向食蟹猴CD3和人MCSP的“2+1IgGCrossfab”构建体，(参见SEQIDNO:3、5、35、37)的时间依赖性细胞毒效应。描述了与原代食蟹猴PBMC(E:T比率＝3:1)共培养24小时或43小时时来自表达人MCSP的MV-3细胞的乳酸脱氢酶释放量。作为对照，使用相同体积摩尔浓度的参比IgGs(抗cynoCD3IgG和抗人MCSPIgG)。PHA-M充当T细胞活化(非生理性)的对照。图38：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对huMCSP阳性MV-3黑素瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“(scFv)2”)处理约26小时。图39：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下，对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞用不同的CD3-EGFR双特异性构建体(“2+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:45、47、53)、“1+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:47、53、213)和“(scFv)2”)或参比IgG处理18小时。图40：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下，对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞用不同的CD3-EGFR双特异性构建体(“1+1IgGscFab，单臂”(参见SEQIDNO:43、45、47)、“1+1IgGscFab，单臂倒置”(参见SEQIDNO:11、49、51)、“1+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:47、53、213)和“(scFv)2”)或参比IgG处理21小时。图41：与人泛T细胞(A)或人幼稚T细胞(B)共培养情况下，对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞或人幼稚T细胞用不同的CD3-EGFR双特异性构建体(“1+1IgGscFab，单臂”(参见SEQIDNO:43、45、47)、“1+1IgGscFab，单臂倒置”(参见SEQIDNO:11、49、51)和“(scFv)2”)或参比IgG处理16小时。效应细胞对靶细胞比率是5:1。图42：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下，对FAP阳性GM05389成纤维细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞用不同的CD3-FAP双特异性构建体(“1+1IgGscFab，单臂倒置”(参见SEQIDNO:11、51、55)、“1+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:57、61、213)、“2+1IgGscFab”(参见SEQIDNO:57、59、61)和“(scFv)2”)处理约18小时。图43：CD8+T细胞中CD107a/b表达水平以及穿孔素水平的流式细胞分析，其中所述CD8+T细胞已经用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”)或相应的对照IgG在靶细胞存在(A)或不存在(B)下处理6小时。将人泛T细胞与9.43nM的不同分子在Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下按效应细胞对靶细胞比率5:1温育。在第1小时温育后添加莫能菌素以通过防止蛋白质运输而增加胞内蛋白水平。如所述，对全部CD107a/b阳性细胞、穿孔素阳性细胞或双阳性细胞设门。图44：与1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)或“(scFv)2”)或相应对照IgG在Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下按效应细胞对靶细胞比率5:1温育时，CD8+(A)或CD4+(B)人T细胞的相对增殖。CFSE标记的人泛T细胞通过FACS表征。通过围绕非增殖性细胞设门并且相对作为参考的实测总细胞数目而利用这种设门情况下的细胞数目，确定相对增殖水平。图45：用1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGscFab，LALA”(参见SEQIDNO:5、17、19)或“(scFv)2”)或相应的对照IgG在Colo-38肿瘤细胞存在(A)或不存在下(B)处理24小时后，人PBMC的上清液中测量的不同细胞因子水平。效应细胞对靶细胞比率是10:1。图46：用1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGscFab”、“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)或“(scFv)2”)或相应的对照IgG在Colo-38肿瘤细胞存在(A、B)或不存在(C、D)下处理24小时后，全血的上清液中测量的不同细胞因子水平。在双特异性构建体当中存在不同的“2+1IgGscFab”构建体，所述构建体具有野生型Fc结构域(参见SEQIDNO:5、13、15)或经突变以取消(NK)效应细胞功能的Fc结构域(LALA(参见SEQIDNO:5、17、19)、P329GLALA(参见SEQIDNO:5、2、23)和P329GLALAN297D(参见SEQIDNO:5、25、27))。图47：CE-SDS分析。作为2+1IgGCrossfab，连接的轻链(参见SEQIDNO:3、5、29、179)的SDSPAGE显示的电泳图。(泳道1：还原，泳道2：非还原)。图48：2+1IgGCrossfab，连接的轻链(参见SEQIDNO:3、5、29、179)(终产物)的分析性大小排阻色谱。注入20μg样品。图49：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性MV-3肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(参见SEQIDNO:3、5、29、179))处理约44小时。从健康志愿者的新鲜血液分离人PBMC。图50：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(参见SEQIDNO:3、5、29、179))处理约22小时。从健康志愿者的新鲜血液分离人PBMC。图51：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(参见SEQIDNO:3、5、29、179))处理约22小时。从健康志愿者的新鲜血液分离人PBMC。图52：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性WM266-4细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(参见SEQIDNO:3、5、29、179))处理约22小时。从健康志愿者的新鲜血液分离人PBMC。图53：与10nM、80pM或3pM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(参见SEQIDNO:3、5、29、179))在表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下(E:T比率＝10:1)温育22小时后，人CD8+T细胞上的早期活化标志物CD69(A)和晚期活化标志物CD25(B)的表面表达水平。图54：CE-SDS分析。(A)作为1+1IgGCrossfab；VL/VH交换(LC007/V9)(参见SEQIDNO:5、29、33、181)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)非还原，b)还原。(B)作为1+1CrossMab；CL/CH1交换(LC007/V9)(参见SEQIDNO:5、23、183、185)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(C)作为2+1IgGCrossfab，倒置；CL/CH1交换(LC007/V9)(参见SEQIDNO:5、23、183、187)：a)还原，b)非还原的SDS-PAGE显示的电泳图。(D)作为2+1IgGCrossfab；VL/VH交换(M4-3ML2/V9)(参见SEQIDNO:33、189、191、193)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(E)作为2+1IgGCrossfab；CL/CH1交换(M4-3ML2/V9)(参见SEQIDNO:183、189、193、195)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(F)作为2+1IgGCrossfab，倒置；CL/CH1交换(CH1A1A/V9)(参见SEQIDNO:65、67、183、197)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(G)作为2+1IgGCrossfab；CL/CH1交换(M4-3ML2/H2C)(参见SEQIDNO:189、193、199、201)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(H)作为2+1IgGCrossfab，倒置；CL/CH1交换(431/26/V9)(参见SEQIDNO:183、203、205、207)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(I)作为“2+1IgGCrossfab轻链融合物”(CH1A1A/V9)(参见SEQIDNO:183、209、211、213)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(J)“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、23、215、217)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)，非还原(左)和还原(右)。(K)作为“2+1IgGCrossfab，倒置”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQIDNO:5、23、215、219)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(L)“1+1IgGCrossfab”(抗CD33/抗huCD3)(参见SEQIDNO:33、213、221、223)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)，非还原(左)和还原(右)。(M)“2+1IgGCrossfab”(抗CD33/抗huCD3)(参见SEQIDNO:33、221、223、225)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)，非还原(左)和还原(右)。(N)“2+1IgGCrossfab”(抗CD20/抗huCD3)(参见SEQIDNO:33、227、229、231)的非还原SDSPAGE(4-12％Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。图55：双特异性构建体(CEA/CD3“2+1IgGCrossfab，倒置(VL/VH)”(参见SEQIDNO:33、63、65、67)和“2+1IgGCrossfab，倒置(CL/CH1)2(参见SEQIDNO:65、67、183、197))与Jurkat细胞表达的人CD3的结合(A)或与LS-174T细胞表达的人CEA的结合(B)，如通过FACS所确定。作为对照，也评估参比IgG的等价最大浓度和因标记第二抗体(山羊抗人FITC缀合的亲和纯F(ab’)2片段，Fcγ片段特异性，JacksonImmunoResearchLab#109-096-098)所致的背景染色。图56：双特异性构建体(MCSP/CD3“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，倒置”(参见SEQIDNO:5、23、183、187))与Jurkat细胞表达的人CD3的结合(A)或与WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP的结合(B)，如通过FACS所确定。图57：“1+1IgGCrossfab轻链融合物”(参见SEQIDNO:183、209、211、213)与Jurkat细胞表达的人CD3的结合(A)或与LS-174T细胞表达的人CEA的结合(B)，如通过FACS所确定。图58：“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、23、215、217)和“2+1IgGCrossfab，倒置”(参见SEQIDNO:5、23、215、219)构建体与Jurkat细胞表达的人CD3的结合(A)或WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP的结合(B)，如通过FACS所确定。图59：与所示浓度的CD3/MCSP“1+1CrossMab”(参见SEQIDNO:5、23、183、185)，“1+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、29、33、181)和“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)构建体温育24小时后，人CD4+或CD8+T细胞上早期活化标志物CD69(A)或晚期活化标志物CD25(B)的表面表达水平。如所示，该测定法在MV-3靶细胞存在或不存在下进行。图60：在huMCSP阳性MV-3肿瘤细胞存在或不存在时与食蟹猴PBMC(E:T比率＝3:1，归一化为CD3+数目)共培养情况下，来自两不同食蟹猴(A和B)的CD4+或CD8+T细胞上早期活化标志物CD25的表面表达水平，其中所述的食蟹猴PBMC用“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、23、215、217)和“2+1IgGCrossfab，倒置”(参见SEQIDNO:5、23、215、219)处理约41小时。图61：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于“2+1IgGCrossfab，倒置(CL/CH1)”(参见SEQIDNO:65、67、183、197)构建体，由不同浓度的“2+1IgGCrossfab，倒置(VL/VH)”(参见SEQIDNO:33、63、65、67)活化28小时情况下，对肿瘤细胞MKN-45(A)或LS-174T(B)的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图62：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于“2+1IgGCrossfab(CL/CH1)”(参见SEQIDNO:183、189、193、195)构建体，由不同浓度的“2+1IgGCrossfab(VL/VH)”(参见SEQIDNO:33、189、191、193)活化26小时情况下，对肿瘤细胞WM266-4的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图63：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于“2+1IgGCrossfab(CL/CH1)”(参见SEQIDNO:183、189、193、195)构建体，由不同浓度的“2+1IgGCrossfab(VH/VL)”(参见SEQIDNO:33、189、191、193)活化27小时情况下，对肿瘤细胞MV-3的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图64：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且由不同浓度的“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)、“1+1CrossMab”(参见SEQIDNO:5、23、183、185)，和“1+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、29、33、181)活化21小时情况下，对人MCSP阳性WM266-4(A)或MV-3(B)肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，如所示。图65：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且由不同浓度的“1+1IgGCrossfabLC融合物”(参见SEQIDNO:183、209、211、213)活化28小时情况下，对肿瘤细胞MKN-45(A)或LS-174T(B)的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图66：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于非靶向的参比“2+1IgGCrossfab”，由不同浓度的“1+1IgGCrossfabLC融合物”(参见SEQIDNO:183、209、211、213)活化24小时情况下，对MC38-huCEA肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。图67：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对人MCSP阳性MV-3(A)或WM266-4(B)肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用“2+1IgGCrossfab(V9)”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，倒置(V9)”(参见SEQIDNO:5、23、183、187)、“2+1IgGCrossfab(抗CD3)”(参见SEQIDNO:5、23、215、217)和“2+1IgGCrossfab，倒置(抗CD3)”(参见SEQIDNO:5、23、215、219)构建体处理。图68：MCSPTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子的示意图。图69：MCSPTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置，SEQIDNO:278、319、320、321)的CE-SDS分析。作为MCSPTCB的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还原，B)还原。图70：MCSPTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置，SEQIDNO:278、319、320、321)的分析性大小排阻色谱，色谱图A280(TSKgelG3000SWXL[Tosoh]；25mMK2HPO4，125mMNaCl，200mML-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3，pH6.7；注入20μg样品。图71：CEATCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子的示意图。图72：CEATCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置，SEQIDNO:288、322、323、324))分子的CE-SDS分析。作为CEATCB的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还原，B)还原。图73：CEATCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置，SEQIDNO:288、322、323、324))分子的分析性大小排阻色谱，色谱图A280(TSKgelG3000SWXL[Tosoh]；25mMK2HPO4，125mMNaCl，200mML-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3，pH6.7；注入20μg样品。图74：MCSPTCB(SEQIDNO:278、319、320、321)与A375细胞(MCSP+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。图75：对A375(高MCSP)(A)、MV-3(中等MCSP)(B)、HCT-116(低MCSP)(C)和LS180(MCSP阴性)(D)靶细胞，由MCSPTCB抗体(SEQIDNO:278、319、320、321)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC，温育时间24小时)。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。图76：在MCSPTCB抗体(SEQIDNO:278、319、320、321)诱导T细胞介导杀伤MV3黑素瘤细胞(E:T＝10:1，24小时温育)后，人CD8+(A、B)和CD4+(C、D)T细胞上的CD25和CD69上调。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。图77：在MCSPTCB抗体(SEQIDNO:278、319、320、321)诱导T细胞介导杀伤MV3黑素瘤细胞(E:T＝10:1，24小时温育)后，人PBMC分泌IL-2(A)、IFN-γ(B)、TNFα(C)、IL-4(D)、IL-10(E)和粒酶B(F)。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。图78：CEATCB(SEQIDNO:288、322、323、324)与LS180(中等CEA肿瘤细胞)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。图79：对MKN45(高CEA)(A)、LS180(中等CEA)(B)、HT-29(低CEA)(C)，由CEATCB(SEQIDNO:288、322、323、324)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC，温育时间24小时)。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。图80：在CEATCB(SEQIDNO:288、322、323、324)诱导T细胞介导杀伤LS180结肠腺癌细胞(E:T＝10:1，24小时温育)后，人CD8+(A、B)和CD4+(C、D)T细胞上的CD25和CD69上调。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。图81：在CEATCB(SEQIDNO:288、322、323、324)诱导T细胞介导杀伤LS180结肠腺癌细胞(E:T＝10:1、24小时温育)后，IFN-γ(A)、TNFα(B)、粒酶B(C)、IL-4(D)、IL-10(E)的分泌。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。图82：含有DP47GS作为非结合性抗体并含有人源化CH2527作为抗CD3抗体的DP47GSTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置＝“非靶向的TCB”，SEQIDNO:325、326、327、328)的CE-SDS分析。作为DP47GSTCB的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还原，B)还原。图83：含有DP47GS作为非结合性抗体并含有人源化CH2527作为CD3抗体的DP47GSTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置“非靶向的TCB”，SEQIDNO:325、326、327、328)的分析性大小排阻色谱，色谱图A280(TSKgelG3000SWXL[Tosoh]；25mMK2HPO4，125mMNaCl，200mML-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3，pH6.7；注入20μg样品。图84：与未成熟的亲本克隆(M4-3ML2)相比，亲和力成熟的抗MCSP克隆的比对结果。图85：aVHTCB分子的图示。图86：CE-SDS分析。作为aVHTCB(SEQIDNO:369、370、371)的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还原，B)还原。图87：aVHTCB(SEQIDNO:369、370、371)与MV-3细胞(MCSP+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。图88：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对MV-3黑素瘤细胞由aVHTCB抗体(SEQIDNO:369、370、371)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC)。图89：DarpinTCB分子的图示。图90：CE-SDS分析。作为DarpinTCB(SEQIDNO:376、377、378)的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还原，B)还原。图91：DarpinTCB与KPL-4细胞(Her2+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。图92：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对KPL-4细胞由DarpinTCB抗体(SEQIDNO:376、377、378)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC)。图93：hIgG1DDKKTCB分子的图示。图94：CE-SDS分析。作为hIgG1DDKKTCB(SEQIDNO:372、373、374、375)的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还原，B)还原。图95：hIgG1DDKKTCB(SEQIDNO:372、373、374、375)与MV-3黑素瘤细胞(MCSP+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。图96：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对MV-3(中等MCSP)由hIgG1DDKKTCB抗体(SEQIDNO:372、373、374、375)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC)。发明详述定义除非下文中另外定义，否则术语如本领域通常所用那样在本文使用。如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广意义上指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白和其衍生物，例如其片段。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够与至少两个不同的抗原决定簇特异性结合。一般地，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇特异。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子是能够同时结合两个抗原决定簇，尤其两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。如本文所用的术语“价”指抗原结合分子中存在特定数目的抗原结合位点。因而，术语“与一种抗原单价结合”指抗原结合分子中存在一个(和不多于一个)对该抗原特异的抗原结合位点。“抗原结合位点”涉及一个抗原结合分子中提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基。一个天然免疫球蛋白分子一般具有两个抗原结合位点，一个Fab分子一般具有单个抗原结合位点。如本文所用，术语“抗原结合部分”指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合部分能够将与之连接的实体(例如第二抗原结合部分)引向靶部位，例如引向携带抗原决定簇的特定类型肿瘤细胞或肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合部分能够经靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)激活信号传导。抗原结合部分包含抗体及其片段，以及如本文进一步限定的结合蛋白和支架。特定抗原结合部分包含抗体的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。其他抗原结合部分包含一种结合蛋白，所述结合蛋白包含至少一个锚蛋白重复基序和单结构域抗原结合(SDAB)分子。在某些实施方案中，抗原结合部分可以包含如本文进一步限定和本领域已知的抗体恒定区。可用重链恒定区包括以下五个同种型的任一种：α、δ、ε、γ或μ。有用的轻链恒定区包括以下两个同种型的任一种：κ和λ。如本文所用，术语“抗原决定簇”同义于“抗原”和“表位”并且指多肽大分子上与抗原结合部分结合，形成抗体抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如一段连续氨基酸或由不同区域的不连续氨基酸构成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以存在于例如肿瘤细胞表面上、病毒感染细胞表面上、其他患病的细胞表面上、免疫细胞表面上找到、游离于血清中，和/或在存在于胞外基质(ECM)中。除非另外说明，否则本文中称作抗原的蛋白质(例如MCSP、FAP、CEA、EGFR、CD33、CD3)可以是来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类(例如人类)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然形式的蛋白质。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在提到本文中具体蛋白质的情况下，本术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质以及因细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。本术语还涵盖天然存在的蛋白质，例如，剪接变体或等位变体。可用作抗原的示例性人蛋白质包括但不限于：黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，也称作硫酸软骨素蛋白聚糖4(UniProt编号Q6UVK1(第70版)，NCBIRefSeqno.NP_001888.2)；成纤维细胞活化蛋白(FAP)，也称作Seprase(UniProt编号Q12884，Q86Z29、Q99998、NCBI登录号NP_004451)；癌胚抗原(CEA)，也称作癌胚抗原相关的细胞黏附分子5(UniProt编号P06731(第119版)，NCBIRefSeqno.NP_004354.2)；CD33，也称作gp67或Siglec-3(UniProt编号P20138，NCBI登录号NP_001076087，NP_001171079)；表皮生长因子受体(EGFR)，也称作ErbB-1或Her1(UniProt编号P0053，NCBI登录号NP_958439，NP_958440)，和CD3，尤其CD3ε亚基(参见UniProt编号P07766(第130版)，NCBINCBIRefSeqno.NP_000724.1，人序列SEQIDNO:265；或UniProt编号Q95LI5(第49版)，NCBIGenBankno.BAB71849.1，食蟹猴[Macacafascicularis]序列SEQIDNO:266)。在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子与来自不同物种的T细胞活化抗原或靶抗原之间保守的T细胞活化抗原表位或靶细胞抗原表位结合。如本文所用，术语“特异性结合”意指结合作用对抗原具有选择性并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等人,GlycoJ17,323-329(2000))和常规结合测定法(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))测量。在一个实施方案中，抗原结合部分与不相关蛋白质结合的程度小于抗原结合部分与抗原结合的程度约10％，如通过SPR测量。在某些实施方案中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。“亲和力”指分子(例如，受体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，配体)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗原结合部分和抗原，或受体和其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是koff和kon)的比例。因此，等同亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同即可。亲和力可以由本领域已知的既定方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的具体方法是表面等离子体共振法(SPR)。“减少的结合作用”，例如减少的Fc受体结合作用，指相应相互作用的亲和力下降，如通过例如SPR测量。为清晰起见，该术语还包括亲和力减少到零(或低于分析方法的检测限)，即相互作用完全消除。相反，“增加的结合作用”指相应相互作用的结合亲和力增加。如本文所用，“T细胞活化抗原”指在T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的表面上表达的抗原决定簇，其中与抗原结合分子相互作用时，所述抗原决定簇能够诱导T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与T细胞活化抗原相互作用可以通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联，诱导T细胞活化。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原是CD3。如本文所用，“T细胞活化”指T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的一种或多种细胞反应，所述细胞反应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物表达。活化T细胞的本发明双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定法是本领域已知和本文所述的。如本文所用，“靶细胞抗原”指呈递在靶细胞(例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质的细胞)表面上的抗原决定簇。如本文所用，当存在多于一个每种类型的部分时，相对于抗原结合部分等而言，使用术语“第一”和“第二”便利区分。使用这些术语不意在赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定顺序或方向，除非明确地如此陈述。“Fab分子”指由免疫球蛋白重链(“Fab重链”)的VH结构域和CH1结构域及其轻链(“Fab轻链”)的VL结构域和CL结构域的组成的蛋白质。“融合”意指各组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接或通过一个或多个肽接头由肽键连接。“交换Fab分子(也称作“Crossfab”)意指一种Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换，即交换Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区组成的肽链，和由重链可变区和轻链恒定区组成的肽链。为了清晰，在其中Fab轻链和Fab重链的可变区交换的交换Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称作交换Fab分子的“重链”。相反，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定区交换的交换Fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称作交换Fab分子的“重链”。术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链域或重链可变域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变域，随后一个恒定轻链(CL)结构域，也称作轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以归属5个类之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某个类可以划分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类之一，称作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,NatMed9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,引自ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人,NatMed9,129-134(2003)；和Hollinger等人,ProcNatlAcadSciUSA90,6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人,NatMed9,129-134(2003)中描述。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。术语“抗原结合结构域”指抗体的部分，所述部分包含与部分或完整抗原特异性结合并且与之互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称作抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。术语“包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白”指如通过引用纳入本文的WO2002/020565和WO2012069655所述的结合蛋白。这些结合蛋白也称作“DARPins”(设计的锚蛋白重复序列蛋白的首字母缩略词)并且是以遗传方式工程化的抗体模拟蛋白质，其通常显示高度特异性和高亲和力靶蛋白结合作用。它们衍生自天然锚蛋白并由至少一个重复基序组成。Zahnd,C.等人,J.Mol.Biol.(2007)369,1015-1028中描述了靶向HER2的包含至少一个锚蛋白重复基序的示例性结合蛋白。本发明中还包含其他结合蛋白如基于纤连蛋白III型结构域的Adenctin、基于脂笼蛋白的抗运载蛋白(Anticalin)、基于遍在蛋白的Affilins、基于转铁蛋白的Transbody、基于蛋白A结构域的亲和体、基于四连接素结构域的TrimerX、基于Cys丰富结构域的MicroProtein、基于FynSH3结构域的Fynomer、基于EGFRA结构域的高亲和性多聚体(Avimers)、基于centyrin的Centyrin、基于Kuniz结构域的kalibitor和具有随机化结合区和抗体样行为的其他支架蛋白。术语“单结构域抗原结合分子”指由单个单体状抗体可变结构域组成的抗体片段，如(通过引用的方式完整并入本文的)EP0656946中所述。如同完整抗体，它能够选择性地与特定抗原结合。分子量仅为12–15kDa，单结构域抗体比两条蛋白质重链和两条轻链组成的常见抗体(150–160kDa)的小得多，并且甚至小于Fab片段(约50kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(约25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链和一个来自重链)。尤其，单结构域抗原结合分子是由一个可变结构域(VH)组成的单结构域可变重链，也称作自动可变重链(aVH)抗体。这些肽对抗原具有与完整抗体相似的亲和力，但是更耐热并且对去垢剂和高浓度脲更稳定。比较低的分子质量导致组织中的通透性更好，并且导致短血浆半寿期，原因是它们以肾方式消除。术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见，例如，Kindt等人,KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.，第91页(2007)。单个VH结构域或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文中使用的，术语“超变区”或“HVR”指抗体可变结构域中序列高度变化和/或形成结构定义的环(“超变环”)的每个区域。通常，天然4链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVRs)也称作“互补决定区”(CDR)，并且在谈及可变区的形成抗原结合区的部分时，这些术语在本文中可互换地使用。这种特定区域已经由Kabat等人,美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices)，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1983)描述并且由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中所述定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，谈及抗体或其变体的CDR的任一个定义的应用意在处于如本文中定义和使用的术语范围内。作为比较，下文在表A中描述了构成如上文所引用每篇参考文献所定义的CDR的适宜氨基酸残基。构成特定CDR的确切残基数数目将根据该CDR的序列和尺寸变动。根据抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定CDR。表A.CDR定义1CDRKabatChothiaAbM2VHCDR131-3526-3226-35VHCDR250-6552-5850-58VHCDR395-10295-10295-102VLCDR124-3426-3224-34VLCDR250-5650-5250-56VLCDR389-9791-9689-971根据Kabat等人(见下文)所述的编号惯例对表A中全部CDR定义编号2如表A中使用的具有小写体“b”的“AbM”指如OxfordMolecular“AbM”抗体建模软件所定义的CDR。Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号体系。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将这种Kabat编号体系应用至任何可变区序列，不依赖于除序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”指Kabat等人,美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices)，"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列)"(1983)所述的编号体系。除非另外说明，否则根据Kabat编号体系提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号。没有根据Kabat编号法系统对序列表的多肽序列编号。然而，将序列表的序列的编号转化成Kabat编号完全处于本领域普通技术人员的能力范围内。“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。抗体或免疫球蛋白的“类别”指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别抗体或免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该定义包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的界限可能略微变动，但是通常将人IgG重链Fc区定义为从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInteres,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU索引。如本文所用，Fc结构域的“亚基”指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链C末端恒定区的能够稳定自我缔合的多肽。例如，IgGFc结构域的亚基包含IgGCH2和IgGCH3恒定结构域。“促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰”是对肽主链的操作或对Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同型二聚体。如本文所用的促进缔合的修饰特别包括对需要缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一和第二亚基)各自所做的独立修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变一个或两个Fc结构域亚基的结构或电荷，从而使得它们的缔合分别在空间上或静电上有利。因此，(异)二聚化在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间发生，这可能在与每种亚基融合的其他组分(例如抗原结合部分)并非相同的含义上是不同的。在一些实施方案中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸置换。在一个具体实施方案中，促进缔合的修饰包含在Fc结构域的两个亚基的各自亚基中的独立氨基酸突变，特别地是氨基酸置换。在一个实施方案中，促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如，如PCT公开WO2009/089004中所述。通常，这种方法涉及将两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而同型二聚体形成在静电上变得不利，而异二聚化在静电上有利。术语“效应子功能”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。如本文所用，术语“工程、工程化的、工程化”视为包含对肽主链的任何操作或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括修饰氨基酸序列、糖基化模式或个别氨基酸的侧链基团，以及这些方案的组合。如本文所用的术语“氨基酸突变”意在涵盖氨基酸置换、缺失、插入和修饰。可以作出置换、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体拥有所需的特征，例如，与Fc受体结合减少或与另一种肽的缔合增加。氨基酸序列缺失和插入包括氨基端和/或羧基端缺失及插入氨基酸。特定的氨基酸突变是氨基酸置换。出于改变例如Fc区结合特征的目的，特别优选非保守氨基酸置换，即将一个氨基酸替换为另一个具有不同结构特性和/或化学特性的氨基酸。氨基酸置换包括由非天然存在的氨基酸替换或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR、基因合成等。构思了也可以使用通过除基因工程之外的方法(如化学修饰法)改变氨基酸侧链基团的方法。多种名称可以在本文中用来指示相同的氨基酸突变。例如，从Fc结构域第329位置处的脯氨酸置换成甘氨酸可以显示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。如本文所用，术语“多肽”指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任何链，并且不指特定长度的产物。因此，“多肽”定义内部包含肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用来指具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语，并且可以使用术语“多肽”替代这些术语的任一个或与之互换使用。术语“多肽”还意在指表达后修饰该多肽的产物、所述表达后修饰包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基团/封闭基团衍生化、蛋白酶剪切、或由非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但是不必然地从所指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式产生，包括通过化学合成产生。本发明多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有确定的三维结构，不过它们并不必然地具有这种结构。将具有确定三维结构的多肽称作折叠的，并且将不具备确定三维结构，但是反而可以采取众多不同构象的多肽称作解折叠的。“分离的”多肽或变体或其衍生物意指不处于其天然环境的多肽。不要求特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以从其天生或天然环境取出。出于本发明的目的，将宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质视为分离的，已经通过任何合适技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIXV4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：100乘以分数X/Y在X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如肽核酸(PNA)中存在的那样。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明目的，将载体中所含的编码多肽的重组多核苷酸视为分离的。分离的多核苷酸的其他例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括含于细胞内的多核苷酸分子，所述细胞通常含有该多核苷酸分子，但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式，和双链形式。本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包含调节元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。就核酸或多核苷酸具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列而言，它意指除了该多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多5个点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列同一。换而言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参考序列中至多5％的核苷酸缺失或用另一个核苷酸置换，或可以将参考序列中多个核苷酸直至5％的总核苷酸插入参考序列中。参考序列的这些改变可以在参考核苷酸序列的5’或3’端位置出现或在这些末端位置之间任何位置出现，个别地间插在参考序列中的残基之间或间插在参考序列内部的一个或多个连续群组中。实际来看，可以常规地使用已知的计算机程序，如上文对多肽讨论的那种(例如ALIGN-2)，确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。如本文中所用，术语“表达盒”指重组或合成地产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。一般而言，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子，连同其他序列。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“载体”或“表达载体”同义于“表达构建体”并且指用来在靶细胞中引入与之有效结合的特定基因并指导其表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量的稳定mRNA。一旦表达载体处靶细胞内部，通过细胞转录和/或翻译装置产生基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。宿主细胞是可以用来产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞、例如培养的哺乳动物细胞、如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，此处仅提到数种，其还包括含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。“活化性Fc受体”是这样的Fc受体，其中由抗体Fc结构域接合后，所述Fc受体激发了刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致抗体包覆的靶细胞被免疫效应细胞裂解的免疫机制。靶细胞是(通常借助相对于Fc区为N末端的蛋白质部分)与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞。如本文所用，术语“减低的ADCC”定义为在包围靶细胞的介质中在给定的抗体浓度，给定时间内借助以上定义的ADCC机制溶解的靶细胞的数目减少和/或在包围靶细胞的介质中在给定时间内借助ADCC机制实现给定数目的靶细胞裂解所需要的抗体浓度增加。ADCC减低是相对于相同抗体所介导的ADCC而言，其中使用相同的标准产生、纯化、配制和储存方法(它们是本领域技术人员已知的)，所述的相同抗体由相同类型宿主细胞产生，但是尚未工程化。例如，在其Fc结构域中包含减低ADCC的氨基酸置换的抗体所介导的ADCC的减低是相对于Fc结构域中无这个氨基酸置换的相同抗体所介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域熟知的(参见例如PCT公开号WO2006/082515或PCT专利申请号PCT/EP2012/055393)。药剂的“有效量”指在对其施用该药物的细胞或组织中产生生理变化所需的量。药剂(例如，药物组合物)的“治疗有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和持续实现前述结果所需要的时间段。药剂的治疗有效量例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不良作用。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。术语“药物组合物”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。“可药用载体”指药物组合物中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。实施方案的详述T细胞活化性双特异性抗原结合分子样式大多数抗体由两条重链和两条轻链组成。两条链对通常呈扁平或凹陷的抗原结合位点均有贡献。除这些常规抗体之外，羊驼、其他驼类(camelid)和鲨鱼还产生仅由重链组成的抗体。这些异常重链抗体的抗原结合位点仅由称作VH(自动可变重链)或单结构域可变重链的单结构域形成。单结构域可变重链作为重组蛋白容易地产生。单结构域可变重链的其他有利特征包括它们的尺寸小、溶解度高、热稳定性、再折叠能力和组织渗透作用良好。单结构域抗体例如在Wesolowski等人,MedMicrobiolImmunol(2009)198:157–174中描述。产生单结构域可变重链抗体的方法例如在通过引用方式完整并入本文的WO2012152823和WO2012056000中描述。这些单结构域可变重链抗体缺少轻链并且还可能缺少CH1结构域。因此，单结构域可变重链抗体的抗原结合位点仅由单结构域形成。单结构域抗原结合(SDAB)分子包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的分子。例子包括但不限于重链可变结构域、天然缺少轻链的结合分子、纳米体、衍生自常规4链抗体的单结构域、除衍生自抗体的那些之外的工程化结构域和单结构域支架。SDAB分子可以是现有技术的任何分子，或将来的任何单结构域分子。SDAB分子可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、鱼类、鲨鱼、山羊、兔和牛。这个术语还包括来自骆驼和鲨鱼之外的物种中的天然存在的单结构域抗体分子。在一个方面，SDAB分子可以衍生自鱼类中存在的免疫球蛋白的可变区，例如，从鲨鱼血清中存在的称作新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型衍生的那种可变区。产生从NAR可变区衍生的单结构域分子(“IgNAR”)的方法在WO03/014161和Streltsov(2005)ProteinSci.14:2901-2909中描述。根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称作缺少轻链的重链。这类单结构域分子例如在WO9404678和Hamers-Casterman,C.等人,(1993)Nature363:446-448中公开。出于清晰的目的，从天然缺少轻链的重链分子衍生的这种可变结构域在本文中称作VHH或纳米体(TM)，以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这种VHH分子可以衍生自骆驼属(Camelidae)物种，例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼。除骆驼属之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链分子；这类VHH处于本发明的范围内。SDAB分子已经由例如通过引用方式完整并入本文的EP0656946描述。SDAB分子可以是重组的、经CDR移植、人源化、骆驼化、去免疫化和/或在体外生成(例如，通过噬菌体展示法选择)。单结构域抗体可以通过用所需的抗原免疫单峰驼、骆驼、羊驼、羊驼或鲨鱼并随后分离编码重链抗体的mRNA来获得。通过逆转录和聚合酶链反应，产生含有数百万个克隆的单结构域抗体基因文库。筛选技术如噬菌体展示法和核糖体展示法帮助鉴定结合抗原的克隆。一种不同方法使用来自先前尚未免疫过的动物的基因文库。这类初始文库通常仅含有对所需抗原具有低亲和力的抗体，这需要利用借助随机诱变的亲和力成熟过程作为额外步骤。当已经鉴定到鉴定到最有力的克隆时，将它们的DNA序列优化，例如以改善它们对酶的稳定性。另一个目标是人源化以防止人类有机体对抗体的免疫反应。因为驼类VHH和人VH片段之间的同源性，所以人源化不带来问题。最终步骤是在大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或其他合适生物中翻译优化的单结构域抗体。备选地，单结构域抗体可以从具有4条链的常见鼠IgG或人IgG产生。过程是相似的，包括来自免疫供体或初始供体的基因文库和用于鉴定最特异性抗原的展示技术。在一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分由单结构域抗原结合分子组成。在某些实施方案中，单结构域抗原结合分子是人单结构域结合分子(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。在一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其中所述抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分由单结构域可变重链组成。在另一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分由单结构域可变重链组成。本发明的双特异性抗体可以包含一个或多个互换Fab片段。交换Fab片段是其中重链和轻链的可变区或恒定区交换的Fab片段。已经例如在WO2009080252、WO2009080253、WO2009080251、WO2009080254、WO2010/136172、WO2010/145792和EP专利申请号11178371.8中描述了包含交换Fab片段的双特异性抗体样式，所述文献通过引用方式并入本文。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含含有单结构域抗原结合分子的结合蛋白并且包含不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个包含单结构域抗原结合分子的抗原结合部分，所述抗原结合部分与另一个抗原结合部分融合，所述另一个抗原结合部分包含Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换。任选地，抗原结合部分通过肽接头彼此融合。在一个实施方案中，所述单结构域抗原结合分子与交换Fab分子的重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述单结构域抗原结合分子与交换Fab分子的轻链的N末端融合。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。在一个实施方案中，所述能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是单结构域抗原结合分子。在一个实施方案中，所述能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是如上文定义的单结构域可变重链。在本发明一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域。在一个实施方案中，所述Fc结构域是IgG、尤其IgG1或IgG4的Fc结构域。在具体实施方案中，Fc结构域还可以包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，如下文概述。在其他的具体实施方案中，Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换，如下文概述。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子或交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；c)第二抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和d)第三抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，b)能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子或交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；c)能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和d)能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中单结构域可变重链与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述第二和第三抗原结合部分与相同的靶细胞抗原结合。在一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分借助铰链区直接连接至Fc结构域。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分通过肽接头与Fc结构域连接。根据任一个以上实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分(例如抗原结合部分，Fc结构域)可以直接融合或通过本文中描述或本领域已知的多种接头、尤其包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。合适地，无免疫原性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常是在1和10之间、一般在2和4之间的数字。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个或多个与SEQIDNO:369、370和371至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:369、370和371。除抗体之外，还存在可以用来特异性结合靶分子的其他结合蛋白或结合结构域(例如Binz,H.K.,Amstutz,P.和Pluckthun,A.,Nat.Biotechnol.23,1257-1268,2005)。这样一个新类别的结合蛋白或结合结构域以设计的重复序列蛋白或设计的重复结构域为基础(WO2002/020565；Binz,H.K.,Amstutz,P.,Kohl,A.,Stumpp,M.T.,Briand,C,Forrer,P.,Grutter,M.G.和Pluckthun,A.,Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp,M.T.,Binz,H.K和Amstutz,P.,DrugDiscov.Today13,695-701,2008)。已经在1987年通过酿酒酵母、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中这样四种蛋白质之间的序列比较鉴定到锚蛋白重复序列蛋白。Breeden和Nasmyth报道了swi6p、cdcl0p、notch和lin-12的序列中一种大约33个残基重复单元的多个副本(Breeden和Nasmyth，1987)。后续在锚蛋白中发现这个重复单元的24个副本蛋白质导致将这种重复单元命名为锚蛋白重复序列(Lux等人,1990)。后来，已经在不同生物和病毒的数百种蛋白质中鉴定到这种重复单元(Bork,1993；SMART数据库,Schultz等人,2000)。这些蛋白质位于胞核、细胞质或胞外空间。这与如下事实一致：这些蛋白质锚蛋白重复结构域与二硫键无关并且因此与环境的氧化状态无关。每种蛋白质的重复单元数目从两个变动到多于20个(SMART数据库，Schultz等人,2000)。似乎要求最低的重复单元数目以形成稳定的折叠结构域(Zhang和Peng，2000)。在另一方面，还存在一个折叠结构域中具有最多六个重复单元的某种证据(Michaely和Bennet,1993)。WO2002/020565描述了怎样可以构建庞大的锚蛋白重复序列蛋白文库和它们的一般应用。这些设计的重复结构域利用重复序列蛋白的模块性质并拥有N末端和C末端封端模块以通过屏蔽该结构域的疏水核心，防止设计的重复结构域聚集(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.和Pluckthun,A.,FEBSletters539,2-6,2003)。WO2012069655描述了通过改善设计的锚蛋白重复结构域的C末端或N末端封端模块或C末端或N末端封端重复序列，优化重复序列蛋白。本发明中还包含其他结合蛋白如基于纤连蛋白III型结构域的Adenctin、基于脂笼蛋白的抗运载蛋白(Anticalin)、基于遍在蛋白的Affilins、基于转铁蛋白的Transbody、基于蛋白A结构域的亲和体、基于四连接素结构域的TrimerX、基于Cys丰富结构域的MicroProtein、基于FynSH3结构域的Fynomer、基于EGFRA结构域的高亲和性多聚体(Avimers)、基于centyrin的Centyrin、基于Kuniz结构域的kalibitor和具有随机化结合区和抗体样行为的其他支架蛋白。在本发明的一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在一个优选的实施方案中，所述其他抗原结合部分是包含两个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在另一个实施方案中，所述其他抗原结合部分是包含三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在本发明的一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中第二抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分是包含两个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在另一个实施方案中，所述第二抗原结合部分是包含三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。优选地所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含含有至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述重复结构域包含锚蛋白重复共有序列DxxGxTPLHLAaxxGpxpaVpxLLpxGADVNAx，其中“x”指任何氨基酸，""指任何氨基酸或缺失，“a”指具有非极性侧链的氨基酸，并且“p”指具有极性侧链的残基。在一个实施方案中，所述重复结构域包含锚蛋白重复序列共有序列DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx，在此“x”指任何氨基酸。在一个实施方案中，所述重复结构域包含锚蛋白重复序列基序D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1，其中1表示选自以下的氨基酸残基：A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；其中2表示选自以下的氨基酸残基：H、N和Y。本发明的双特异性抗体包含一个或多个互换Fab片段。交换Fab片段是其中重链和轻链的可变区或恒定区交换的Fab片段。已经例如在WO2009080252、WO2009080253、WO2009080251、WO2009080254、WO2010/136172、WO2010/145792和EP专利申请号11178371.8中描述了包含交换Fab片段的双特异性抗体样式，所述文献通过引用方式并入本文。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含含有至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，并且包含不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，所述结合蛋白包含与另一个抗原结合部分融合，所述另一个抗原结合部分包含Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换。任选地，抗原结合部分通过肽接头彼此融合。在一个实施方案中，所述包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白与交换Fab分子的重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白与交换Fab分子的轻链的N末端融合。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。在一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的所述第三抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的所述第三抗原结合部分是一种如上文定义的包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在一个实施方案中，所述能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是包含两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在本发明一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域。在一个实施方案中，所述Fc结构域是IgG、尤其IgG1或IgG4的Fc结构域。在具体实施方案中，Fc结构域还可以包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，如下文概述。在其他的具体实施方案中，Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换，如下文概述。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子或交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；c)第二抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中所述含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和d)第三抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，b)能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子或交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；c)能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其包含其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中所述含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和d)能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个实施方案中，所述第二和第三抗原结合部分与相同的靶细胞抗原结合。在一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分借助铰链区直接连接至Fc结构域。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分通过肽接头与Fc结构域连接。根据任一个以上实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分(例如抗原结合部分，Fc结构域)可以直接融合或通过本文中描述或本领域已知的多种接头、尤其包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。合适地，无免疫原性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常是在1和10之间、一般在2和4之间的数字。Fc结构域在本发明的一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含Fc结构域。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域由一对包含免疫球蛋白分子重链结构域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不多于一个Fc结构域。在本发明的一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgGFc结构域。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一个实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域。在一个更具体的实施方案中，Fc结构域是在位置S228(Kabat编号)包含氨基酸置换、尤其包含氨基酸置换S228P的IgG4Fc结构域。这个氨基酸置换减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人,DrugMetabolismandDisposition38,84-91(2010))。在又一个具体实施方案中，Fc结构域是人的。人IgG1Fc区的示例性序列在SEQIDNO:149中给出。促进异二聚化的Fc结构域修饰本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合部分，并且在一个实施方案中与Fc结构域的两个亚基的一者或另一者融合，因此Fc结构域的两个亚基一般包含于两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和后续二聚化导致两种多肽的几种可能组合。为了改善重组生产中T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产率和纯度，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽缔合的修饰因此是有利的。因此，在具体的实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。人IgGFc结构域的两个亚基之间蛋白质-蛋白质相互作用最广泛的位点处于Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施方案中，所述修饰处于Fc结构域的CH3结构域中。在一个具体实施方案中，所述修饰是所谓的“结入扣(knob-into-hole)”修饰，包括在Fc结构域的两个亚基的一者中的“结修饰”和在Fc结构域的两个亚基的另一者中的“扣修饰”。结入扣技术例如在US5,731,168；US7,695,936；Ridgway等人,ProtEng9,617-621(1996)和Carter，JImmunolMeth248,7-15(2001)中描述。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突出部分(“结”)并在第二多肽的界面中引入相应腔(“扣”)，从而可以将突出部分安置在腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同型二聚体形成。通过将源自第一多肽界面小氨基酸侧链替换为较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)，构建突出部分。通过将大氨基酸侧链替换为较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二多肽的界面中产生与突出部分具有相同或相似尺寸的互补“腔”。因此，在一个具体实施方案中，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3结构域内部产生可安置在第二亚基的CH3结构域内部腔中的突出部分，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3结构域内部产生腔，在所述腔内部可安置第一亚基的CH3结构域内部的突出部分。可以通过改变编码多肽的核酸产生突出部分和腔，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成产生。在一个具体实施方案中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中位置366处的苏氨酸残基由色氨酸残基替换(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中位置407处的酪氨酸残基由缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc结构域的第二亚基中位置366处的苏氨酸残基额外地由丝氨酸残基替换(T366S)并且位置368处的亮氨酸残基由丙氨酸残基替换(L368A)。在又一个实施方案中，在Fc结构域的第一亚基中位置354处的丝氨酸残基额外地由半胱氨酸残基替换(S354C)并且在Fc结构域的第二亚基中位置349处的酪氨酸残基额外地由半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫键，进一步稳定二聚体(Carter，JImmunolMethods248,7-15(2001))。在一个具体实施方案中，能够与T细胞活化抗原结合的抗原结合部分融合(任选地通过能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分)至(包含“结”修饰的)Fc结构域的第一亚基。不希望受理论约束，能够与T细胞活化抗原结合的抗原结合部分与含有结的Fc结构域亚基的融合物将(进一步)使包含两个能够与T细胞活化抗原结合的抗原结合部分的抗原结合分子的产生最小化(两个含有结的多肽的立体位阻)。在一个实施方案中，促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰包含介导静电转向效应的修饰，例如，如PCT公开WO2009/089004中所述。通常，这种方法涉及将两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而同型二聚体形成在静电上变得不利，而异二聚化在静电上有利。在一个方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合部分，所述抗原结合部分之一是能够与T细胞活化抗原特异性结合的Fab分子并且另一个抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子；其中第一抗原结合部分是(a)其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接的单链Fab分子，或(b)其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，和含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，其中已经修饰所述第一亚基和所述第二亚基以包含静电上有利于异二聚体形成的一个或多个带电荷的氨基酸。在一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变E356K、E357K和D399K和所述第二亚基包含氨基酸突变K370E、K409E和K439E。在另一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变K392D、K409D并且所述第二亚基包含氨基酸突变E356K、D399K(DDKK)。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分可以按多种构型彼此融合。图1中描述了示例性构型。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个这样的特定实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个甚至更具体的实施方案中，第一抗原结合部分是单链Fab分子。备选地，在一个具体实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，如果第一抗原结合部分是交换Fab分子，则第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合。在一个这样的备选实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合。在一个甚至更具体的实施方案中，第一抗原结合部分是单链Fab分子。备选地，在一个具体实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。在又一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab轻链的C末端与第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab轻链的N末端与第二抗原结合部分的Fab轻链的C末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个甚至更具体的实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。在其他实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个这样的特定实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个甚至更具体的实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合。特别地，在这些实施方案中，第一抗原结合部分能够与T细胞活化抗原特异性结合。在其他实施方案中，第一抗原结合部分能够与靶细胞抗原特异性结合。抗原结合部分可以与Fc结构域融合或彼此直接融合或通过包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。肽接头是本领域已知的并且在本文中描述。合适地，无免疫原性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，“n”通常是在1和10之间、一般在2和4之间的数字。使第一和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头是(G4S)2。适于连接第一和第二抗原结合部分的Fab重链的示例性肽接头是EPKSC(D)-(G4S)2(SEQIDNO:150和151)。另外，接头可以包含(一部分的)免疫球蛋白铰链区。特别地，当抗原结合部分与Fc结构域亚基的N末端融合时，它可以在具有或没有额外的肽接头的情况下通过免疫球蛋白铰链区或其部分融合。具有能够与靶细胞抗原特异性结合的单个抗原结合部分的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如如图1A、1B、1D、1E、1H、1I、1K或1M中所显示)是有用的，尤其在预期靶细胞抗原于高亲和力抗原结合部分结合之后内化的情况下。在这种情况下，多于一个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的存在可以增强靶细胞抗原的内化，因而减少其可获得性。然而，在许多其他情况下，有利的是具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(参见图1C、1F、1G、1J或1L中显示的例子)，例如以优化靶向靶位点或以允许靶细胞抗原交联。因此，在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子。在一个实施方案中，第三抗原结合部分能够特异性结合与第一或第二抗原结合部分相同的靶细胞抗原。在一个具体实施方案中，第一抗原结合部分能够与T细胞活化抗原特异性结合，并且第二和第三抗原结合部分能够与靶细胞抗原特异性结合。在一个实施方案中，第三抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个具体实施方案中，第二和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在这样的一个实施方案中，第一抗原结合部分是单链Fab分子。在一个这样的特定实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，如果第一抗原结合部分是交换Fab分子，则第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合。第二和第三抗原结合部分可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合。在一个具体实施方案中，第二和第三抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。在一个实施方案中，第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分。在一个具体实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个具体实施方案中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施方案中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由能够与靶细胞抗原特异性结合的免疫球蛋白分子和能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分组成，其中抗原结合部分是单链Fab分子或交换Fab分子，其任选地通过肽接头融合至免疫球蛋白重链之一的N末端。在一个备选实施方案中，第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一、第二和第三抗原结合部分、包含第一和第二亚基的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，和第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，和其中第三抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。在一个这样的特定实施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合。在本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子中，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合、任选地通过接头肽彼此融合。取决于第一和第二抗原结合部分的构型，第一抗原结合部分的Fab轻链可以在其C末端处与第二抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合，或第二抗原结合部分的Fab轻链可以在其C末端与第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合。第一和第二抗原结合部分的Fab轻链的融合进一步减少不配对的Fab重链和轻链错误配对，并且还减少为表达本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子所需要的质粒的数目。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链与肽接头共享羧基端肽键，所述肽接头转而与第一Fab重链共享羧基端肽键，所述第一Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VL-CL-接头-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4))，并包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含第二Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链与肽接头共享羧基端肽键，所述肽接头转而与第一Fab重链共享羧基端肽键，所述第一Fab重链转而与第二Fab重链共享羧基端肽键，所述第二Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VL-CL-接头-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在这些实施方案之一中，这种T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含第二Fab轻链多肽(VL-CL)。根据这些实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中第三Fab重链与Fc结构域亚基(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链可变区由轻链可变区替换)，所述第一Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VL-CH1-CH2-CH2(-CH4))，并包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区(VH-CL)和Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。在备选的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链恒定区由轻链恒定区替换)，所述第一Fab轻链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CL-CH2-CH2(-CH4))，并包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区(VL-CH1)和Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链可变区由轻链可变区替换)，所述第一Fab重链恒定区转而与第二Fab重链共享羧基端肽键，所述第二Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链恒定区由轻链恒定区替换)，所述第一Fab轻链恒定区转而与第二Fab重链共享羧基端肽键，所述第二Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在另外的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab重链与第一Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述第一Fab轻链可变区转而与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链可变区由轻链可变区替换)，所述第一Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab重链与第一Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述第一Fab重链可变区转而与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链恒定区由轻链恒定区替换)，所述第一Fab轻链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4))。在这些实施方案的一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含交换Fab轻链多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区(VH-CL)和Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在这些实施方案的其他实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含交换Fab轻链多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区(VL-CH1)和Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在这些实施方案的仍然其他实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fab轻链多肽共享羧基端肽键(VL-CH1-VL-CL)；包含这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fab轻链多肽共享羧基端肽键(VH-CL-VL-CL)；包含这样的多肽，其中Fab轻链多肽与Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述Fab轻链可变区转而与Fab重链恒定区共享羧基端肽键(VL-CL-VL-CH1)；或包含这样的多肽，其中Fab轻链多肽与Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述Fab重链可变区转而与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(VL-CL-VH-CL)。根据这些实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中第三Fab重链与Fc结构域亚基(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab轻链与第一Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述第一Fab轻链可变区转而与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab轻链，其中轻链恒定区由重链恒定区替换)(VL-CL-VL-CH1)；包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))；和包含这样的多肽，其中第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(VH-CL)。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab轻链与第一Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述第一Fab重链可变区转而与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab轻链，其中轻链可变区由重链可变区替换)(VL-CL-VH-CL)；包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))；和包含这样的多肽，其中第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(VL-CH1)。根据这些实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中第三Fab重链与Fc结构域亚基(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。根据任一个以上实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分(例如抗原结合部分，Fc结构域)可以直接融合或通过本文中描述或本领域已知的多种接头、尤其包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。合适地，无免疫原性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常是在1和10之间、一般在2和4之间的数字。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个或多个与SEQIDNO:372、373、374和375至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:372、373、374和375。减少Fc受体结合作用和/或效应子功能的Fc结构域修饰Fc结构域向T细胞活化性双特异性抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中良好蓄积的长血清半寿期和有利的组织-血液分布比例。然而，同时它可以导致将T细胞活化性双特异性抗原结合分子不需要地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。另外，Fc受体信号传导途径的共活化可以导致细胞因子释放，连同抗原结合分子的T细胞活化特性和长半寿期，这导致全身性施用时细胞因子受体的过度激活和严重副作用。活化除T细胞之外(携带Fc受体的)免疫细胞可以甚至降低T细胞活化性双特异性抗原结合分子的效力，原因在于T细胞可能被例如NK细胞潜在破坏。因此，在具体的实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域显示降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在这样的一个实施方案中，与天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)显示小于50％、优选地小于20％、更优选地小于10％和最优选地小于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比，小于50％、优选地小于20％、更优选地小于10％和最优选地小于5％的效应子功能。在一个实施方案中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)基本上不与Fc受体结合和/或不诱导效应子功能。在一个具体实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是人活化性Fcγ受体，更具体地人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的一种或多种。在一个具体实施方案中，效应子功能是ADCC。在一个实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，Fc结构域显示出与新生Fc受体(FcRn)基本上相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)显示出大于约70％、特别地大于约80％、更特别地大于约90％的天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时，实现与FcRn基本相似的结合。在某些实施方案中，与非工程化的Fc结构域相比，Fc结构域经工程化以具有对Fc受体降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突变减少Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。一般地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基的每一者中。在一个实施方案中，氨基酸突变减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，氨基酸突变减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在多于一个减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一个实施方案中，与包含非工程化Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子相比，包含工程化Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子显示出小于20％、特别地小于10％、更具体地小于5％对Fc受体的结合亲和力。在一个具体实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是人活化性Fcγ受体，更具体地人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地人FcγRIIIa。优选地，对这些受体中每种的结合作用减低。在一些实施方案中，对补体组分的结合亲和力、尤其对C1q的结合亲和力也减低。在一个实施方案中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力不减低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)显示出大于约70％的非工程化形式的Fc结构域(或包含所述非工程化形式的Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时，实现与FcRn的基本上相似结合，即保留Fc结构域对所述受体的结合亲和力。本发明的Fc结构域或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以显示出大于约80％和甚至大于约90％的这种亲和力。在某些实施方案中，与非工程化的Fc结构域相比，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域经工程化以具有减少的效应子功能。减少的效应子功能可以包括，但不限于以下一种或多种：补体依赖细胞毒性(CDC)减少、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)减少、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)减少、细胞因子分泌减少、抗原呈递细胞的免疫复合物介导的抗原摄取减少、与NK细胞结合减少、与巨噬细胞结合减少、与单核细胞结合减少、与多形核细胞结合减少、信号传导诱导的直接凋亡减少、靶结合型抗体的交联减少、树突细胞成熟减少、或T细胞引发作用减少。在一个实施方案中，减少的效应子功能是选自以下的一种或多种：CDC减少、ADCC减少、ADCP减少、和细胞因子分泌减少。在一个具体实施方案中，减少的效应子功能是减少的ADCC。在一个实施方案中，减低的ADCC小于20％的由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC。在一个实施方案中，减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329位置处的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329位置处的氨基酸置换。在一些实施方案中，Fc结构域包含氨基酸置换L234A和L235A。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域，尤其人IgG1Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，氨基酸置换是P329A或P329G，特别地是P329G。在一个实施方案中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸置换和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，进一步的氨基酸置换是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在具体的实施方案中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸置换。在更具体的实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”)。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域，尤其人IgG1Fc结构域。氨基酸置换的“P329GLALA”组合几乎完全消除人IgG1Fc结构域的Fcγ受体结合作用，如通过引用方式完整并入本文的PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中所述。PCT/EP2012/055393还描述了制备这类突变Fc结构域的方法和用于确定其特性如Fc受体结合作用或效应子功能的方法。与IgG1抗体相比，IgG4抗体显示减低的Fc受体结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG4Fc结构域，特别地人IgG4Fc结构域。在一个实施方案中，IgG4Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸置换，尤其氨基酸置换S228P。为了进一步减低其Fc受体结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施方案中，IgG4Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸置换，特别是氨基酸置换L235E。在另一个实施方案中，IgG4Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸置换，特别是氨基酸置换P329G。在一个具体实施方案中，IgG4Fc结构域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸置换，特别是氨基酸置换S228P、L235E和P329G。这类IgG4Fc结构域突变体和它们的Fcγ受体结合特性在通过引用方式完整并入本文的PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中描述。在一个具体实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，显示对Fc受体减少的结合亲和力和/或减少的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸置换L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1Fc结构域，或包含氨基酸置换S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4Fc结构域。在某些实施方案中，已经消除Fc结构域的N-糖基化。在这样的一个实施方案中，Fc结构域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是将天冬酰胺更换为丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)的氨基酸置换。除上文和PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中所述的Fc结构域之外，Fc受体结合作用和/或效应子功能减低的Fc结构域还包括置换Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个残基的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰，制备突变Fc结构域。遗传方法可以包括DNA编码序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序，验证正确的核苷酸变化。可以使用标准仪器如BIAcore仪器(GEHealthcare)和如可以通过重组表达获得的Fc受体，例如通过ELISA或通过表面等离子体共振法(SPR)容易地确定与Fc受体的结合作用。本文描述了一种这样的合适结合测定法。备选地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的人NK细胞，评价Fc结构域或活化细胞的包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。可以通过本领域已知的方法测量Fc结构域或包含Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的效应子功能。本文描述了测量ADCC的合适测定法。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的其他例子在美国专利号5,500,362；Hellstrom等人,ProcNatlAcadSciUSA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,ProcNatlAcadSciUSA82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，JExpMed166,1351-1361(1987)中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,ProcNatlAcadSciUSA95,652-656(1998)公开中的那种动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。在一些实施方案中，Fc结构域对补体组分、尤其对C1q的结合作用减少。因此，在Fc结构域经工程化以具有减少的效应子功能的一些实施方案中，所述减少的效应子功能包括减少的CDC。可以实施C1q结合测定法以确定T细胞活化性双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,JImmunolMethods202,163(1996)；Cragg等人,Blood101,1045-1052(2003)；和Cragg和Glennie，Blood103,2738-2743(2004))。抗原结合部分本发明的抗原结合分子是双特异的，即它包含能够与两个不同抗原决定簇特异性结合的至少两个抗原结合部分。根据本发明，抗原结合部分是Fab分子(即由各自包含可变区和恒定区的重链和轻链组成的抗原结合结构域)、单结构域抗原结合(SDAB)分子或蛋白质支架，如包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白(例如Darpin)。在一个实施方案中，所述Fab分子或单结构域抗原结合(SDAB)分子是人的。在另一个实施方案中，所述Fab分子或单结构域抗原结合(SDAB)分子是人源化的。在又一个实施方案中，所述Fab分子包含人重链恒定区和轻链恒定区。至少一个抗原结合部分是单链Fab分子或交换Fab分子。这类修饰防止来自不同Fab分子的重链和轻链错误配对，因而改善重组产生时本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产率和纯度。在可用于本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定单链Fab分子中，Fab轻链的C末端通过肽接头与Fab重链的N末端连接。肽接头允许Fab重链和轻链排列以形成有功能的抗原结合部分。适于连接Fab重链和轻链的肽接头例如包括(G4S)6-GG(SEQIDNO:152)或(SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG(SEQIDNO:153)。在可用于本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的具体交换Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的恒定区交换。在可用于本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的另一个交换Fab分子中，Fab轻链可变区和Fab重链可变区交换。在本发明的一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子是能够与靶细胞抗原(尤其肿瘤细胞抗原)和T细胞活化抗原同时结合。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够通过与靶细胞抗原和T细胞活化抗原同时结合，交联T细胞和靶细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，这类同时结合导致靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在一个实施方案中，这类同时结合导致T细胞活化。在其他实施方案中，这类同时结合导致T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的细胞反应，所述细胞反应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物表达。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子与T细胞活化抗原在不与靶细胞抗原同时结合的情况下的结合不导致T细胞活化。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够使T细胞的细胞毒活性再指向靶细胞。在一个具体实施方案中，所述再指向与MHC介导的靶细胞呈递肽抗原和/或T细胞的特异性无关。特别地，根据本发明任何实施方案的T细胞是细胞毒T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别地CD8+T细胞。T细胞活化抗原结合部分本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够与T细胞活化抗原结合的抗原结合部分(在本文中也称作“T细胞活化抗原结合部分”)。在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供与T细胞活化抗原的单价结合作用。T细胞活化抗原结合部分可以是常规的Fab分子或修饰的Fab分子，即单链或交换Fab分子，或单结构域抗原结合(SDAB)分子，或包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在其中存在包含于T细胞活化性双特异性抗原结合分子中的多于一个能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合部分的实施方案中，能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分优选地是修饰Fab分子。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原是CD3，特别是人CD3(SEQIDNO:265)或食蟹猴CD3(SEQIDNO:266)，最特别地是人CD3。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合部分对人CD3和食蟹猴CD3交叉反应(即与之特异性结合)。在一些实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的ε亚基。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与单克隆抗体H2C(在PCT公开号WO2008/119567中描述)竞争结合CD3的表位。在另一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与单克隆抗体V9(在Rodrigues等人,IntJCancerSuppl7,45-50(1992)和美国专利号6,054,297中描述)竞争结合CD3的表位。在又一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与单克隆抗体FN18(在Nooij等人,EurJImmunol19,981-984(1986)中描述)竞争结合CD3的表位。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与单克隆抗体SP34(在Pessano等人,EMBOJ4,337-340(1985)中描述)竞争结合CD3的表位。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分结合与单克隆抗体SP34相同的CD3表位。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含SEQIDNO:163的重链CDR1、SEQIDNO:165的重链CDR2、SEQIDNO:167的重链CDR3、SEQIDNO:171的轻链CDR1、SEQIDNO:173的轻链CDR2和SEQIDNO:175的轻链CDR3。在又一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含与SEQIDNO:169至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:177至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含SEQIDNO:249的重链CDR1、SEQIDNO:251的重链CDR2、SEQIDNO:253的重链CDR3、SEQIDNO:257的轻链CDR1、SEQIDNO:259的轻链CDR2和SEQIDNO:261的轻链CDR3。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与下述抗原结合部分竞争结合CD3的表位，所述抗原结合部分包含SEQIDNO:249的重链CDR1、SEQIDNO:251的重链CDR2、SEQIDNO:253的重链CDR3、SEQIDNO:257的轻链CDR1、SEQIDNO:259的轻链CDR2和SEQIDNO:261的轻链CDR3。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分结合与下述抗原结合部分相同的CD3表位，所述抗原结合部分包含SEQIDNO:249的重链CDR1、SEQIDNO:251的重链CDR2、SEQIDNO:253的重链CDR3、SEQIDNO:257的轻链CDR1、SEQIDNO:259的轻链CDR2和SEQIDNO:261的轻链CDR3。在又一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含与SEQIDNO:255至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:263至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与下述抗原结合部分竞争结合CD3的表位，所述抗原结合部分包含SEQIDNO:255的重链可变区序列和SEQIDNO:263的轻链可变区序列。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分结合与下述抗原结合部分相同的CD3表位，所述抗原结合部分包含SEQIDNO:255的重链可变区序列和SEQIDNO:263的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含SEQIDNO:255的重链可变区序列的人源化形式和SEQIDNO:263的轻链可变区序列的人源化形式。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含SEQIDNO:249的重链CDR1、SEQIDNO:251的重链CDR2、SEQIDNO:253的重链CDR3、SEQIDNO:257的轻链CDR1、SEQIDNO:259的轻链CDR2和SEQIDNO:261的轻链CDR3，以及人重链和轻链的可变区构架序列。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含选自SEQIDNO:270、SEQIDNO:271和SEQIDNO:272的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQIDNO:274、SEQIDNO:275、SEQIDNO:276的至少一个轻链CDR。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含选自SEQIDNO:269、SEQIDNO:298和SEQIDNO:299的氨基酸序列，所述可变轻链包含选自SEQIDNO:273和SEQIDNO:297的氨基酸序列。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQIDNO:269的氨基酸序列，所述可变轻链包含SEQIDNO:273的氨基酸序列。靶细胞抗原结合部分本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分(在本文中也称作“靶细胞抗原结合部分”)。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分。在一个这样的特定实施方案中，这些抗原结合部分各自与相同的抗原决定簇特异性结合。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不多于两个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分。靶细胞抗原结合部分可以是常规的Fab分子或修饰的Fab分子，即单链或交换Fab分子，或单结构域抗原结合(SDAB)分子，或包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。靶细胞抗原结合部分与特定抗原决定簇结合并且能够使T细胞活化性双特异性抗原结合分子指向靶部位，例如指向携带该抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。在某些实施方案中，使靶细胞抗原结合部分指向与病理状况相关的抗原，如肿瘤细胞上或病毒感染的细胞上呈递的抗原。合适的抗原是细胞表面抗原，例如，但是不限于细胞表面受体。在具体的实施方案中，抗原是人抗原。在一个具体实施方案中，靶细胞抗原选自成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)特异的至少一个抗原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体LC007(参见SEQIDNO:75和83，和欧洲专利申请号EP11178393.2，其通过引用方式完整并入本文)竞争结合MCSP表位的抗原结合部分。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:69的重链CDR1、SEQIDNO:71的重链CDR2、SEQIDNO:73的重链CDR3、SEQIDNO:77的轻链CDR1、SEQIDNO:79的轻链CDR2和SEQIDNO:81的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:75至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:83至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体M4-3ML2(参见SEQIDNO:239和247，和欧洲专利申请号EP11178393.2，其通过引用方式完整并入本文)竞争结合MCSP表位的抗原结合部分。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分结合与单克隆抗体M4-3ML2相同的MCSP表位。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:233的重链CDR1、SEQIDNO:235的重链CDR2、SEQIDNO:237的重链CDR3、SEQIDNO:241的轻链CDR1、SEQIDNO:243的轻链CDR2和SEQIDNO:245的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:239至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、尤其约98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:247至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、尤其约98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含单克隆抗体M4-3ML2的亲和力成熟形式的重链可变区序列和轻链可变区序列。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个、尤其两个、三个、四个或五个氨基酸置换的SEQIDNO:239的重链可变区序列；和具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个、尤其两个、三个、四个或五个氨基酸置换的SEQIDNO:247的轻链可变区序列。可变区序列内部的任何氨基酸残基，包括CDR区内部的氨基酸残基，可以被不同氨基酸置换，条件是与MCSP、特别人MCSP的结合作用保留。优选的变体是对MCSP的结合亲和力至少等于(或强于)包含未置换的可变区序列的抗原结合部分的结合亲和力的那些变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:1的多肽序列、SEQIDNO:3的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:7的多肽序列、SEQIDNO:9的多肽序列和SEQIDNO:11的多肽序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:13的多肽序列、SEQIDNO:15的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:17的多肽序列、SEQIDNO:19的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:21的多肽序列、SEQIDNO:23的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:25的多肽序列、SEQIDNO:27的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:29的多肽序列、SEQIDNO:31的多肽序列、SEQIDNO:33的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:29的多肽序列、SEQIDNO:3的多肽序列、SEQIDNO:33的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:35的多肽序列、SEQIDNO:3的多肽序列、SEQIDNO:37的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:39的多肽序列、SEQIDNO:3的多肽序列、SEQIDNO:41的多肽序列和SEQIDNO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:29的多肽序列、SEQIDNO:3的多肽序列、SEQIDNO:5的多肽序列和SEQIDNO:179的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:5的多肽序列、SEQIDNO:29的多肽序列、SEQIDNO:33的多肽序列和SEQIDNO:181的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:5的多肽序列、SEQIDNO:23的多肽序列、SEQIDNO:183的多肽序列和SEQIDNO:185的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:5的多肽序列、SEQIDNO:23的多肽序列、SEQIDNO:183的多肽序列和SEQIDNO:187的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:33的多肽序列、SEQIDNO:189的多肽序列、SEQIDNO:191的多肽序列和SEQIDNO:193的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:183的多肽序列、SEQIDNO:189的多肽序列、SEQIDNO:193的多肽序列和SEQIDNO:195的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:189的多肽序列、SEQIDNO:193的多肽序列、SEQIDNO:199的多肽序列和SEQIDNO:201的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:5的多肽序列、SEQIDNO:23的多肽序列、SEQIDNO:215的多肽序列和SEQIDNO:217的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:5的多肽序列、SEQIDNO:23的多肽序列、SEQIDNO:215的多肽序列和SEQIDNO:219的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含选自SEQIDNO:280、SEQIDNO:281、SEQIDNO:282、SEQIDNO:301、SEQIDNO:303、SEQIDNO:304和SEQIDNO:306的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQIDNO:284、SEQIDNO:285、SEQIDNO:286、SEQIDNO:310、SEQIDNO:311、SEQIDNO:314、SEQIDNO:315和SEQIDNO:316的至少一个轻链CDR。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含选自SEQIDNO:280、SEQIDNO:281和SEQIDNO:282的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQIDNO:284、SEQIDNO:285和SEQIDNO:286的至少一个轻链CDR。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:280的重链CDR1、SEQIDNO:281的重链CDR2、SEQIDNO:282的重链CDR3、SEQIDNO:284的轻链CDR1、SEQIDNO:285的轻链CDR2和SEQIDNO:286的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所述变重链包含选自SEQIDNO:279、SEQIDNO:300、SEQIDNO:302、SEQIDNO:305和SEQIDNO:307的氨基酸序列，所述可变轻链包含选自SEQIDNO:283、SEQIDNO:309、SEQIDNO:312、SEQIDNO:313和SEQIDNO:317的氨基酸序列。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQIDNO:279的氨基酸序列，所述可变轻链包含SEQIDNO:283的氨基酸序列。在又一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:279至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:283至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO:278相同至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽序列、与SEQIDNO:319至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQIDNO:320至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQIDNO:321至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO:369至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQIDNO:370至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQIDNO:371至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO:372同至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽序列、与SEQIDNO:373至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQIDNO:374至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQIDNO:375至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由下述多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列编码与选自SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:234、SEQIDNO:236、SEQIDNO:238、SEQIDNO:240、SEQIDNO:242、SEQIDNO:244、SEQIDNO:246、SEQIDNO:248、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182、SEQIDNO:184、SEQIDNO:186、SEQIDNO:188、SEQIDNO:190、SEQIDNO:192、SEQIDNO:194、SEQIDNO:196、SEQIDNO:200、SEQIDNO:202、SEQIDNO:216、SEQIDNO:218、SEQIDNO:220和SEQIDNO:329至388的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对表皮生长因子受体(EGFR)特异的至少一个抗原结合部分。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体GA201竞争结合EGFR表位的抗原结合部分。参见通过引用方式完整并入本文的PCT公开WO2006/082515。在一个实施方案中，对EGFR特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:85的重链CDR1、SEQIDNO:87的重链CDR2、SEQIDNO:89的重链CDR3、SEQIDNO:93的轻链CDR1、SEQIDNO:95的轻链CDR2和SEQIDNO:97的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对EGFR特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:91至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:99至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:43的多肽序列、SEQIDNO:45的多肽序列和SEQIDNO:47的多肽序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:49的多肽序列、SEQIDNO:51的多肽序列和SEQIDNO:11的多肽序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:53的多肽序列、SEQIDNO:45的多肽序列和SEQIDNO:47的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54和SEQIDNO:12的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异的至少一个抗原结合部分。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体3F2竞争结合FAP表位的抗原结合部分。参见通过引用方式完整并入本文的PCT公开WO2012/020006。在一个实施方案中，对FAP特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:101的重链CDR1、SEQIDNO:103的重链CDR2、SEQIDNO:105的重链CDR3、SEQIDNO:109的轻链CDR1、SEQIDNO:111的轻链CDR2和SEQIDNO:113的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对FAP特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:107至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:115至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:55的多肽序列、SEQIDNO:51的多肽序列和SEQIDNO:11的多肽序列，或其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:57的多肽序列、SEQIDNO:59的多肽序列和SEQIDNO:61的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:52和SEQIDNO:12的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对癌胚抗原(CEA)特异的至少一个抗原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体BW431/26竞争(在欧洲专利号EP160,897和Bosslet等人,IntJCancer36,75-84(1985)中描述)结合CEA表位的抗原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体CH1A1A(参见SEQIDNO:123和131)竞争结合CEA表位的抗原结合部分。参见通过引用方式完整并入本文的PCT专利公开号WO2011/023787。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分结合与单克隆抗体CH1A1A相同的CEA表位。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:117的重链CDR1、SEQIDNO:119的重链CDR2、SEQIDNO:121的重链CDR3、SEQIDNO:125的轻链CDR1、SEQIDNO:127的轻链CDR2和SEQIDNO:129的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:123至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、尤其约98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:131至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、尤其约98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含单克隆抗体CH1A1A的亲和力成熟形式的重链可变区序列和轻链可变区序列。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个、尤其两个、三个、四个或五个氨基酸置换的SEQIDNO:123的重链可变区序列；和具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个、尤其两个、三个、四个或五个氨基酸置换的SEQIDNO:131的轻链可变区序列。可变区序列内部的任何氨基酸残基，包括CDR区内部的氨基酸残基，可以被不同氨基酸置换，条件是与CEA、特别人CEA的结合作用保留。优选的变体是对CEA的结合亲和力至少等于(或强于)包含未置换的可变区序列的抗原结合部分的结合亲和力的那些变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:63的多肽序列、SEQIDNO:65的多肽序列、SEQIDNO:67的多肽序列和SEQIDNO:33的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:65的多肽序列、SEQIDNO:67的多肽序列、SEQIDNO:183的多肽序列和SEQIDNO:197的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:183的多肽序列、SEQIDNO:203的多肽序列、SEQIDNO:205的多肽序列和SEQIDNO:207的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:183的多肽序列、SEQIDNO:209的多肽序列、SEQIDNO:211的多肽序列和SEQIDNO:213的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:34、SEQIDNO:184、SEQIDNO:198、SEQIDNO:204、SEQIDNO:206、SEQIDNO:208、SEQIDNO:210、SEQIDNO:212和SEQIDNO:214的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含选自SEQIDNO:290、SEQIDNO:291和SEQIDNO:292的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQIDNO:294、SEQIDNO:295和SEQIDNO:296的至少一个轻链CDR。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:290的重链CDR1、SEQIDNO:291的重链CDR2、SEQIDNO:292的重链CDR3、SEQIDNO:294的轻链CDR1、SEQIDNO:295的轻链CDR2和SEQIDNO:296的轻链CDR3。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQIDNO:289的氨基酸序列，所述可变轻链包含SEQIDNO:293的氨基酸序列。在又一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:289至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:293至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO:288同至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽序列、与SEQIDNO:322至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQIDNO:323至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQIDNO:324至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对CD33特异的至少一个抗原结合部分。在一个实施方案中，对CD33特异的抗原结合部分包含SEQIDNO:133的重链CDR1、SEQIDNO:135的重链CDR2、SEQIDNO:137的重链CDR3、SEQIDNO:141的轻链CDR1、SEQIDNO:143的轻链CDR2和SEQIDNO:145的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对CD33特异的抗原结合部分包含与SEQIDNO:139至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQIDNO:147至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:33的多肽序列、SEQIDNO:213的多肽序列、SEQIDNO:221的多肽序列和SEQIDNO:223的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO:33的多肽序列、SEQIDNO:221的多肽序列、SEQIDNO:223的多肽序列和SEQIDNO:225的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:34、SEQIDNO:214、SEQIDNO:222、SEQIDNO:224和SEQIDNO:226的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。多核苷酸本发明还提供编码如本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离多核苷酸。本发明的多核苷酸包括这些多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387和388中所述的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，包括其功能性片段或变体。编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸可以作为编码完整T细胞活化性双特异性抗原结合分子的单一多核苷酸表达或作为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经例如二硫键或其他手段结合以形成有功能的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。例如，抗原结合部分的轻链部分可以由来自T细胞活化性双特异性抗原结合分子的下述部分的分别的多核苷酸编码，所述部分包含抗原结合部分的重链部分、Fc结构域亚基和任选地另一个抗原结合部分(的一部分)。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽结合以形成抗原结合部分。在另一个例子中，包含两个Fc结构域亚基之一和任选地一个或多个抗原结合部分(的一部分)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子部分可以由这样的分离多核苷酸编码，所述分离的多核苷酸来自包含两个Fc结构域亚基中另一者和任选地抗原结合部分(的一部分)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子部分。当共表达时，Fc结构域亚基缔和以形成Fc结构域。在某些实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的片段，其包含第一和第二抗原结合部分和由两个亚基组成的Fc结构域，其中第一抗原结合部分是单链Fab分子。在一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第一抗原结合部分和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码其中单链Fab分子与Fc结构域亚基共享羧基端肽键的多肽。在另一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码其中Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽。在又一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第一抗原结合部分、第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中单链Fab分子与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在某些实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的片段，其包含第一和第二抗原结合部分和由两个亚基组成的Fc结构域，其中第一抗原结合部分是交换Fab分子。在一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第一抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在另一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码其中Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽。在又一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第一抗原结合部分的重链、第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链与Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述Fab轻链可变区转而与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链与Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述Fab重链可变区转而与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在其他实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第三抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码其中Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽。在其他实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码抗原结合部分的轻链。在一些实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键。在其他实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键。在另外的实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第一抗原结合部分的轻链和第二抗原结合部分的轻链。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fab轻链共享羧基端肽键。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链与Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述Fab重链可变区转而与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键。在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fab轻链共享羧基端肽键。在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链与Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述Fab轻链可变区转而与Fab重链恒定区共享羧基端肽键。在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码如SEQIDNO:75、83、91、99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255和263中所显示的可变区序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含了编码如SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284,285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327和328中所示多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明还涉及一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387或388中所示核苷酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387或388中所示的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码与SEQIDNO:75、83、91、99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255或263中的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的可变区序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码多肽序列的序列，所述多肽序列与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284,285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327或328中的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。本发明涵盖一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码具有保守氨基酸置换的SEQIDNO:75、83、91、99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255或263的可变区序列。本发明还涵盖一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码具有保守氨基酸置换的SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284,285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327或328的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，处于信使RNA(mRNA)形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。重组方法本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。为了重组生产，将编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的一个或多个多核苷酸(例如，如上文所述)分离并插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离这种多核苷酸并将其测序。在一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。本领域技术人员熟知的方法可以用来构建表达载体，所述表达载体含有T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列，连同适宜的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1989)和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的部分，或可以是核酸片段。表达载体包括将编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)以与启动子和/或其他转录或翻译控制元件有效连接的方式克隆的表达盒。如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但是如果存在的话，可以将它视为编码区的部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等，均不是编码区的部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如存在于单一载体上或存在于分立的多核苷酸构建体中，例如存在于分立(不同)的载体上。另外，任何载体可以含有单个编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如，本发明的载体可以编码一种或多种多肽，所述多肽借助蛋白酶剪切作用以翻译后方式或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸或变体或其衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于专用元件或基序，如分泌信号肽或异源功能性结构域。有效连接是以下情况，此时基因产物(例如多肽)的编码区与一种或多种调节序列以如此方式连接，从而将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA转录并且如果两个DNA片段之间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则这两个DNA片段(如多肽编码区和与之连接的启动子)是“有效连接”的。因而，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，则该启动子区与该核酸有效连接。启动子可以是指导DNA仅在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。其除启动子之外的他转录控制元件，例如增强子、操纵基因、阻遏蛋白和转录终止信号，可以与多核苷酸有效连接以指导细胞特异转录。本文中公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于，在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，例如，但不限于，来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，连同内含子-A一起)、猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α-珠蛋白的那些，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。额外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称作CITE序列)。表达盒也可以包括其他特征如复制起点，和/或染色体整合元件如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的额外编码区连接，所述分泌肽或信号肽指导由本发明多核苷酸编码的多肽分泌。例如，如果需要分泌T细胞活化性双特异性抗原结合分子，则可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的核酸上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一旦已经启动正在增长的蛋白质链跨糙面内质网输出则从成熟蛋白切下的信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽N末端融合的信号肽，所述信号肽从翻译的多肽被切下以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链的信号肽，或该序列的功能衍生物，所述功能衍生物保留指导与该序列有效连接的多肽分泌的能力。备选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤维蛋白溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替换。SEQIDNO:154-162中给出分泌信号肽的示例性氨基酸序列和多核苷酸序列。可以在编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸的内部或末端处包含编码短蛋白质序列的DNA，所述短蛋白质序列可以用来促进稍后的纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在又一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一种或多种本发明载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以分别相对于多核苷酸和载体，单独或以组合方式合并本文中所述的任一特征。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已经用所述载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中产生多肽，特别是当不需要糖基化时可以在细菌中产生多肽。在表达后，可以将多肽从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化多肽。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的多肽。见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)和Li等人,NatBiotech24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如Graham等人,JGenVirol36,59(1977)中所述那样)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(TM4细胞如在例如Mather,BiolReprod23,243-251(1980)中所述那样)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(HepG2)、小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如在例如Mather等人,AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982中所述那样))、MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适于产生蛋白质的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如，培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，此处仅提到数种，其还包括含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选地是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。本领域已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。表达包含抗原结合结构域的重链或轻链的多肽(如抗体)的细胞可以如此工程化，从而还表达抗体的其他链，从而表达产物是具有重链和轻链的抗体。在一个实施方案中，提供了产生本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其中所述方法包括在适于表达T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养如本文中提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，并且从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收T细胞活化性双特异性抗原结合分子。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分以遗传方式彼此融合。可以如此设计T细胞活化性双特异性抗原结合分子，从而其组分彼此直接融合或通过接头序列间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法确定并且可以就功效进行测试。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的不同组分之间接头序列的例子存在于本文提供的序列中。如果需要，也可以包括额外的序列以并入切割位点以便分隔融合物的各种组分，例如内肽酶识别序列。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个或多个抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的部分，并且可变区可以衍生自天然或非天然存在的抗体及其片段。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如Harlow和Lane，"Antibodies,alaboratorymanual",ColdSpringHarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成法构建，可以重组产生(例如，如美国专利号4,186,567中所述)，或可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(见例如授予McCafferty的美国专利号5,969,108)。任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中。可用于本发明中的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠源、灵长类源或人源的。如果T细胞活化性双特异性抗原结合分子意欲用于人类，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人类。也可以根据本领域熟知的方法制备人源化或完全人形式的抗体(见例如授予Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，所述方法包括但不限于(a)在保留或不保留关键构架残基(例如对保留良好抗原结合亲和力或抗体功能重要的那些残基)的情况下，将非人类(例如，供体抗体)CDR移植到人类(例如受体抗体)构架和恒定区上，(b)仅将非人类特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人构架和恒定区上，或(c)移植整个非人类可变结构域，但是通过更换表面残基用人样部分“掩蔽”它们。人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro和Fransson,FrontBiosci13,1619-1633(2008)中综述，并且例如还在Riechmann等人,Nature332,323-329(1988)；Queen等人,ProcNatlAcadSciUSA86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature321,522-525(1986)；Morrison等人,ProcNatlAcadSci81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,AdvImmunol44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR移植)；Padlan,MolImmunol28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods36,61-68(2005)和Klimka等人,BrJCancer83,252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。人抗体和人可变区可以使用本领域已知的多种技术产生。人抗体总体上在vanDijk和vandeWinkel,CurrOpinPharmacol5,368-74(2001)和Lonberg,CurrOpinImmunol20,450-459(2008)中描述。人可变区可以形成通过杂交瘤方法产生的人单克隆抗体的部分，并且人可变区可以衍生自所述人单克隆抗体(见例如MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications(单克隆抗体生产技术及应用)，第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。人抗体和人可变区也可以通过施用免疫原至转基因动物制备，其中所述转基因动物已经被修饰以应答于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(见例如Lonberg，NatBiotech23,1117-1125(2005)。也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体和人可变区(见例如，Hoogenboom等人,引自MethodsinMolecularBiology178，1-37(O'Brien等人编著,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人,Nature348,552-554；Clackson等人,Nature352,624-628(1991))。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。在某些实施方案中，根据例如在美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，将用于本发明中的抗原结合部分工程化以具有增强的结合亲和力，所述文献的完整内容因而通过引用的方式并入。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振技术(在BIACORET100系统上分析)(Liljeblad等人,GlycoJ17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))，测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子与特定抗原决定簇结合的能力。竞争测定法可以用来鉴定与参考抗体竞争结合至特定抗原的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变结构域，例如，与V9抗体竞争结合至CD3的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与参考抗体结合的相同表位(例如线性表位或构象表位)结合。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols(表位定位法)”,引自MethodsinMolecularBiology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。在示例性竞争测定法中，将固定的抗原(例如CD3)在溶液中温育，所述溶液包含与该抗原结合的第一标记抗体(例如V9抗体)和正在测试与第一抗体竞争结合至该抗原的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的抗原在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与该抗原结合的条件下温育后，移除过多的未结合的抗体，并且测量与固定抗原结合的标记物的量。如果与固定抗原结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体正在与第一抗体竞争结合至该抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。如本文所述那样制备的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以通过现有已知的技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸多因素，如净电荷、疏水性、亲水性等并且将是本领域技术人员显而易见的。对于亲和层析纯化，可以使用与T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于T细胞活化性双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实施例中所述，依次的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析可以用来分离T细胞活化性双特异性抗原结合分子。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的纯度可以由多种熟知分析方法的任一种方法确定，所述熟知分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。例如，显示如中所述那样表达的重链融合蛋白是完整的并且正确装配，如还原性SDS-PAGE所展示(参见例如图2)。在大约相对分子量25,000、相对分子量50,000和相对分子量75,000处分离出三个条带，所述相对分子量对应于T细胞活化性双特异性抗原结合分子的轻链，重链和重链/轻链融合蛋白的预测分子量。测定法可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的物理/化学特性和/或生物学活性。亲和力测定法可以根据实施例中所述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪(GEHealthcare)确定T细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力，并且例如可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。备选地，T细胞活化性双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合作用可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，例如通过流式细胞术(FACS)评价。在下文及在下文实施例中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。根据一个实施方案，使用T100仪(GEHealthcare)在25℃通过表面等离子体共振法测量KD。为了分析Fc部分和Fc受体之间的相互作用，加His标签的重组Fc受体由CM5芯片上固定的抗五His抗体(Qiagen)捕获并且使用特异性构建体作为分析物。简而言之，根据供应商说明书，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GEHealthcare)。将抗五His抗体用10mM乙酸钠，pH5.0稀释至40μg/ml，随后以5μl/min的流速上样以实现所偶联蛋白的大约6500个响应单位(RU)。在配体上样后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。随后，在4或10nM捕获Fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释物(范围在500nM和4000nM之间)在HBS-EP(GEHealthcare，10mMHEPES，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)中于25℃按30μl/min流速上样120秒。为了确定对靶抗原的亲和力，如对抗五His抗体所述那样，通过活化的CM5传感芯片表面上固定的抗人Fab特异性抗体(GEHealthcare)捕获双特异性构建体。偶联的蛋白质的最终量是大约12000RU。在300nM捕获双特异性构建体90秒。使靶抗原以250nM至1000nM的浓度范围通过流动小室持续180秒，流速30μl/分钟。监测解离过程180秒。通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率差异。通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合，将稳态响应用来导出解离常数KD。使用简单一对一Langmuir结合模型(T100评价软件1.1.1版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,JMolBiol293,865-881(1999)。活性测定法可以通过如实施例中所述的多种测定法测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的生物活性。生物活性可以例如包括诱导T细胞增殖、诱导中T细胞的信号传导、诱导的T细胞中的活化标志物表达、诱导T细胞分泌细胞因子、诱导靶细胞(如肿瘤细胞)溶解和诱导肿瘤消退和/或改善存活。组合物、制剂和施用途径在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物，例如，用于下述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分子和可药用载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分子和至少一种额外治疗药，例如，如下文描述。进一步提供一种产生处于适于体内施用形式的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括(a)获得本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，和(b)将T细胞活化性双特异性抗原结合分子与至少一种药学可接受载体配制，因而配制了用于体内施用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制剂。本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶解或分散于可药用载体中的一种或多种T细胞活化性双特异性抗原结合分子。短语“可药用或药理学可接受的”指在使用的剂量和浓度通常对接受者无毒，即施用至动物(如果适宜，例如人)时不产生不良、变应性或其他不利反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子并任选地含有额外有效成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990所例举，所述文献通过引用方式并入本文。另外，对于动物(例如，人类)施用，应当理解制品应当满足如FDA生物学标准办公室或其他国家的相应权力机关所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液剂。如本文所用，“可药用载体”包括任何和全部溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌药、抗真菌药)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这类相似材料及其组合，这是本领域普通技术人员已知的(见例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990,第1289-1329页，所述文献通过引用方式并入本文)。除了任何常规载体与有效成分不相容的情况下之外，构思了所述载体在治疗组合物或药物组合物中的用途。该组合物可以包含不同类型的载体，这取决于它是否将以固态、液态或气溶胶形式施用及作为注射剂对这类施用途径而言它是否需要是无菌的。可以将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(和任何其它的治疗药)按静脉内、真皮内、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内地、直肠内、瘤内、肌内、腹腔内、皮下、结膜下的、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼球内、口服、局部、局部方式、通过吸入(例如气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接局限化灌流浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在膏料中、在脂质组合物(例如脂质体)中或通过其他方法或前述方法的任何组合施用，这是本领域普通技术人员已知的(参见，例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPrintingCompany，1990，通过引用方式并入本文)。肠胃外施用，尤其静脉内注射，最常使用于施用多肽分子，如本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。肠胃外组合物包括设计成通过注射例如皮下、真皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些组合物。对于注射剂，可以将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在水溶液中、优选地在生理相容性缓冲液如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水中配制。所述溶液可以含有配制剂如助悬剂、增溶剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以处于使用前与合适溶媒(例如，无菌无热原水)粉末构成的形式。通过以下方式制备无菌可注射溶液剂：将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子按要求的量，根据需要连同下文列举的多种其他成分一起并入适宜的溶剂中。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。通常，通过将多种消毒的有效成分并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和/或其他成分。在用于现场制备无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳剂的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，所述技术产生来自事先无菌过滤的液体介质中的有效成分和任何额外所需成分的粉末。如果需要，应当合适地缓冲液体介质并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂在注射之前等渗。组合物必须在制造和储存条件下是稳定的；因此，受到保护免遭免微生物如细菌和真菌的污染作用。可以理解应当使内毒素污染保持在最小，处于安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。合适的可药用载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂黏度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖等。任选地，混悬剂也可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液剂的物质。另外，活性化合物的混悬剂可以制备为适宜的油性注射混悬剂。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或合成性脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。这类技术在Remington'sPharmaceuticalSciences(第18版,MackPrintingCompany,1990)中公开。可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有多肽的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。在具体的实施方案中，可以通过在可注射组合物中使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，引起组合物的吸收延长。除前面所述的组合物之外，也可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子配制为贮库配制品。这种长效制剂可以通过(例如皮下或肌内)植入或通过肌内注射施用。因此，例如，可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子用合适的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或者配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物可以按本领域已知的任何方式制造，例如，通过常规混合、溶解、乳化、囊化、包埋或冻干法制造。可以使用一种或多种促进蛋白质加工成可以按药学方式使用的制品的生理可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂以常规方式配制药物组合物。合适的制剂取决于所选的施用途径。可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子以游离酸或碱、中性盐或盐形式配制到组合物中。可药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如，与蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如氢氯酸或磷酸或这类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸酸形成的那些盐。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁或这类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。药用盐倾向于在含水溶剂和不为相应游离碱形式的其他质子溶剂中溶解性更高。治疗方法和组合物本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以用于治疗方法中。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。为了用于治疗方法中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子将以符合良好医学实践的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。在一个方面，提供用作药物的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在其他方面，提供用于治疗疾病的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明提供如本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于治疗有需求的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有疾病的个体的方法中的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗疾病是癌症，施用抗癌药。在其他实施方案中，本发明提供如本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在某些实施方案中，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于诱导个体中的靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。根据以上任一个实施方案的“个体”是哺乳动物，优选地是人类。在又一个方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗有需求的个体中的疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有该疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在一个实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗疾病是癌症，则施用抗癌药。在又一个实施方案中，药物用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在仍然又一个实施方案中，该药物用于诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。在又一个方面，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，将组合物施用至所述个体，所述组合物包含可药用形式的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗疾病是癌症，施用抗癌药。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。在又一个方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，该方法包括使靶细胞与与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在T细胞、特别是细胞毒T细胞存在下接触。在又一个方面，提供一种用于诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法。在这样的一个实施方案中，该方法包括向该个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”是人。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以使用本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨、乳腺、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼部、头部和颈部、(中枢和外周)神经系统、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖系统。还包括癌前病状或损害和癌症转移灶。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员轻易地认识到，在许多情况下T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以不提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有某些益处的生理变化也视为治疗性有益的。因此，在一些实施方案中，将提供生理变化的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体一般是哺乳动物、更具体地是人。在一些实施方案中，将有效量的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子施用至细胞。在其他实施方案中，将治疗有效量的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子施用至个体以治疗疾病。对于预防或治疗疾病，本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、T细胞活化性双特异性抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和过程、T细胞活化性双特异性抗原结合分子是否出于预防或治疗目的施用、之前或同时实施的治疗性介入、患者的临床史和对T细胞活化性双特异性抗原结合分子的反应以及主治医师的决定。在任何情况下，负责施用的执业者将决定用于单个受试者的组合物中的有效成分浓度及适宜剂量。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。将T细胞活化性双特异性抗原结合分子适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可以是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个示例性剂量处于约0.005mg/kg至约10mg/kg范围内。在其他非限制性例子中，剂量还可以包含每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及使用可来自于其中的任何范围。在从本文所列数值可获得的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数值，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周(例如，由此患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子通常将按有效实现预期目的量使用。为了用来治疗或预防疾病状态，以治疗有效量施用或施加本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其药物组合物。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。对于全身性施用，可以从体外测定法初步估计治疗有效剂量，如细胞培养测定法。可以在动物模型中配制某个剂量以实现包括IC50的循环浓度范围，如细胞培养物中所测定。这种信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。也可以使用本领域熟知的技术，从体内数据(如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据轻易地优化对人类施用。可以逐一调整剂量数量和间隔时间以提供足以维持治疗效果的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的血浆水平。注射施用的患者常规剂量是约0.1至50mg/kg/日，一般约0.5至1mg/kg/日。治疗有效的血浆水平可以通过每日施用多个剂量实现。可以测量血浆中的水平，例如，通过HPLC测量。在局部施用或选择性摄入的情况下，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量通常将在不造成明显毒性的情况下提供治疗益处。可以通过标准药学流程在细胞培养物或实验动物中确定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效。细胞培养测定法和动物研究可以用来测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表述为LD50/ED50比。优选显示出巨大治疗指数的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子显示出高治疗指数。可以在配制适用于人类中的剂量范围时使用从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据。该剂量优选地位于毒性低或无毒性情况下包括ED50的一系列循环浓度范围内。剂量可以在这个范围内部变动，这取决于多种因素，例如，所用的剂型、所用的施用途径、受试者状况等。确切配方、施用途径和剂量可以由各位医师根据患者的疾病选择(参见，例如Fingl等人,1975,引自：ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第1章,第1页，所述文献通过引用方式完整并入本文)。用本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治医生将知道如何和何时因所致毒性、器官功能障碍等而终止、暂停或调节施用。反过来，如果临床反应不充分(不包括毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。治疗目的病状时所施用剂量的大小将随待治疗病状的严重性、随施用途径等变动。病状的严重性可以例如部分地通过标准预后评价方法进行评价。另外，剂量和或许给药频率也将根据各位患者的年龄、体重和反应而变动。其他药剂和治疗本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以在疗法中与一种或多种其它药剂组合施用。例如，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与至少一种额外的治疗剂共施用。术语“治疗药”涵盖为了治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病所施用的任何药剂。这类额外治疗药可以包括适用于正在治疗的特定适应症的任何有效成分，优选地具有互补活性的彼此无不利影响的那些治疗药。在某些实施方案中，额外的治疗药是免疫调节剂、细胞抑制剂、细胞黏附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活物、或增加细胞对凋亡诱导物的敏感性的药物。在一个具体实施方案中，额外治疗药是抗癌药，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷基化剂、激素治疗药、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡激活物或抗血管生成剂。此类其他药剂适当地以有效用于预期目的的量存在。这类其他药物的有效量取决于所用T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。T细胞活化性双特异性抗原结合分子通常以与如本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的组合物中包含两种或更多种治疗药)，和独立施用，在这种情况下，本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的施用可以在施用额外的治疗药和/或辅药之前、同时和/或之后进行。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子也可以与放射疗法组合使用。制造物在本发明的另一个方面，提供制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。可以从多种材料如玻璃或塑料形成容器。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。在组合物中的至少一种活性物质是本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。而且，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中，制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选地或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。实施例以下是本发明方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。一般方法重组DNA技术如Sambrook等人,Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，NIH出版编号91-3242中给出。DNA测序通过双链测序法测定DNA序列。基因合成在需要的情况下，使用适宜的模板通过PCR产生目的基因区段，或由GeneartAG(雷根斯堡，德国)从合成性寡核苷酸和PCR产物，通过自动化基因合成法合成目的基因区段。在精确基因序列不可获得的情况下，基于来自最接近同源物的序列设计寡核苷酸引物并且通过RT-PCR从源自适宜组织的RNA分离基因。将旁侧分布有单一限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆至标准克隆/测序载体中。从转化的细菌纯化出质粒DNA并且通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以允许亚克隆至相应的表达载体中。全部构建体均设计成具有编码前导肽的5'末端DNA序列，所述前导肽在真核细胞中引导蛋白质分泌。SEQIDNO:154-162分别给出示例性前导肽和编码它们的多核苷酸序列。从PBMC分离原代人泛T细胞通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)制备外周血单个核细胞(PBMC)，所述淋巴细胞制备物从本地血库或从健康人类供体的新鲜血液获得。简而言之，将血液用无菌PBS稀释并小心地敷设在Histopaque梯度(Sigma，H8889)上。在室温以450xg离心30分钟(制动关闭)后，弃去PBMC之上含有中间层的血浆部分。将PBMC转移至新的50mlFalcon管并将该管用PBS填充至总体积50ml。将混合物在室温以400xg离心10分钟(制动开启)。将上清液弃去并且将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤2次(在4℃以350xg持续10分钟的离心步骤)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中直至开始分析。使用泛T细胞分离试剂盒II(MiltenyiBiotec#130-091-156)，根据制造商的说明书从PBMC富集T细胞。简而言之，将细胞沉淀物按每1千万个细胞稀释于40μl冷缓冲液(无菌过滤的含有0.5％BSA，2mMEDTA的PBS)中并且在4℃按每1千万个细胞与10μl生物素-抗体混合物温育10分钟。按每1千万个细胞添加30μl冷缓冲液和20μl抗生物素磁珠，并且将混合物4℃温育另外15分钟。通过添加10-20x当前体积并接着在300xg实施离心步骤10分钟，洗涤细胞。将至多1亿个细胞重悬于500μl缓冲液中。根据制造商的说明书，使用LS柱(MiltenyiBiotec#130-042-401)磁性分离未标记的人泛T细胞。将所得到的T细胞群体自动计数(ViCell)并在37℃，5％CO2贮藏在培养箱中的AIM-V培养基内直至开始分析(不超过24小时)。从PBMC分离原代人幼稚T细胞通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)制备外周血单个核细胞(PBMC)，所述淋巴细胞制备物从本地血库或从健康人类供体的新鲜血液获得。根据制造商的说明书，使用来自MiltenyiBiotec(#130-093-244)的幼稚CD8+T细胞分离试剂盒从PBMC富集T细胞，但是跳过最后的CD8+T细胞分离步骤(也参见分离原代人泛T细胞的描述)。从脾细胞分离鼠泛T细胞从C57BL/6小鼠分离脾脏，转移至含有MACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mMEDTA)的GentleMACSC-管(MiltenyiBiotech#130-093-237)中并且根据制造商的说明书用GentleMACS分离器解离以获得单细胞悬液。使细胞悬液通过预分离滤器以移除剩余的未解离的组织块。在4℃以400xg离心4分钟后，添加ACK裂解缓冲液以裂解红细胞(在室温温育5分钟)。将剩余的细胞用MACS缓冲液洗涤2次，计数并用于鼠泛T细胞的分离。使用来自MiltenyiBiotec的泛T细胞分离试剂盒(#130-090-861)，按照制造商的说明书进行负向(磁性)选择。将所得到的T细胞群体自动计数(ViCell)并立即用于其他测定法。从肝素化血液分离原代食蟹猴PBMC如下从来自健康食蟹猴供体的新鲜血液，通过密度离心法制备外周血单个核细胞(PBMC)：将肝素化血1:3用无菌PBS稀释，并将Lymphoprep介质(AxonLab#1114545)用无菌PBS稀释至90％。将两体积稀释的血液铺在一体积稀释的密度梯度上，并且通过在室温不制动情况下以520xg离心30分钟，分离PBMC级分。将PBMC带转移至一个新50mlFalcon管并通过在4℃以400xg离心10分钟，用无菌PBS洗涤。进行一次低速离心以移除血小板(以150xg离心15分钟，4℃)，并且将所得到的PBMC群体自动计数(ViCell)并立即用于其他测定法。靶细胞为了评定靶向MCSP的双特异性抗原结合分子，使用以下肿瘤细胞系：衍生自恶性黑素瘤转移部位并表达高水平人MCSP的人黑素瘤细胞系WM266-4(ATCC#CRL-1676)，和表达中等水平人MCSP的人黑素瘤细胞系MV-3(来自拉德堡大学奈梅亨医学中心的慷慨馈赠)。为了评定靶向CEA的双特异性抗原结合分子，使用以下肿瘤细胞系：表达极高水平人CEA的人胃癌细胞系MKN45(DSMZ#ACC409)；表达中等水平至低水平人CEA的人类女性高加索人种结肠腺癌细胞系LS-174T(ECACC#87060401)；表达(很)低水平人CEA的人上皮样胰腺癌细胞系Panc-1(ATCC#CRL-1469)；和经自主工程化以稳定表达人CEA的鼠结肠癌细胞系MC38-huCEA。此外，人T细胞白血病细胞系Jurkat(ATCC#TIB-152)用来评估不同双特异性构建体与细胞上人CD3的结合。实施例1双特异性抗原结合分子的制备、纯化和表征将所产生的重链和轻链可变区序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且合成性polyA信号序列位于在CDS的3'末端。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293EBNA细胞，产生该分子。使用磷酸钙方法转染指数生长的HEK293EBNA细胞。备选地，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染以悬浮方式生长的HEK293EBNA细胞。为了制备“1+1IgGscFab，单臂/单臂倒置”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链-scFab”)转染。为了制备“2+1IgGscFab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:2:1比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链-scFab”)转染。为了制备“1+1IgGCrossfab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比率(“载体第二重链”:“载体第一轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体第一重链-重链Crossfab”)转染。为了制备“2+1IgGCrossfab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体第二重链”:“载体轻链”:“载体第一重链-重链Crossfab”:“载体轻链Crossfab”)转染。为了制备“2+1IgGCrossfab，连接的轻链”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链(CrossFab-Fab-Fc)”:“载体连接的轻链”)转染。为了制备“1+1CrossMab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比率(“载体第一重链”:“载体第二重链”:“载体第一轻链”:“载体第二轻链”)转染。为了制备“1+1IgGCrossfab轻链融合”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比率(“载体第一重链”:“载体第二重链”:“载体轻链Crossfab”:“载体第二轻链”)转染。对于使用磷酸钙法转染，在T型瓶中使用补充有10％(v/v)FCS的DMEM培养基，将细胞培育为贴壁单层培养物，并且在细胞达到50和80％汇合度时转染细胞。对于T150瓶的转染，将1500万个细胞在转染之前24小时接种于补充有FCS(终浓度10％v/v)的25mlDMEM培养基中，并且将细胞在37℃置于具有5％CO2气氛的培养箱中过夜。对于每个待转染的T150瓶，通过混合按相应比例划分的94μg总质粒载体DNA、至终体积469μl的水和469μl1MCaCl2溶液，制备DNA、CaCl2和水的溶液。向这种溶液添加938μl50mMHEPES、280mMNaCl、1.5mMpH7.05的Na2HPO4溶液，立即混合10秒并在室温静置20秒。将该悬液用补充有2％(v/v)FCS的10mlDMEM稀释并添加至T150替代现存培养基。随后，添加额外的13ml转染培养基。将细胞在37℃，5％CO2温育约17至20小时，随后将培养基替换为25mlDMEM，10％FCS。交换培养基后大约7日，通过以210xg离心15分钟收获条件培养基，无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮钠至终浓度0.01％(w/v)，并在4℃保存。对于使用聚乙烯亚胺的转染，在无血清CDCHO培养基中以悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞以210xg离心5分钟，并且将上清液更换为预温的20mlCDCHO培养基。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将混合物涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1(Lonza)。在培养7日后，通过以210xg离心15分钟，收集上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮钠至终浓度0.01％w/v，并在4℃保存。通过蛋白A亲和层析，随后大小排阻色谱步骤，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。为了亲和层析，将上清液加载于用25ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH7.5或40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5ml，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠pH7.5洗涤，随后一个使用6个柱体积10mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠pH5.45的额外洗涤步骤，移除未结合的蛋白质。随后，将柱用20ml10mMMES，100mM氯化钠，pH5.0洗涤，并且将靶蛋白以六柱体积20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3.0洗脱。备选地，以20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度使用多于20个柱体积来洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mMpH6.7甘氨酸溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。为了纯化1+1IgGCrossfab，将柱用20mM组氨酸，140mMpH6.0氯化钠溶液平衡。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。根据制造商的说明书(4-12％Tris-乙酸盐凝胶或4-12％Bis-Tris)，使用预制凝胶系统(Invitrogen，美国)，通过在还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下的SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的SimpleBlueTMSafeStain)染色，分析双特异性构建体的纯度和分子量。备选地，根据制造商的说明书，使用CaliperLabChipGXII(CaliperLifescience)，通过CE-SDS分析法在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。在25℃使用Superdex20010/300GL分析性大小排阻层析柱(GEHealthcare)在2mMMOPS，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaN3，pH7.3运行缓冲液中分析蛋白质样品的聚集物含量。备选地，在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。图2-14显示SDSPAGE和分析性大小排阻色谱的结果并且表2A显示不同双特异性构建体的制备物的产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。图47显示CE-SDS分析抗CD3/抗MCSP双特异性“2+1IgGCrossfab，连接的轻链”构建体(参见SEQIDNO:3、5、29和179)的结果。2μg样品用于分析。图48显示终产物的分析性大小排阻色谱结果(注入20μg样品)。图54显示CE-SDS和SDSPAGE分析各种构建体的结果，并且表2A显示不同双特异性构建体的制备物的产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。表2A.产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。作为对照，以现有技术的串联scFv样式(“(scFv)2”)以及通过串联scFv与Fc结构域融合，生成双特异性抗原结合分子(“(scFv)2-Fc”)。按照与如上文对本发明双特异性抗原结合分子所述的类似方式，将这些分子在HEK293-EBNA细胞中产生并且通过蛋白A亲和层析、随后大小排阻层析步骤纯化。由于高的聚集物形成，一些样品不得不通过将来自HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)的洗脱和浓缩样品施加至用20mM组氨酸，140mM氯化钠，pH6.7平衡的Superdex10/300GL柱(GEHealthcare)来进一步纯化，以获得具有高单体含量的蛋白质。随后，如上文所述确定蛋白质浓度、纯度和分子量和聚集物含量。表2B中显示了对照分子的产率、第一纯化步骤后的聚集物含量和最终单体含量。比较第一纯化步骤(蛋白A)后的聚集物的含量显示与“(scFv)2-Fc”和二硫键稳定化“(dsscFv)2-Fc”分子相比，IgGCrossfab和IgGscFab构建体的稳定性优越。表2B.产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。通过动态光散射法(DLS)监测该蛋白质的热稳定性。将蛋白质浓度为1mg/ml的30μg已过滤蛋白质样品一式两份施加至Dynapro平板读数仪(WyattTechnologyCorporation；美国)。温度以0.05℃/分钟从25℃递增至75℃，采集半径和总散射强度。在图15和表2C中显示结果。对于“(scFv)2-Fc”(抗MCSP/抗huCD3)分子，在49℃和68℃观察到两个聚集点。“(dsscFv)2-Fc”构建体因引入的二硫键而具有增加的聚集温度(57℃)(图15A，表2C)。“2+1IgGscFab”和“2+1IgGCrossfab”构建体均在高于60℃的温度聚集，从而与“(scFv)2-Fc”和“(dsscFv)2-Fc”样式相比，显示它们的优越热稳定性(图15B，表2C)。表2C.通过动态光散射法确定热稳定性。构建体Tagg[℃]2+1IgGscFab(LC007/V9)682+1IgGCrossfab(LC007/V9)65Fc-(scFv)2(LC007/V9)49/68Fc-(dsscFv)2(LC007/V9)57实施例2Fc受体和靶抗原结合的表面等离子体共振分析方法在25℃在BiacoreT100上进行全部表面等离子体共振(SPR)实验，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/德国)。不同Fc变体的FcR结合作用的分析图16A中显示测定法设置。为了分析不同Fc变体与人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的相互作用，使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)，在pH5.0在CM5芯片上直接偶联约6,500个共振单位(RU)的抗五His抗体(Qiagen)。HuFcγRIIIa-V158-K6H6和muFcγRIV-aviHis-生物素分别以4nM和10nM捕获60秒。使具有不同Fc突变的构建体以1000nM浓度，以30μl/分钟流速通过流动小室120秒。监测解离过程220秒。通过扣除在参比流动小室中获得的响应，修正本体折射率差异。此处，使Fc变体在下述表面上流过，所述表面具有固定化抗五His抗体，但是已经在其上注射HBS-EP而非HuFcγRIIIa-V158-K6H6或muFcγRIV-aviHis-生物素。使用500–4000nM的浓度范围，确定野生型Fc对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力。通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合，将稳态响应用来导出解离常数KD。使用BiacoreT100评价软件(vAA，BiacoreAB，Uppsala/瑞典)推算动力学常数，以通过数值积分拟合1:1Langmuir结合作用的速率方程。结果通过表面等离子体共振法监测Fc变体与人FcγRIIIa和鼠FcγRIV的相互作用。对于全部所分析的Fc突变体，与具有野生型(wt)Fc结构域的构建体相比，与捕获的huFcγRIIIa-V158-K6H6和muFcγRIV-aviHis-生物素的结合显著减少。与人Fcγ-受体结合最少的Fc突变体是P329GL234AL235A(LALA)和P329GLALAN297D。LALA突变单独不足以消除与huFcγRIIIa-V158-K6H6的结合作用。仅携带LALA突变的Fc变体对人FcγRIIIa具有2.100nM残余结合亲和力，而wtFc以600nM亲和力结合人FcγRIIIa受体(表3)。使用单一浓度，两种KD值均通过1:1结合模型导出。仅能分析wtFc对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力。表3中列出KD值。对于分析的全部Fc突变体，与鼠FcγRIV的结合作用几乎完全消除。表3.Fc变体对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力*使用一种浓度(1000nM)测定与肿瘤抗原和CD3同时结合作用的分析使用标准偶联方法，通过在传感芯片SA上直接偶联1650个共振单位(RU)的MCSP生物素酰化D3结构域，分析T细胞双特异性构建体与肿瘤抗原和人CD3ε的同时结合。使用标准氨基偶联法固定人EGFR。在pH5.5在CM5传感芯片上固定8000RU。图16B中显示测定法设置。在200nM捕获不同的T细胞双特异性构建体60秒。人CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)随后以2000nM的浓度和40μl/分钟的流速通过60秒。通过扣减参比流动小室上获得的响应修正本体折射率差异，其中在所述参比流动小室中重组CD3ε在具有MCSP或EGFR的固定化D3结构域的表面上没有捕获的T细胞双特异性构建体的情况下流过。结果通过表面等离子体共振法分析与肿瘤抗原和人CD3ε的同时结合作用(图17，图18)。全部构建体均能够同时结合肿瘤抗原和CD3。对于大部分构建体，注射人CD3ε后的结合水平(RU)高于仅注射构建体后实现的结合水平，这反映肿瘤抗原和人CD3ε均与构建体结合。实施例3双特异性构建体与细胞上各靶抗原的结合通过FACS测定不同双特异性构建体与Jurkat细胞(ATCC#TIB-152)上CD3和靶细胞上相应肿瘤抗原的结合。简而言之，将细胞收获、计数并检验存活力。将0.15–0.2百万个细胞/孔(含有0.1％BSA的PBS中；90μl)铺种在圆底96孔板中并且在4℃与所示浓度的双特异性构建体和相应IgG对照(10μl)温育30分钟。为了更好地比较，将全部构建体和IgG对照针对相同的体积摩尔浓度归一化。在温育后，将细胞离心(5分钟，350xg)，用150μl含有0.1％BSA的PBS洗涤，重悬并在4℃与12μl/孔的FITC缀合或PE缀合的第二抗体进一步温育30分钟。使用FACSCantoII检测结合的构建体(SoftwareFACSDiva)。使用FITC缀合的抗His抗体(Lucerna,#RHIS-45F-Z)检测“(scFv)2”分子。对于全部其他分子，使用FITC缀合或PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgGFcγ特异性片段(分别是JacksonImmunoResearchLab#109-096-098/工作液1:20，或#109-116-170/工作液1:80)。通过添加120μl/孔含有0.1％BSA的PBS并以350xg离心5分钟，洗涤细胞。用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS进行第二个洗涤步骤。除非另外说明，否则将细胞在4℃在暗处用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟，以400xg离心6分钟并且保存在200μl/孔含有0.1％BSA的PBS中直至用FACSCantoII测量样品。使用GraphPadPrism软件计算EC50值。在第一个实验中，通过流式细胞术分析靶向人MCSP和人CD3的不同双特异性构建体与Jurkat、人T细胞、白血病细胞上表达的人CD3的结合或与Colo-38人黑素瘤细胞上人MCSP的结合。在图19-21中显示结果，所述结果显示与双特异性分子、对照IgG、仅第二抗体温育或保持未处理的细胞的平均荧光强度。如图19中所示，对于“(scFv)2”分子的两种抗原结合部分即CD3(图191A)和MCSP(图19B)，与对照样品相比观察到清晰的结合信号。“2+1IgGscFab”分子(SEQIDNO:5、17、19)显示与Colo-38细胞上的huMCSP良好结合(图20A)。CD3部分比参比抗人CD3IgG略微更好地结合CD3(图20B)。如图21A中所示，两种“1+1”构建体均对细胞上的人CD3显示可比较的结合信号。参比抗人CD3IgG产生略微较弱的信号。此外，测试的两个构建体(“1+1IgGscFab，单臂”(SEQIDNO:1、3、5)和“1+1IgGscFab，单臂倒置”(SEQIDNO:7、9、11))均显示与细胞上人MCSP的可比较结合(图21B)。用参比抗人MCSPIgG获得的结合信号略微地较弱。在另一个实验中，通过流式细胞术分析纯化的“2+1IgGscFab”双特异性构建体(SEQIDNO:5、17、19)和相应的抗人MCSPIgG与Colo-38人黑素瘤细胞上人MCSP的剂量依赖性结合，以确定双特异性构建体是否通过其一条或两条“臂”与MCSP结合。如图22中所示，“2+1IgGscFab”构建体显示与MCSPIgG相同的结合模式。在又一个实验中，评估了在Crossfab片段中具有VL/VH(参见SEQIDNO:33、63、65、67)或CL/CH1交换(参见SEQIDNO:66、67、183、197)的CD3/CEA“2+1IgGCrossfab，倒置”双特异性构建体与Jurkat细胞表达的人CD3的结合或与LS-174T细胞表达的人CEA的结合。作为对照，也评估相应IgG的等价最大浓度和因标记第二抗体(山羊抗人FITC缀合的亲和纯F(ab’)2片段，Fcγ片段特异的，JacksonImmunoResearchLab#109-096-098)所致的背景染色。如图55中所示，两种构建体均显示与人CEA以及与细胞上人CD3的良好结合。“2+1IgGCrossfab，倒置(VL/VH)”和“2+1IgGCrossfab，倒置(CL/CH1)”构建体的计算EC50值分别是4.6nM和3.9nM(CD3)，及9.3nM和6.7nM(CEA)。在另一个实验中，评估了CD3/MCSP“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGCrossfab，倒置”(参见SEQIDNO:5、23、183、187)构建体与Jurkat细胞表达的人CD3的结合或与WM266-4细胞表达的人MCSP的结合。图56显示，尽管两种构建体与细胞上的MCSP的结合作用可比地良好，但是与另一个构建体相比，“倒置”构建体与CD3的结合作用减少。“2+1IgGCrossfab，倒置”和“2+1IgGCrossfab”构建体的计算EC50值分别是6.1nM和1.66nM(CD3)，及0.57nM和0.95nM(MCSP)。在又一个实验中，测定“1+1IgGCrossfab轻链(LC)融合”构建体(SEQIDNO:183、209、211、213)与Jurkat细胞表达的人CD3和与LS-174T细胞表达的人CEA的结合。作为对照，也评估相应的抗CD3和抗CEAIgG的等价最大浓度和因标记第二抗体(山羊抗人FITC缀合的亲和纯F(ab’)2片段，Fcγ片段特异的，JacksonImmunoResearchLab#109-096-098)所致的背景染色。如图57中所示，“1+1IgGCrossfabLC融合物”与CEA的结合似乎大大减少，而与CD3的结合至少与参考IgG可比较。在最终实验中，测定“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:5、23、215、217)和“2+1IgGCrossfab，倒置”(SEQIDNO:5、23、215、219)构建体与Jurkat细胞表达的人CD3的结合以及与WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP的结合。如图58中所示，与另一个构建体相比，“2+1IgGCrossfab，倒置”与人CD3的结合减少，但是与人MCSP的结合可比地良好。“2+1IgGCrossfab”和“2+1IgGCrossfab，倒置”构建体的计算EC50值分别是10.3nM和32.0nM(CD3)，以及3.1nM和3.4nM(MCSP)。实施例4当双特异性构建体结合时原代人T细胞上表面活化标志物的FACS分析通过流式细胞术对纯化的靶向huMCSP-huCD3的双特异性“2+1IgGscFab”(SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”分子测试它们在表达人MCSP的肿瘤细胞存在下上调CD8+T细胞上早期表面活化标志物CD69或晚期活化标志物CD25的潜力。简而言之，将MCSP阳性Colo-38细胞用细胞解离缓冲液收获，计数并检查存活力。将细胞在AIM-V培养基中调节至0.3x106个(活)细胞/ml，将100μl这种细胞悬液/孔吸至圆底96孔板中(如所示)。将50μl(稀释的)双特异性构建体添加至含有细胞的孔以获得终浓度1nM。从健康供体的新鲜血液分离人PBMC效应细胞并在AIM-V培养基中调节至6x106个(活)细胞/ml。将50μl这种细胞悬液添加测试平板的每个孔(见上文)以获得最终E:T比率10:1。为了分析所述双特异性构建体是否能够仅在表达肿瘤抗原huMCSP的靶细胞存在情况下活化T细胞，纳入这样的孔，所述孔含有1nM相应的双特异性分子以及PBMC，但是不含靶细胞。在37℃，5％CO2温育15小时(CD69)或24小时(CD25)后，将细胞离心(5分钟，350xg)并用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次。根据供应商的建议，在4℃对CD8(小鼠IgG1，κ；克隆HIT8a；BD#555635)、CD69(小鼠IgG1；克隆L78；BD#340560)和CD25(小鼠IgG1，κ；克隆M-A251；BD#555434)进行表面染色30分钟。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。在离心后，使样品重悬于200μl/孔含有0.1％BSA的PBS中并使用FACSCantoII仪(SoftwareFACSDiva)分析。图23描述了分别温育15小时或24小时后CD8+T细胞上早期活化标志物CD69(A)或晚期活化标志物CD25(B)的表达水平。两种构建体均仅在靶细胞存在下诱导两种活化标志物的上调。在这个测定法中，“(scFv)2”分子似乎比“2+1IgGscFab”构建体略微地更有活性。通过流式细胞术对纯化的靶向huMCSP-huCD3的双特异性“2+1IgGscFab”和“(scFv)2”分子进一步测试它们在表达人MCSP的肿瘤细胞存在下上调CD8+T细胞或CD4+T细胞上晚期活化标志物CD25的潜力。实验性的程序如上文所述，按E:T比率5:1使用人泛T效应细胞和五日温育时间。图24显示两种构建体均仅在靶细胞存在下诱导CD8+(A)T细胞以及CD4+(B)T细胞上的CD25上调。在这个测定法中，与“(scFv)2”分子相比，“2+1IgGscFab”构建体似乎更少地诱导CD25上调。从总体上看，CD25的上调在CD8+上比CD4+T细胞上更明显。在另一个实验中，在肿瘤靶细胞存在下对靶向食蟹猴CD3和人MCSP的纯化“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:3、5、35、37)分析其上调CD8+T细胞上表面活化标志物CD25的潜力。简而言之，将表达人MCSP的MV-3肿瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获、洗涤和重悬在含有2％FCS和1％GlutaMax的DMEM中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物(图25)。将双特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加从两只健康动物的血液分离的食蟹猴PBMC效应细胞以获得最终E:T比率3:1。在37℃，5％CO2温育43小时后，将细胞以350xg离心5分钟并用含有0.1％BSA的PBS洗涤2次。根据供应商的建议对CD8(MiltenyiBiotech#130-080-601)和CD25(BD#557138)进行表面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。在离心后，使样品重悬于200μl/孔含有0.1％BSA的PBS中并使用FACSCantoII仪(SoftwareFACSDiva)分析。如图25中所示，双特异性构建体仅在靶细胞存在下才诱导CD8+T细胞上CD25的浓度依赖性上调。抗食蟹猴CD3IgG(克隆FN-18)还能够在不交联的情况下诱导CD8+T细胞上CD25的上调(参见用食蟹猴Nestor获得的数据)。采用最大浓度的双特异性构建体(在靶细胞不存在情况下)时，不存在食蟹猴T细胞的过度活化。在另一个实验中，将CD3-MCSP“2+1IgGCrossfab，连接的轻链”(参见SEQIDNO:3、5、29、179)与CD3-MCSP“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)比较其在肿瘤靶细胞存在下上调CD8+T细胞上早期活化标志物CD69或晚期活化标志物CD25的潜力。将原代人PBMC(如上文所述分离)在MCSP阳性Colo38靶细胞存在或不存在下与所示浓度的双特异性构建体温育至少22小时。简而言之，平底96孔板每孔铺种三十万个原代人PBMC，所述孔含有MCSP阳性靶细胞(或培养基)。效应细胞对靶细胞(E:T)的最终比率是10:1。将细胞在37℃，5％CO2与所示浓度的双特异性构建体和对照温育所示的温育时间。将效应细胞对CD8和CD69或CD25染色并通过FACSCantoII分析。图53显示这个实验的结果。两种2+1IgGCrossfab分子(具有或没有连接的轻链)之间不存在检测到的CD69上调(A)或CD25上调(B)的显著差异。在又一个实验中，将CD3/MCSP“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“1+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、29、33、181)构建体与“1+1CrossMab”构建体(参见SEQIDNO:5、23、183、185)比较其在肿瘤靶细胞存在下上调CD4+或CD8+T细胞上CD69或CD25的潜力。该测定法在表达人MCSP的MV-3肿瘤细胞存在下或不存在下如上文所述进行，温育时间24小时。如图59中所示，“1+1IgGCrossfab”和“2+1IgGCrossfab”构建体比“1+1CrossMab”分子诱导更明显的活化标志物上调在最终实验中，对CD3/MCSP“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、23、215、217)和“2+1IgGCrossfab，倒置”(参见SEQIDNO:5、23、215、219)构建体评估其在肿瘤靶细胞存在下上调来自两只不同食蟹猴的CD4+或CD8+T细胞上的CD25的潜力。该测定法在表达人MCSP的MV-3肿瘤细胞存在下或不存在下如上文所述进行，E:T比率为3:1并且温育时间约41小时。如图60中所示，两种构建体均能够以浓度依赖性方式上调CD4+细胞和CD8+T细胞上的CD25，两种样式之间物显著差异。无抗体和无靶细胞的对照样品给出了与有抗体但无靶的样品可比较的信号(未显示)。实施例5用CD3双特异性构建体活化人泛T细胞后干扰素-γ的分泌通过测量人干扰素(IFN)-γ向上清液的释放量，分析靶向人MCSP和人CD3的纯化的“2+1IgGscFab”(SEQIDNO:5、17、19)分析在人MCSP阳性U-87MG细胞存在下诱导T细胞活化的潜力。作为对照，使用调节至相同体积摩尔浓度的抗人MCSPIgG和抗人CD3IgG。简而言之，将表达huMCSP的U-87MG胶质母细胞瘤星形细胞瘤靶细胞(ECACC89081402)用细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔平板中每孔铺种20000个细胞并且添加相应的抗体稀释物以获得终浓度1nM。添加从暗黄覆盖层分离的人泛T效应细胞以获得最终E:T比率5:1。在37℃，5％CO2温育18.5小时后，将测试平板以350xg离心5分钟并将上清液转移至新的96孔板。根据制造商的说明书，通过ELISA测量上清液中的人IFN-γ水平(来自BectonDickinson的BDOptEIA人IFN-γELISA试剂盒II，#550612)。如图26中所示，参比IgG显示没有至微弱的IFN-γ分泌诱导作用，而“2+1IgGscFab”构建体能够活化人T细胞以分泌IFN-γ。实施例6由靶向T细胞上CD3和肿瘤细胞上MCSP或EGFR的交联双特异性构建体介导的再指向的T细胞细胞毒性(LDH释放测定法)在第一系列实验中，分析靶向CD3和MCSP的双特异性构建体在通过抗原结合部分与细胞上其相应靶抗原结合而交联构建体时其在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导凋亡的潜力(图27-38)。在一个实验中，将纯化的靶向人CD3和人MCSP的“2+1IgGscFab”(SEQIDNO:5、21、23)和“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:3、5、29、33)构建体和相应的“(scFv)2”分子比较。简而言之，将表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加相应的构建体稀释物。将全部构建体和相应的对照IgG调节至相同的体积摩尔浓度。添加人泛T效应细胞以获得最终E:T比率5:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用1μg/mlPHA-M(Sigma#L8902；从菜豆(Phaseolusvulgaris)分离的同工凝集素的混合物)。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。在37℃，5％CO2温育20小时过夜后，用LDH检测试剂盒(RocheAppliedScience，#11644793001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。如图27中所示，两种“2+1”构建体均在靶细胞中诱导与“(scFv)2”分子可比较的凋亡。另外，比较了纯化的在其Fc结构域中不同的“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:3、5、29、33)和“2+1IgGscFab”构建体以及“(scFv)2”分子。Fc结构域中的不同突变(L234A+L235A(LALA)、P329G和/或N297D，如所示)减少或消除由含有野生型(wt)Fc结构域的构建体诱导的(NK)效应细胞功能。实验方法如上文所述。图28显示全部构建体均在靶细胞中诱导与“(scFv)2”分子可比较的凋亡。图29显示了比较纯化的“2+1IgGscFab”(SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”分子在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导凋亡的潜力的结果。实验方法如上文所述，以E:T比率5:1使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和18.5小时温育过夜。如本图中所示，“2+1IgGscFab”构建体显示与“(scFv)2”分子可比较的细胞毒活性。类似地，图30显示以E:T比率5:1使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞并使用18小时温育时间，比较纯化的“2+1IgGscFab”构建体(SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”分子的结果。如本图中所示，“2+1IgGscFab”构建体显示与(scFv)2分子可比较的细胞毒活性。图31显示以E:T比率5:1使用表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞并使用23.5小时过夜温育，比较纯化的“2+1IgGscFab”构建体(SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”分子的结果。如本图中所示，该构建体在靶细胞中与“(scFv)2”分子可比较地诱导凋亡。“2+1IgGscFab”构建体在最高浓度显示降低的效力。另外，分析对两种靶，即人CD3和人MCSP，为单价的不同双特异性构建体以及相应的“(scFv)2”分子诱导T细胞介导凋亡的潜力。图32显示以E:T比率5:1使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞并使用温育时间19小时，“1+1IgGscFab，单臂”(SEQIDNO:1、3、5)和“1+1IgGscFab，单臂倒置”(SEQIDNO:7、9、11)构建体的结果。如本图中所示，两种“1+1”构建体的活性在这个测定法中均低于“(scFv)2”分子，“1+1IgGscFab，单臂”分子优于“1+1IgGscFab，单臂倒置”分子。图33显示以E:T比率5:1使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞并使用温育时间20小时，“1+1IgGscFab”构建体(SEQIDNO:5、21、213)的结果。如本图中所示，“1+1IgGscFab”构建体的细胞毒性低于“(scFv)2”分子。在又一个实验中，对纯化的“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:3、5、29、33)、“1+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:5、29、31、33)和“(scFv)2”分子分析它们在细胞上结合两种靶抗原CD3和MCSP而交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜力。使用表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤细胞作为靶细胞，E:T比率是5:1，并且温育时间是20小时。图34中显示结果。“2+1IgGCrossfab”构建体在靶细胞中与“(scFv)2”分子可比较地诱导凋亡。单价和双价“IgGCrossfab”样式的比较清楚显示双价样式有力得多。在又一个实验中，分析纯化的“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:3、5、29、33)构建体在不同(肿瘤)靶细胞中诱导T细胞介导凋亡的潜力。简而言之，如所示，将MCSP阳性Colo-38肿瘤靶细胞、(衍生自骨髓，Lonza#PT-2501或脂肪组织，Invitrogen#R7788-115)的间充质干细胞或周细胞(来自胎盘；PromoCell#C-12980)用细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基中(Invitrogen#12055-091)。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。添加从健康供体的新鲜血液分离的人PBMC效应细胞以获得最终E:T比率25:1。在37℃，5％CO2温育4小时后，用LDH检测试剂盒(RocheAppliedScience，#11644793001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。如图35中所示，仅用Colo-38细胞可观察到明显的T细胞介导的细胞毒性。这个结果与Colo-38细胞表达显著水平的MCSP相符，间充质干细胞和周细胞仅非常微弱地表达MCSP。还将纯化的“2+1IgGscFab”(SEQIDNO:5、17、19)构建体和“(scFv)2”分子与其Fc结构域中岩藻糖化的N-聚糖比例降低的糖工程化抗人MCSPIgG抗体(MCSPGlycoMab)比较。对于这个实验，以固定的E:T比率25:1(图36A)或以20:1至1:10的不同E:T比率(图36B)使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和人PBMC效应细胞。以图36A中所示的浓度或以固定浓度1667pM(图36B)使用不同分子。在21小时温育后进行读数。如图36A和36B中所示，两种双特异性构建体均显示比MSCPGlycoMab更高的效力。在另一个实验中，分析纯化的靶向食蟹猴CD3和人MCSP的“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:3、5、35、37)。简而言之，将表达人MCSP的MV-3肿瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获、洗涤和重悬在含有2％FCS和1％GlutaMax的DMEM中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加构建体或参比IgG的相应稀释物。将双特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加从健康食蟹猴的血液分离的食蟹猴PBMC效应细胞以获得最终E:T比率3:1。在37℃，5％CO2温育24小时或43小时后，用LDH检测试剂盒(RocheAppliedScience，#11644793001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。如图37中所示，双特异性构建体诱导来自靶细胞的浓度依赖性LDH酶释放。43小时后的效应强于24小时后的效应。抗食蟹猴CD3IgG(克隆FN-18)还能够在不交联情况下诱导靶细胞的LDH释放。图38显示使用表达MCSP的人黑素瘤细胞系(MV-3)作为靶细胞和并使用人PBMC作为效应细胞，E:T比率10:1和温育时间26小时情况下，比较纯化的“2+1IgGCrossfab”(SEQIDNO:3、5、29、33)和“(scFv)2“构建体的结果。如本图中所示，就EC50而言，“2+1IgGCrossfab”构建体比“(scFv)2“分子更有力。在第二系列实验中，分析靶向CD3和EGFR的双特异性构建体在通过抗原结合部分与细胞上其相应靶抗原结合而交联构建体时其在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导凋亡的潜力(图39-41)。在一个实验中，将纯化的靶向CD3和EGFR的纯化的“2+1IgGscFab”(SEQIDNO:45、47、53)和“1+1IgGscFab”(SEQIDNO:47、53、213)构建体和相应的“(scFv)2”分子比较。简而言之，将表达人EGFR的LS-174T肿瘤靶细胞用胰蛋白酶收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加人泛T效应细胞以获得最终E:T比率5:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用1μg/mlPHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。在37℃，5％CO2温育18小时过夜后，用LDH检测试剂盒(RocheAppliedScience，#11644793001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。如图39中所示，“2+1IgGscFab”构建体显示与“(scFv)2”分子可比较的细胞毒活性，“1+1IgGscFab”构建体活性较小。在另一个实验中，比较了纯化的“1+1IgGscFab，单臂”(SEQIDNO:43、45、47)、“1+1IgGscFab，单臂倒置”(SEQIDNO:11、49、51)、“1+1IgGscFab”(SEQIDNO:47、53、213)和“(scFv)2”分子。实验条件如上文所述，除了温育时间为21小时之外。如图40中所示，“1+1IgGscFab”构建体在这个测定法中显示比“(scFv)2”分子略微较低的细胞毒活性。两种“1+1IgGscFab，单臂(倒置)”构建体比“(scFv)2”分子明显活性更小。在又一个实验中，比较了纯化的“1+1IgGscFab，单臂”(SEQIDNO:43、45、47)和“1+1IgGscFab，单臂倒置”(SEQIDNO:11、49、51)构建体和“(scFv)2”分子。在这个实验中的温育时间是16小时，并且图41中描述结果。与人泛T细胞温育时，两种“1+1IgGscFab，单臂(倒置)”构建体比“(scFv)2”分子活性更小，但是显示使乳酸脱氢酶从靶细胞以浓度依赖性方式释放(图41A)。当LS-174T肿瘤细胞与从PBMC分离的幼稚T细胞T细胞共培养时，这些构建体仅具有基础活性–它们当中最有活性的是“(scFv)2”分子(图41B)。在又一个实验中，对靶向CD3和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的纯化“1+1IgGscFab，单臂倒置”(SEQIDNO:11、51、55)、“1+1IgGscFab”(57、61、213)，和“2+1IgGscFab”(57、59、61)和相应的“(scFv)2”分子分析当通过两种靶向部分与表达人FAP的成纤维细胞GM05389细胞上其相应靶抗原结合使构建体交联时它们在所述细胞中诱导T细胞介导凋亡的潜力。简而言之，将人GM05389靶细胞用胰蛋白酶在前一日收获，洗涤并重悬在AIM-V培养基中(Invitrogen#12055-091)。将30,000个细胞/孔铺种在圆底96孔板中并在37℃，5％CO2温育过夜以允许细胞恢复并贴壁。次日，将细胞离心，抛弃上清液并且添加新鲜培养基，以及以所示的浓度添加构建体或参比IgG的相应稀释物。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加人泛T效应细胞以获得最终E:T比率5:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用5μg/mlPHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。在37℃，5％CO2额外温育18小时过夜后，用LDH检测试剂盒(RocheAppliedScience，#11644793001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。如图42中所示，就EC50值而言，“2+1IgGscFab”构建体显示与“(scFv)2”分子可比较的细胞毒活性。“1+1IgGscFab，单臂倒置”构建体比这个测定法中测试的其他构建体活性更小。在另一组实验中，将CD3/MCSP“2+1IgGCrossfab，连接的轻链”(参见SEQIDNO:3、5、29、179)与CD3/MCSP“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)比较。简而言之，将靶细胞(人Colo-38、人MV-3或WM266-4黑素瘤细胞)在分析当日用细胞解离缓冲液(或在开始分析之前一天用胰蛋白酶)收获，洗涤并重悬于适宜的细胞培养基(RPMI1640，包含2％FCS和1％Glutamax)中。在平底96孔板中每孔铺种20000-30000个细胞并且如所示添加相应的抗体稀释物(一式三份)。添加PBMC作为效应细胞以获得最终效应子对靶细胞(E:T)比率10:1。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度，温育时间是22小时。如上文所述检测乳酸脱氢酶释放和归一化。图49至图52显示用MV-3黑素瘤细胞(图49)、Colo-38细胞(图50和51)或WM266-4细胞(图52)进行的四个测定法的结果。如图49中所示，在以MV-3细胞作为靶细胞的测定法中，与没有连接的轻链的构建体相比，具有连接的轻链的构建体效力更小。如图50和图51中所示，在以高度表达MCSP的Colo-38细胞作为靶细胞的测定法中，与没有连接的轻链的构建体相比，具有连接的轻链的构建体效力更强。最后，如图52中所显示，当使用高度表达MCSP的WM266-4细胞作为靶细胞时，在两种构建体之间不存在显著差异。在另一个实验中，比较了两种靶向CEA的“2+1IgGCrossfab，倒置”构建体，其中，在Crossfab片段中，V区(VL/VH，参见SEQIDNO:33、63、65、67)或C区(CL/CH1，参见SEQIDNO:65、67、183、197)交换。该测定法如上文所述进行，使用人PBMC作为效应细胞以及表达人CEA的靶细胞。将靶细胞(MKN-45或LS-174T肿瘤细胞)用胰蛋白酶-EDTA(LuBiosciences#25300-096)收获，洗涤并重悬在包含1％Glutamax(LuBiosciences#35050087)和2％FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042)中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加双特异性构建体。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加人PBMC效应细胞以获得最终E:T比率10:1，温育时间是28小时。使用GraphPadPrism5软件计算EC50值。如图61中所示，具有CL/CH1交换的构建体在两个靶细胞系上均比具有VL/VH交换的构建体显示略微更好的活性。对于CL/CH1-交换构建体和VL/VH-交换构建体，在MKN-45细胞上的计算EC50值分别是115pM和243pM，并且在LS-174T细胞上的计算EC50值分别是673pM和955pM。类似地，比较了两种靶向MCSP的“2+1IgGCrossfab”构建体，其中，在Crossfab片段中，V区(VL/VH，参见SEQIDNO:33、189、191、193)或C区(CL/CH1，参见SEQIDNO:183、189、193、195)交换。该测定法如上文所述进行，使用人PBMC作为效应细胞以及表达人MCSP的靶细胞。将靶细胞(WM266-4)用细胞解离缓冲液(LuBiosciences#13151014)收获，洗涤并重悬在包含1％Glutamax(LuBiosciences#35050087)和2％FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042)中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加构建体。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加人PBMC效应细胞以获得最终E:T比率10:1，温育时间是26小时。使用GraphPadPrism5软件计算EC50值。如图62中所示，两个构建体显示可比较的活性，具有CL/CH1交换的构建体具有略微较低的EC50值(与VL/VH-交换构建体的16.8pM相比，CL/CH1-交换构建体的EC50值为12.9pM)。图63显示用表达人MCSP的MV-3靶细胞进行的相似测定法的结果。再次，两个构建体显示可比较的活性，具有CL/CH1交换的构建体具有略微较低的EC50值(与VL/VH-交换构建体的大约82.2pM相比，CL/CH1-交换构建体的EC50值为大约11.7pM)。不能计算精确EC50值，因为杀伤曲线在化合物的高浓度没有抵达平顶(plateau)。在又一个实验中，将CD3/MCSP“2+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:3、5、29、33)和“1+1IgGCrossfab”(参见SEQIDNO:5、29、33、181)构建体与CD3/MCSP“1+1CrossMab”(参见SEQIDNO:5、23、183、185)比较。测定法如上文所述进行，使用人PBMC作为效应细胞并使用WM266-4或MV-3靶细胞(E:T比率＝10:1)和温育时间21小时。如图64中所示，“2+1IgGCrossfab”构建体是在这个测定法中最强力的分子，随后是“1+1IgGCrossfab”和“1+1CrossMab”。与高度表达MCSP的WM266-4细胞相比，采用表达中等水平MCSP的MV-3细胞时，这种排序甚至更明显。对于“2+1IgGCrossfab”、“1+1IgGCrossfab”和“1+1CrossMab”，在MV-3细胞上的计算EC50值分别是9.2、40.9和88.4pM，在WM266-4细胞上的计算EC50值分别是33.1、28.4和53.9pM。在又一个实验中，以E:T比率10:1使用MKN-45或LS-174T肿瘤靶细胞和人PBMC效应细胞并使用28小时温育时间，测试了不同浓度的“1+1IgGCrossfabLC融合”构建体(SEQIDNO:183、209、211、213)。如图65中所示，“1+1IgGCrossfabLC融合”构建体在MKN-45靶细胞中诱导凋亡，计算的EC50为213pM，而采用LS-174T细胞时，计算的EC50为1.56nM，这显示不同肿瘤抗原表达水平在某个时间段内部对双特异性构建体效力的影响。在又一个实验中，将“1+1IgGCrossfabLC融合”构建体(SEQIDNO:183、209、211、213)与非靶向的“2+1IgGCrossfab”分子比较。使用MC38-huCEA肿瘤细胞和人PBMC(E:T比率＝10:1)和24小时温育时间。如图66中所示，“1+1IgGCrossfabLC融合”构建体以浓度依赖性方式诱导靶细胞凋亡，计算的EC50为大约3.2nM。与之相反，非靶向的“2+1IgGCrossfab”仅在最高浓度显示抗原非依赖性T细胞介导的靶细胞杀伤作用。在最后的实验中，使用人MCSP阳性MV-3或WM266-4肿瘤细胞和人PBMC(E:T比率＝10:1)和约24小时温育时间，比较“2+1IgGCrossfab(V9)”(SEQIDNO:3、5、29、33)、“2+1IgGCrossfab，倒置(V9)”(SEQIDNO:5、23、183、187)、“2+1IgGCrossfab(抗CD3)”(SEQIDNO:5、23、215、217)、“2+1IgGCrossfab，倒置(抗CD3)”(SEQIDNO:5、23、215、219)。如图67中所示，对两种CD3结合物而言，“2+1IgGCrossfab，倒置”构建体的T细胞介导的杀伤作用似乎略微强于或至少等于“2+1IgGCrossfabt”构建体诱导的杀伤作用。计算的EC50值如下：实施例7CD107a/b测定法通过流式细胞术测试纯化的“2+1IgGscFab”构建体(SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”分子(二者均靶向人MCSP和人CD3)在表达人MCSP的肿瘤细胞存在或不存在下上调CD107a和胞内穿孔素水平的潜力。简而言之，在第1日，将30,000个Colo-38肿瘤靶细胞/孔是铺种在圆底96孔板中并在37℃，5％CO2温育过夜，以使其贴壁。原代人泛T细胞在第1日或第2日从暗黄覆盖层分离，如所述那样。在第2日，添加0.15百万个效应细胞/孔以获得最终E:T比率5:1。添加FITC缀合的CD107a/b抗体，以及不同的双特异性构建体和对照。将不同的双特异性分子和抗体调节至相同的摩尔数以获得终浓度9.43nM。在37℃，5％CO2温育1小时的步骤之后，添加莫能菌素以抑制分泌，并中和内体和溶酶体内部的pH。在5小时额外温育时间后，将细胞在4℃针对表面CD8表达染色30分钟。将细胞用染色缓冲液(PBS/0.1％BSA)洗涤，固定并使用BDCytofix/CytopermPlus试剂盒与BDGolgiStop(BDBiosciences#554715)透化20分钟。将细胞使用1xBDPerm/洗涤缓冲液洗涤2次，并且在4℃对穿孔素进行胞内染色30分钟。用1xBDPerm/洗涤缓冲液进行最终洗涤步骤后，将细胞重悬于PBS/0.1％BSA中并在FACSCantoII上分析(全部抗体均购自BDBiosciences或BioLegend)。如所示(图43)，对全部CD107a/b阳性细胞、穿孔素阳性细胞或双阳性细胞设门。“2+1IgGscFab”构建体仅在靶细胞存在下能够活化T细胞并上调CD107a/b和胞内穿孔素水平(图43A)，而“(scFv)2”分子还在靶细胞不存在的情况下显示活化T细胞的(弱)诱导作用(图43B)。与“(scFv)2”分子或其他双特异性构建体相比，双价参比抗CD3IgG产生较低水平的活化。实施例8增殖测定法通过流式细胞术测试纯化的“2+1IgGscFab”(SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”分子(二者均靶向人CD3和人MCSP)在表达人MCSP的肿瘤细胞存在或不存在下诱导CD8+或CD4+T细胞增殖的潜力。简而言之，将新鲜分离的人泛T细胞在温PBS中调节至1百万个细胞/ml并在室温用1μMCFSE染色10分钟。通过添加含有10％FCS和1％GlutaMax的RPMI1640培养基，使染液体积加倍。在室温温育另外20分钟后，将细胞用预温的培养基洗涤3次移除剩余的CFSE。将MCSP阳性Colo-38细胞用细胞解离缓冲液收获，计数并检查活力。将细胞在AIM-V培养基中调节至0.2x106个(活)细胞/ml，将100μl这种细胞悬液/孔吸至圆底96孔板中(如所示)。将50μl(稀释的)双特异性构建体添加至含有细胞的孔以获得终浓度1nM。将CFSE染色的人泛T效应细胞在AIM-V培养基中调节至2x106个(活)细胞/ml。将50μl这种细胞悬液添加测试平板的每个孔(见上文)以获得最终E:T比率5:1。为了分析所述双特异性构建体是否能够仅在表达肿瘤抗原huMCSP的靶细胞存在情况下活化T细胞，纳入这样的孔，所述孔含有1nM相应的双特异性分子以及PBMC，但是不含靶细胞。在37℃，5％CO2温育五日后，将细胞离心(5分钟，350xg)并用150μl/孔包含0.1％BSA的PBS洗涤两次。根据供应商的建议，在4℃对CD8(小鼠IgG1，κ；克隆HIT8a；BD#555635)、CD4(小鼠IgG1，κ；克隆RPA-T4；BD#560649)或CD25(小鼠IgG1，κ；克隆M-A251；BD#555434)进行表面染色30分钟。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次，重悬于200μl/孔含有0.1％BSA的PBS中，并使用FACSCantoII仪(SoftwareFACSDiva)分析。通过围绕非增殖性细胞设门并且相对作为参考的实测总细胞数目而利用这种设门情况的细胞数目，确定相对增殖水平。图44显示全部构建体均仅在靶细胞存在下诱导CD8+T细胞(A)或CD4+T细胞(B)增殖，与“(scFv)2”分子可比。从总体上看，在这个测定法中，活化的CD8+T细胞增殖多于活化的CD4+T细胞。实施例9细胞因子释放测定法分析纯化的“2+1IgGscFab”构建体(SEQIDNO:5、17、19)和“(scFv)2”分子(二者均靶向人MCSP和人CD3)在肿瘤靶细胞存在或不存在下诱导T细胞介导的细胞因子从头分泌的能力。简而言之，从暗黄覆盖层分离人PBMC并将0.3百万个细胞/孔铺种至圆底96孔板中。添加表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞以获得最终E:T比率10:1。以1nM终浓度添加双特异性构建体和IgG对照并将细胞在37℃，5％CO2温育24小时。次日，将细胞以350xg离心5分钟并将上清液转移至新的深孔96孔板用于后续分析。根据制造商的FACSCantoII说明书，使用人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD#551809)进行CBA分析。图45显示上清液中测量到的不同细胞因子水平。在靶细胞存在下，T细胞活化时分泌的主要细胞因子是IFN-γ。“(scFv)2”分子比“2+1IgGscFab”构建体诱导略微更高水平的IFN-γ。人TNF可能存在相同的倾向性，但是与IFN-γ相比，这种细胞因子的总体水平低得多。在靶细胞存在(或不存在)下活化T细胞时，不存在Th2细胞因子(IL-10和IL-4)的显著分泌。在不存在Colo-38靶细胞的情况下，仅观察到非常弱的TNF分泌诱导作用，所述TNF分泌诱导作用在“(scFv)2”分子处理的样品中最高。在第二实验中，分析了以下纯化的靶向人MCSP和人CD3的双特异性构建体：“2+1IgGCrossfab”构建体(SEQIDNO:3、5、29、33)、“(scFv)2”分子，以及包含野生型或突变(LALA、P329G和/或N297D，如所示)Fc结构域的不同“2+1IgGscFab”分子。简而言之，深孔96孔板的每个孔铺种280μl来自健康供体的全血。添加30000个表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞以及以1nM终浓度添加不同的双特异性构建体和IgG对照。将细胞在37℃，5％CO2温育24小时并随后以350xg离心5分钟。将上清液转移至新的深孔96孔板用于后续分析。根据制造商的FACSCantoII说明书，使用以下CBAFlexSet的组合进行CBA分析：人粒酶B(BD#560304)、人IFN-γFlexSet(BD#558269)、人TNFFlexSet(BD#558273)、人IL-10FlexSet(BD#558274)、人IL-6FlexSet(BD#558276)、人IL-4FlexSet(BD#558272)、人IL-2FlexSet(BD#558270)。图46显示上清液中测量到的不同细胞因子水平。在Colo-38肿瘤细胞存在下分泌的主要细胞因子是IL-6，随后是IFN-γ。此外，粒酶B的水平也在靶细胞存在下活化T细胞时强烈地增加。从总体上看，“(scFv)2”分子在靶细胞存在下诱导较高水平的细胞因子分泌(图46，A和B)。在靶细胞存在(或不存在)下活化T细胞时，不存在Th2细胞因子(IL-10和IL-4)的显著分泌。在这个测定法中，存在不同“2+1IgGscFab”构建体诱导的IFN-γ微弱分泌，甚至在靶细胞不存在的情况下也是如此(图46，C和D)。在这些条件下，不能在具有野生型或突变Fc结构域的“2+1IgGscFab”构建体之间观察到显著差异。实施例10抗MCSP抗体M4-3/ML2的亲和力成熟通过寡核苷酸定向诱变流程实施亲和力成熟。对于这种方法，将重链变体M4-3和轻链变体ML2克隆至噬菌粒载体中，与Hoogenboom所述(Hoogenboom等人,NucleicAcidsRes.1991,19,4133–4137)相似。通过以下方式确定待随机化的残基：首先通过经典同源性建模产生这种抗体的3D模型并且随后确定重链和轻链的互补决定区(CDR)的溶剂可及性残基。从Ella-biotech(Munich，德国)购买如表4中所示的基于三核苷酸合成的带有随机化的寡核苷酸。通过经典的PCR生成三个独立子文库，并且它们在CDR-H1和CDR-H2中或在CDR-L1和CDR-L2中含有随机化，CDR-L3以独立方法随机化。将这些文库的DNA片段通过限制性消化和连接克隆至噬菌粒中并随后电穿孔至TG1细菌中。文库选择将如此产生的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体粒子中展示为与每个粒子内部包装的M13的基因III产物的融合物。随后筛选噬菌体展示变体的生物活性(这里：结合亲和力)并且具有一种或多种改善活性的候选物用于进一步开发。用于制备噬菌体展示文库的方法可以在Lee等人,J.Mol.Biol.(2004)340,1073–1093)中找到。根据以下程序在溶液中用全部亲和力成熟文库实施选择：1.每个亲和力成熟文库的约1012个噬菌粒粒子在总体积1ml中与100nM生物素酰化hu-MCSP(D3结构域)-avi-his(SEQIDNO:390)结合0.5小时，2.通过添加5.4×107个链霉亲和素包被的磁珠维持10分钟，捕获生物素酰化的hu-MCSP(D3结构域)-avi-his和特异性结合的噬菌体粒子，3.使用5-10x1mlPBS/Tween20和5-10x1mlPBS洗涤所述珠，4.通过添加1ml100mMTEA(三乙胺)持续10分钟洗脱噬菌体粒子并通过添加500ul1MTris/HClpH7.4中和，以及5.再次感染指数生长的大肠杆菌TG1细菌，用辅助噬菌体VCSM13感染并随后PEG/NaCl沉淀待用于后续选择轮次中的噬菌粒粒子。使用恒定或递减(从10-7M至2x10-9M)抗原浓度，实施3-5轮选择。在第2轮中，使用中性抗生物素蛋白平板而非是链霉亲和素珠，捕获抗原:噬菌体复合物。通过ELISA如下鉴定特异性结合物：将100ul10nM生物素酰化的hu-MCSP(D3结构域)-avi-his/孔包被在中性抗生物素蛋白平板上。添加含有Fab的细菌上清液，并且通过使用抗Flag/HRP第二抗体借助它们的Flag-标签，检出结合Fab。ELISA阳性克隆按96孔样式用细菌表达为可溶性Fab片段，并且通过SPR分析，使用ProteOnXPR36(BioRad)，对上清液进行动力学筛选实验。鉴定到表达具有最高亲和力常数的Fab的克隆并且将相应的噬菌粒测序。表4(排除的总是Cys和Met。在寡核苷酸是反向引物的那些情况下首先排除Lys)图84显示与未成熟的亲本克隆(M4-3ML2)相比，亲和力成熟的抗MCSP克隆的比对结果。仅在CDR1和CDR2中进行重链随机化。在CDR1和CDR2中进行轻链随机化，并且在CDR3中独立地进行轻链随机化。在选择期间，在构架中出现一些突变，如克隆G3中的F71Y或克隆E10中的Y87H。人IgG1的产生和纯化将亲和力成熟变体的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1比例转染。为了转染，在CDCHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，用预温的20mlCDCHO培养基替换上清液。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。经过20个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。2ug样品用于分析。在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。表5:产生和纯化亲和力成熟的抗MCSPIgG亲和力确定ProteOn分析在25℃使用ProteOnXPR36仪(BioRad)，通过表面等离子体共振测量KD，其中抗人F(ab’)2片段特异性捕获抗体(JacksonImmunoResearch#109-005-006)通过胺偶联法固定在CM5芯片上并且随后从细菌上清液或从纯化的Fab制备物捕获Fab。简而言之，根据供应商说明书，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GEHealthcare)。用10mM乙酸钠，pH5.0稀释抗人F(ab’)2片段特异性捕获抗体为50μg/ml，之后以流速10μl/分钟注射以实现大约至多10000个响应单位(RU)的偶联捕获抗体。在注射捕获抗体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，来自细菌上清液的Fab或纯化的Fab以流速10μl/分钟注射300秒并且300秒解离用于捕获基线稳定。捕获水平处于100–500RU范围内。在后续步骤中，将人MCSP(D3结构域)-avi-his分析物在25℃以流速50μl/分钟作为单一浓度或(取决于范围在100nM和250pM之间的克隆亲和力)作为稀释于HBS-EP+(GEHealthcare，10mMHEPES，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)中的浓度系列注射。通过以90ul/分钟注射甘氨酸pH1.5持续30秒，随后以相同流速注入NaOH持续20秒，使传感器的表面再生。使用简单一对一Langmuir结合模型(ProteOnXPR36评价软件或Scrubber软件(BioLogic))，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。该数据用来确定亲和力成熟变体相对于亲本抗体的比较结合亲和力。表6a显示从这些测定法产生的数据。对于轻链，选择G3、E10、C5，并且对于重链，选择D6、A7、B7、B8、C1，转化成为人IgG1样式。由于轻链的CDR1和CDR2独立于CDR3随机化，所以将获得的CDR在IgG转化期间组合。在IgG样式下，重新测量针对人MCSP抗原(SEQIDNO:390)的亲和力，另外还测量针对食蟹猴同源物(SEQIDNO:389)的亲和力。使用正如对Fab片段(仅从哺乳动物生产纯化的IgG)所述的方法。表6a：MCSP亲和力成熟的克隆：Proteon数据使用BiacoreT200通过表面等离子体共振法(SPR)确定亲和力在25℃在BiacoreT200上进行表面等离子体共振(SPR)实验以确定亲和力成熟的IgG的亲和力和亲合力，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/德国)。为了分析针对人MCSPD3和食蟹猴MCSPD3的不同抗MCSPIgG相互作用的亲合力，在pH5.0使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)在CM5芯片上直接偶联约9,500个共振单位(RU)的抗五His抗体(Qiagen)。在30nM以10μl/分钟分别捕获抗原60秒。使IgG以0.0064-100nM的浓度，30μl/分钟流速经280秒流过流动小室。监测解离180秒。通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率差异。这里，使IgG在下述表面上流过，所述表面具有固定的抗五His抗体，但是在其上面已经注射HBS-EP而非人MCSPD3或食蟹猴MCSPD3。为了测量亲和力，在具有固定的抗人Fc的CM5传感器芯片表面上捕获IgG。通过使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)在pH5.0直接固定约9,500个共振单位(RU)，将捕获IgG与传感器芯片表面偶联。在10nM以30μl/分钟捕获IgG25秒。使人MCSPD3和食蟹猴MCSPD3以2-500nM的浓度，30μl/分钟流速经120秒流过流动小室。监测解离60秒。分别监测166nM和500nM浓度的缔合和解离1200秒和600秒。通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率差异。这里，使抗原在下述表面上流过，所述表面具有固定的抗人Fc抗体，但是在其上面已经注射HBS-EP而非抗MCSPIgG。使用BiacoreT200评价软件(vAA，BiacoreAB，Uppsala/瑞典)推算动力学常数，以通过数值积分拟合1:1Langmuir结合作用的速率方程。使用BiacoreT200，通过表面等离子体共振测量证实对人MCSPD3和食蟹猴MCSPD3的亲和力更高。此外，亲合力量值显示二价结合作用增加多达3倍(表6b)。表6b.针对人MCSP-D3和食蟹猴MCSPD3的抗MCSPIgG的亲和力和亲合力。实施例11制备含有M4-3(C1)/ML2(G3)的MCSPTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)作为抗MCSP抗体和制备人源化CH2527作为抗CD3抗体将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体重链Fc(扣)”:“载体轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(结)-FabCrossfab”)转染。为了转染，在CDCHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20mlCDCHO培养基替换。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。2μg样品用于分析。在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。表7a：MCSPTCB产生和纯化的总结图68显示MCSPTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子的示意图。图69和表7b显示MCSPTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子(SEQIDNO:278、319、320和321)的CE-SDS分析。表7b：MCSPTCB的CE-SDS分析峰kDa相应的链MCSPTCB非还原(A)1206.47MCSPTCB还原(B)129.15轻链ML2(C1)237.39轻链huCH2527366.07Fc(扣)494.52Fc(结)图70显示MCSPTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子(SEQIDNO:78、319、320和321)的分析性大小排阻色谱。实施例12制备含有CH1A1A98/992F1的CEATCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)作为抗CEA抗体和制备人源化CH2527作为抗CD3抗体将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体重链Fc(扣)”:“载体轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(结)-FabCrossfab”)转染。为了转染，在CDCHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20mlCDCHO培养基替换。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。2μg样品用于分析。在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。表8:CEATCB的产生和纯化总结图71显示CEATCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子的示意图。图72和表9显示CEATCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子(SEQIDNO:288、322、323和324)的CE-SDS分析。表9:CEATCB的CE-SDS分析图73显示CEATCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)分子(SEQIDNO:288、322、323和324)的分析性大小排阻色谱。实施例13GA903TCB与表达MCSP的细胞和表达CD3的细胞的结合在表达MCSP的人恶性黑素瘤细胞系(A375)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试GA903TCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μlPBS，0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的MCSPTCB(2.6pM-200nM)温育30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgGFcg片段特异的第二抗体(JacksonImmunoResearchLabPE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次并且使用FACSCantoII(SoftwareFACSDiva)，通过对DAPI阴性活细胞设门立即由FACS分析。使用GraphPadPrism5，获得结合曲线(图74A，与A375细胞结合，EC50＝3381pM；图74B，与Jurkat细胞结合)。实施例14MCSPTCB抗体诱导的T细胞杀伤作用使用一组表达不同水平MCSP的肿瘤细胞系，评估MCSPTCB抗体介导的T细胞杀伤作用(A375＝MCSP高，MV-3＝MSCP中等，HCT-116＝MCSP低，LS180＝MCSP阴性)。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)，制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上。在离心后(450xg，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50mlPBS填充。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤两次(离心步骤350xg，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添加(范围1pM–10nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时后，通过借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％TritonX-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示MCSPTCB诱导强烈和靶特异地杀伤MCSP+靶细胞系，而不杀伤MCSP-细胞系，图75A-D。表10中给出与杀伤测定法相关的、使用GraphPadPrism5计算的EC50值。表10.MCSPTCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达MCSP的肿瘤细胞的EC50值(pM)。细胞系MCSP受体拷贝数EC50(pM)A37538705812.3MV-32600009.4HCT-116367703.7LS180阴性n.d.实施例15在MCSPTCB抗体诱导的T细胞杀伤表达MCSP的肿瘤细胞后CD8+和CD4+效应细胞上的CD25和CD69上调使用抗体识别T细胞活化标志物CD25(晚期活化标志物)和CD69(早期活化标志物)，通过FACS分析评估在MCSPTCB抗体介导的T细胞杀伤表达MCSP的MV-3肿瘤细胞后CD8+和CD4+T细胞的活化。抗体和杀伤测定法条件基本上如上文所述(实施例14)，使用相同的抗体浓度范围(1pM–10nM一式三份)，E:T比率10:1和温育时间24小时。在温育后，将PBMC转移至圆底96孔板、以350xg离心5分钟并用含有0.1％BSA的PBS洗涤2次。根据供应商的说明进行CD8(FITC抗人CD8，BD#555634)、CD4(PECy7抗人CD4，BD#557852)、CD69(PE抗人CD69Biolegend#310906)和CD25(APC抗人CD25，BD#555434)的表面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。在离心后，将样品重悬于200μl/孔含有DAPI的PBS0.1％BSA中以排除死细胞用于FACS测量。在BDFACSFortessa分析样品。结果显示MCSPTCB在杀伤后诱导CD8+T细胞(图76A、B)和CD4+T细胞(图76C、D)上活化标志物(CD25、CD69)的强烈和靶特异性上调。实施例16在MCSPTCB抗体诱导的T细胞杀伤表达MCSP的肿瘤细胞后人效应细胞的细胞因子分泌通过FACS分析杀伤测定法后的细胞上清液，评估在MCSPTCB抗体诱导的T细胞杀伤表达MCSP的MV-3肿瘤细胞后人PBMC的细胞因子分泌。使用相同抗体并且杀伤测定法基本上如上文所述那样进行(实施例14和15)，使用E:T比率10:1和温育时间24小时。在温育时间结束时，将平板以350xg离心5分钟，将上清液转移至新的96孔板中并贮存在-20℃直至后续分析。使用BDCBA人可溶性蛋白FlexSet，根据制造商的说明书在FACSCantoII上检测分泌至细胞上清液中的粒酶B、TNFα、IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10。使用以下试剂盒：BDCBA人粒酶BBDCBA人粒酶BFlexSet#BD560304；BDCBA人TNFFlexSet#BD558273；BDCBA人IFN-γFlexSet#BD558269；BDCBA人IL-2FlexSet#BD558270；BDCBA人IL-4FlexSet#BD558272；BDCBA人IL-10FlexSet#BD558274。结果显示当杀伤时，MCSPTCB诱导IL-2、IFN-γ、TNFα、粒酶B和IL-10分泌(但不诱导IL-4分泌)，图77A-F。这些例子表明MCSPCD3双特异性抗体●显示与MCSP+A375细胞良好结合●诱导对MCSP+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，并且不杀伤MCSP-细胞系●在杀伤后诱导CD8+和CD4+T细胞上的活化标志物(CD25，CD69)的强烈和靶特异性上调●当杀伤时诱导IL-2、IFN-g、TNF-α、GrB和IL-10(但不诱导IL-4)分泌实施例17CEATCB与表达CEA的和表达CD3的细胞的结合在表达CEA的结肠腺癌细胞(LS180)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试CEATCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μlPBS，0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的CEATCB(3pM-200nM)温育30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgGFcg片段特异的第二抗体(JacksonImmunoResearchLabPE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次并且使用FACSCantoII(SoftwareFACSDiva)，通过对DAPI阴性活细胞设门立即由FACS分析。使用GraphPadPrism5，获得结合曲线(图78A，与LS180细胞结合；图78B，与Jurkat细胞结合)。实施例18CEATCB抗体诱导的T细胞杀伤作用在MKN45(高CEA)、LS180(中等CEA)和HT-29(低CEA)人肿瘤细胞上评估CEATCB抗体诱导的T细胞杀伤作用。使用人PBMC作为效应细胞并且与双特异性抗体温育24小时时检测杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)，制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上。在离心后(450xg，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50mlPBS填充。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤两次(离心步骤350xg，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添加(范围0.2pM–20nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后，通过借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％TritonX-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示CEATCB诱导对CEA+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，图79A-C。表11中给出与杀伤测定法相关的、使用GraphPadPrism5计算的EC50值。表11.CEATCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达CEA的肿瘤细胞的EC50值(pM)。细胞系CEA受体拷贝数EC50[pM]24小时MKN4528000095LS18092000560HT-293000n.d实施例19在CEATCB抗体诱导的T细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞后CD8+和CD4+效应细胞上的CD25和CD69上调使用抗体识别T细胞活化标志物CD25(晚期活化标志物)和CD69(早期活化标志物)，通过FACS分析评估在CEATCB抗体介导的T细胞杀伤表达CEA的LS180肿瘤细胞后CD8+和CD4+T细胞的活化。抗体和杀伤测定法条件基本上如上文所述(实施例18)，使用相同的抗体浓度范围(0.2pM–20nM一式三份)，E:T比率10:1和温育时间24小时。在温育后，将PBMC转移至圆底96孔板、以350xg离心5分钟并用含有0.1％BSA的PBS洗涤2次。根据供应商的说明进行CD8(FITC抗人CD8，BD#555634)、CD4(PECy7抗人CD4，BD#557852)、CD69(PE抗人CD69Biolegend#310906)和CD25(APC抗人CD25，BD#555434)的表面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。在离心后，将样品重悬于200μl/孔含有DAPI的PBS0.1％BSA中以排除死细胞用于FACS测量。在BDFACSFortessa分析样品。结果显示CEATCB在杀伤后诱导CD8+T细胞(图80A、B)和CD4+T细胞(图80C、D)上活化标志物(CD25、CD69)的强烈和靶特异性上调。实施例20在CEATCB诱导的T细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞后人效应细胞的细胞因子分泌通过FACS分析杀伤测定法后的细胞上清液，评估在CEATCB诱导的T细胞杀伤表达CEA的LS180肿瘤细胞后人PBMC的细胞因子分泌。使用相同抗体并且杀伤测定法基本上如上文所述那样进行(实施例18和19)，使用E:T比率10:1和温育时间24小时。在温育时间结束时，将平板以350xg离心5分钟，将上清液转移至新的96孔板中并贮存在-20℃直至后续分析。使用BDCBA人可溶性蛋白FlexSet，根据制造商的说明书在FACSCantoII上检测分泌至细胞上清液中的粒酶B、TNFα、IFN-γ、IL-4和IL-10。使用以下试剂盒：BDCBA人粒酶BBDCBA人粒酶BFlexSet#BD560304；BDCBA人TNFFlexSet#BD558273；BDCBA人IFN-γFlexSet#BD558269；BDCBA人IL-4FlexSet#BD558272；BDCBA人IL-10FlexSet#BD558274。结果显示当杀伤时，CEATCB诱导IFN-γ、TNFα、粒酶B、IL-4和IL-10分泌，图81A-E。这些例子显示CEACD3双特异性抗体●显示与CEA+细胞良好结合●诱导对CEA+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤。●在杀伤后诱导CD8+和CD4+T细胞上的活化标志物(CD25，CD69)的强烈和靶特异性上调●当杀伤时诱导IL-2、IFN-g、TNF-α、GrB和IL-10(但不诱导IL-4)分泌实施例21制备含有DP47GS的DP47GSTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置＝“非靶向的TCB”)作为非结合性抗体和制备人源化CH2527作为抗CD3抗体使用“非靶向的TCB”作为以上实验中的对照。双特异性抗体接合CD3e，但是不与任何其他抗原结合并且因此不能使T细胞与任何靶细胞交联(并随后不能诱导任何杀伤作用)。因此使用它作为本测定法中的阴性对照以监测任何非特异性T细胞活化。已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体重链Fc(扣)”:“载体轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(结)-FabCrossfab”)转染。为了转染，在CDCHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20mlCDCHO培养基替换。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。2ug样品用于分析。在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。表12:DP47GSTCB的产生和纯化总结图82和表13显示作为非结合性抗体的含有DP47GS的DP47GSTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)和作为抗CD3抗体的人源化CH2527的CE-SDS分析(SEQIDNO:325、326、327和328)。表13:DP47GSTCB的CE-SDS分析峰kDa相应的链DP47GSTCB非还原(A)1165.222条轻链丢失的分子2181.351条轻链丢失的分子3190.58无N联糖基化的正确分子4198.98正确的分子DP47GSTCB还原(B)127.86轻链DP47GS235.74轻链huCH2527363.57Fc(扣)493.02Fc(结)图83显示作为非结合性抗体的含有DP47GS的DP47GSTCB(2+1Crossfab-IgGP329GLALA倒置)和作为抗CD3抗体的人源化CH2527的分析性大小排阻色谱。(SEQIDNO:325、326、327和328)。实施例22：AVHTCB的制备已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1:1比率(“载体重链AVH-Fc(扣)”:“载体轻链抗CD3”:“载体重链AVH-Fab(抗CD3)-Fc(结)”)转染。为了转染，在CDCHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20mlCDCHO培养基替换。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。2μg样品用于分析。在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。表14:aVHTCB的产生和纯化总结图85显示aVHTCB分子的示意图。图86和表15显示含有Crossfab片段的aVHTCB分子(2+1Crossfab-IgGP329GLALA)(SEQIDNO:369、370和371)的CE-SDS分析，所述Crossfab片段具有一个CD3结合部分和两个结合MCSP的aVH部分。表15：aVHTCB的CE-SDS分析峰kDa相应的链aVHTCB非还原(A)158.42145.6正确的分子3206.19Fc(结)-同型二聚体4249aVHTCB还原(B)127.5轻链huCH2527)234.5aVH-Fc(扣)391.3aVH-Fab-Fc(结)实施例23：aVHTCB与表达MCSP的细胞和表达CD3的细胞的结合在表达MCSP的人黑素瘤细胞系(MV-3)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试aVHTCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μlPBS，0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的aVHTCB(2pM-170nM)温育30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgGFcg片段特异的第二抗体(JacksonImmunoResearchLabPE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次并且使用FACSCantoII(SoftwareFACSDiva)，立即由FACS分析。使用GraphPadPrism5，获得结合曲线(图87A，与MV3细胞结合；图87B，与Jurkat细胞结合)。实施例24：aVHTCB抗体诱导的T细胞杀伤作用在温育24小时和48小时使用表达MCSP的人黑素瘤肿瘤细胞(MV-3)和人PBMC评估aVHTCB抗体介导的T细胞杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)，制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上。在离心后(450xg，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50mlPBS填充。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤两次(离心步骤350xg，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添加(范围110pM–80nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后，通过借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％TritonX-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示aVHTCB诱导对MCSP+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，图88A、B。表16中给出与杀伤测定法相关的、使用GraphPadPrism5计算的EC50值。表16.aVHTCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达MCSP的肿瘤细胞(MV-3)的EC50值(pM)。细胞系EC50[pM]24小时EC50[pM]48小时MV-39119.58967附图简述图87：aVHTCB与MV-3细胞(MCSP+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。图88：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对MV-3黑素瘤细胞由aVHTCB抗体诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC)。实施例25：锚蛋白重复序列蛋白(DARPIN)-TCB的制备已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1:1比率(“载体重链DARPIN-Fc(扣)”:“载体轻链抗CD3”:“载体重链DARPIN-Fab(抗CD3)-Fc(结)”)转染。为了转染，在CDCHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20mlCDCHO培养基替换。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。2μg样品用于分析。在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。图89显示Darpin-TCB分子的示意图。表17：DARPIN-TCB的产生和纯化总结图90和表18显示含有Crossfab片段的DARPIN-TCB分子(2+1Crossfab-IgGP329GLALA)(SEQIDNO:376、377和378)的CE-SDS分析，所述Crossfab片段具有一个CD3结合部分和两个结合HER2的Darpin部分。表18：DarpinTCB的CE-SDS分析峰kDa相应的链DARPINTCB非还原(A)1107.5轻链丢失的正确分子2140.38正确的分子DARPINTCB还原(B)134轻链huCH2527)249.5Darpin-Fc(扣)376.6Darpin-Fab-Fc(结)实施例26：DarpinTCB与表达Her2的和表达CD3的细胞的结合在表达Her2的人黑素瘤细胞系(KPL-4)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试DarpinTCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μlPBS，0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的DarpinTCB(3pM-200nM)温育30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgGFcg片段特异的第二抗体(JacksonImmunoResearchLabPE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次并且使用FACSCantoII(SoftwareFACSDiva)，立即由FACS分析。使用GraphPadPrism5，获得结合曲线(图91A，与KPL-4细胞结合；图91B，与Jurkat细胞结合)。实施例27：DarpinTCB抗体诱导的T细胞杀伤作用在温育24小时和48小时使用表达Her2的人黑素瘤肿瘤细胞(KPL4)和人PBMC评估DarpinTCB抗体介导的T细胞杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)，制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上。在离心后(450xg，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50mlPBS填充。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤两次(离心步骤350xg，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添加(范围2pM–20nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后，通过借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％TritonX-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示DarpinTCB诱导对Her2+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，图92A、B。表19中给出与杀伤测定法相关的、使用GraphPadPrism5计算的EC50值。表19.DarpinTCB抗体诱导的T细胞介导对表达Her2的肿瘤细胞(KPL-4)的杀伤作用的EC50值(pM)。细胞系EC50[pM]24小时EC50[pM]48小时KPL-4376.5234.6实施例28：hIgG1DDKKTCB的制备已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1:2:1比率(“载体重链Fc(KK)”:“载体轻链Crossfab”:“载体轻链”:“载体重链Fc(KK)FabCrossfab”)转染。为了转染，在CDCHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20mlCDCHO培养基替换。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。2μg样品用于分析。在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。携带具有DDKK突变的Fc的人IgG1可以用来产生T细胞双特异性异二聚体分子。第一纯化步骤后，主要群体是含有Fc(KK)的同型二聚体分子。可以主要通过大小排阻层析移除这种LMW不纯物并且可以富集正确的异二聚体。表20：hIgG1DDKKTCB的产生和纯化总结图93显示hIgG1DDKK-TCB分子的示意图。图94和表21显示含有Crossfab片段的hIgG1DDKK-TCB分子(2+1Crossfab-IgGP329GLALA)(SEQIDNO:372、373、374和375)的CE-SDS分析，所述Crossfab片段具有一个CD3结合部分和两个MCSP结合部分。表21:hIgG1DDKKTCB的CE-SDS分析峰kDa相应的链hIgG1DDKKTCB非还原(A)130.2未结合的轻链2170.4FC(KK)同型二聚体3207.9正确的分子hIgG1DDKKTCB还原(B)127.4轻链ML2(G3)234.33轻链huCH2527364.7Fab-Fc(KK)496.1Fab-Crossfab-Fc(DD)实施例29：hIgG1DDKKTCB与表达MCSP的和表达CD3的细胞的结合在表达MCSP的人黑素瘤细胞系(MV-3)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试hIgG1DDKKTCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μlPBS，0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的hIgG1DDKKTCB(2pM-170nM)温育30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgGFcg片段特异的第二抗体(JacksonImmunoResearchLabPE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS0.1％BSA洗涤两次并且使用FACSCantoII(SoftwareFACSDiva)，立即由FACS分析。使用GraphPadPrism5，获得结合曲线(图95A，与MV-3细胞结合，EC50＝12803pM；图95B，与Jurkat细胞结合)。实施例30：hIgG1DDKKTCB抗体诱导的T细胞杀伤作用在温育24小时和48小时使用表达MCSP的人黑素瘤肿瘤细胞(MV-3)和人PBMC评估hIgG1DDKKTCB抗体介导的T细胞杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)，制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上。在离心后(450xg，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50mlPBS填充。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤两次(离心步骤350xg，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添加(范围0.02pM–20nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后，通过借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％TritonX-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示hIgG1DDKKTCB诱导对MCSP+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，图96A、B。表22中给出与杀伤测定法相关的、使用GraphPadPrism5计算的EC50值。表22.hIgG1DDKKTCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达MCSP的肿瘤细胞(MV-3)的EC50值(pM)。细胞系EC50[pM]24小时EC50[pM]48小时MV-320.67在所附序列表中提供SEQIDNO:1-266。序列DNA序列虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述了前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。当前第1页1 2 3