一种荧光探针NASA及其制备和应用的制作方法

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种可用于检测S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,简称SAHH)的荧光探针。在1，8-萘酰亚胺上引入腺苷分子，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。

背景技术：

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH,EC:3.1.3.1)是细胞内广泛存在的一种酶,它催化S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)水解生成腺苷和同型半胱氨酸。抑制SAHH将导致细胞内甲基化抑制物AdoHcy的堆积,从而对转甲基反应产生反馈性抑制作用。而甲基化对于维持细胞的活性是必需的。鉴于SAHH在调节生物体转甲基化反应中的核心地位,它已被选择作为多种新药研发的重要靶点,包括免疫抑制剂、抗病毒药、防治动脉粥样硬化和阿尔茨海默病药物。SAHH抑制剂全新的化学结构、良好的作用效果和独特的作用靶点已引起国内外研究者广泛的兴趣。

荧光探针是有效检测生命体内SAHH的手段之一，相比吸光度法具有检测灵敏的优势。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。目前应用于检测SAHH的荧光探针寥寥无几，查阅只见利用S-腺苷同型半胱氨酸的代谢产物Hcy来间接检测SAHH的方法。因此开发对其SAHH的探针具有很大挑战性。

技术实现要素：

本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内SAHH的荧光探针，此探针可以在生理条件下选择性地与SAHH作用，作用后荧光显著增强。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种可用于检测S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homoc ysteine hydrolase,简称SAHH)的荧光探针。主要合成方法为在SAHH的作用部位腺苷上通过C-S键连接1，8-萘酰亚胺；该化合物在SAHH作用下，生成4-巯基-1，8-萘酰亚胺，利用反应前后荧光性质的差异实现对SAHH的选择性检测。

合成的探针化合物的结构用代号NASA表示。

所述荧光探针的结构式Ⅰ如下。

所述的荧光探针的制备方法为：在SAHH的作用部位腺苷上通过C-S键连接1，8-萘酰亚胺；具体制备步骤如下，

1)在干燥THF50ml中加入三苯基膦(cas：603-35-0)3.76g，搅拌至全溶。冰浴条件下，5min内缓慢滴加偶氮二羧酸二乙酯(cas：1972-28-7)2.2ml。搅拌30min后，加入2',3'-异丙叉腺苷(cas：362-75-4)2.1g。维持0度搅拌10min。5min内缓慢滴加硫代乙酸(cas：507-09-5)1.0ml。0度反应1小时后，旋干溶剂，得到的黄色固体用柱层析(CHCl₂-MeOH,100:0,95:5,90:10)分离。得到化合物11.62g，产率为65％。

2)在20ml乙醇中，加入4-溴-1，8-萘酐(cas：81-86-7)1g与1-丁胺(cas：109-73-9)353uL，78度回流4小时。反应完后旋干溶剂，得到产物21.2g，产率100％。

3)在干燥的甲醇中，加入步骤1)中产物1500mg和步骤2)中产物453mg，降温到-20度，加入甲醇钠(cas：124-41-4)147mg。溶液缓慢上升到室温，持续反应20h。反应结束后旋干溶剂，柱层析分离(CHCl₂-MeOH,100:0,95:5,90:10)，得到产物3314mg，产率40％。

4)在水和甲酸1:1的溶液2ml中，0度下加入步骤3)中产物3100mg，缓慢上升到室温反应4h，加温到50度反应2h。反应完后旋干溶剂。柱层析得到荧光探针NASA50mg，产率53％。

步骤1)中所述的三苯基膦、偶氮二羧酸二乙酯、2',3'-异丙叉腺苷、硫代乙酸的加入量为2:2:1:2；步骤3)中化合物1与甲醇钠的加入量为1:2.2。

所述步骤1)中，所用的溶剂为无水四氢呋喃；所述的步骤1)—4)中搅拌的方式为磁力搅拌。

所述的荧光探针可以被S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocys teine hydrolase,简称SAHH)代谢而产生荧光变化。即所述的荧光探针与SAHH作用后，荧光峰从500nm蓝移到470nm处，并且有显著的荧光增强。

所述的荧光探针应用于检测SAHH时，其荧光变化是因为生成具有结构II的化合物；

该探针可以用于S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的抑制剂筛选。

本发明的有益效果：

该化合物在SAHH存在下荧光发生显著改变，可用于高灵敏性、高通量地检测SAHH。尤其是，该化合物可用于S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的抑制剂筛选。

本发明可用于检测体外S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homoc ysteine hydrolase,简称SAHH)的荧光探针。主要合成方法为在SAHH的作用部位腺苷上通过C-S键连接1，8-萘酰亚胺生成结构为的化 合物；在SAHH作用下，生成利用反应前后荧光性质的差异实现对SAHH的检测，该探针可以高灵敏性，高通量地用于SAHH抑制剂的筛选。

附图说明

图1实施例1中提供的荧光探针NASA的合成路线图；

图2本发明提供的荧光探针NASA检测SAHH的原理示意图；

图3实施例1中合成的探针NASA的¹H NMR(a)，¹³C NMR(b)；

图4实施例2中荧光探针NASA水溶液的荧光激发光谱(a)、发射光谱(b)；

图5实施例3中荧光探针NASA的水解产物水溶液的荧光激发光谱(a)、发射光谱(b)；

图6实施例4中荧光探针NASA与SAHH响应后光谱470nm峰值随时间的线性关系图；

图7实施例5中荧光探针NASA与不同浓度的SAHH响应后光谱变化图；

图8实施例6中荧光探针NASA与SAHH反应检测470nm荧光强度的动力学示意图；

图9实施例7中以荧光探针NASA为底物，Dznep能够抑制SAHH的酶活性；

图10实施例8中以荧光探针NASA为底物，检测SAHH的四种抑制剂的IC50值。

具体实施方式

下述实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。

实施例1(探针的合成)：

如图1所示，NASA的合成分为4步(如上)，化合物1的鉴定为：MS:366.12(positive mode).¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):8.37(s,1H),8.19(s,1H)，6.07(d,1H，J＝2.08Hz)，5.77(s，2H),5.51(d,1H,J＝6.36Hz),4.97(d,1H,J＝6.36Hz),4.34(t,1H,J＝6.88Hz),3.29(d,1H,J＝7.2Hz),3.08(d,1H,J＝6.64Hz),1.60(s,3H),1.39(s,3H)。化合物3的鉴定：MS:575.20(positive mode).¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):8.59(d,1H,J＝7.28Hz),8.55(d,1H,J＝8.48Hz),8.37(d,1H,J＝7.76Hz),8.27(s,1H),7.78(s,1H),7.71(t,1H,J＝8.16Hz),7.57(d,1H,J＝7.8Hz),6.08(s,1H)，5.56(d,1H,J＝6.2Hz)，5.20(d,1H,J＝6.12Hz),4.52(t,1H,J＝6.76Hz)，4.16(t，2H,J＝7.64Hz),3.55(m,1H),3.41(m,1H),1.70(m,2H),1.58(s,3H),1.46(m,2H)，1.39(s,3H)，0.97(t，3H,J＝7.32Hz)。目标化合物NASA(黄色固体)。MS:535.17(positive mode).¹HNMR(500MHz,Dime thylsulfoxide-d6)δ(ppm):8.53(d，1H，J＝8.4Hz)，8.52(d,1H，J＝6.9Hz),8.36(s,1H)，8.32(d,1H,J＝7.85Hz),8.13(s,1H),7.87(d,1H,J＝8.05Hz)，7.83(d,1H,J＝8.00Hz),7.26(s,2H),5.93(d,1H,J＝5.5Hz),5.56(d,1H,J＝5.95Hz),5.43(d,1H,J＝5.15Hz),4.87(m,1H),4.33(m,1H),4.18(m,1H),4.03(m,1H),3.75(m,1H),3.68(m,1H),1.61(m,2H),1.35(m,2H),0.92(t,3H,J＝7.3Hz)。¹³CNMR(100MHz,Dimethylsulfoxide-d6)δ(ppm):163.10,163.03,156.01,152.53,149.29,143.69,139.95,130.96,130.21,129.63,128.75,127.49,127.19,123.58，122.68,119.16,118.71,87.77,82.19,72.87,72.51,34.19,29.58,19.70,13.61。(图3为化合物NASA的氢谱(a)，碳谱(b))

实施例2

如图4所示，将NASA溶于10mM的PBS缓冲液中，配置成20uM的溶液。用荧光酶标仪(Thermofisher)检测器检测NASA水溶液的荧光激发光谱(a)、荧光发射光谱(b)；结果显示探针NASA的最大激发/发射波长为400nm/512nm。

实施例3

如图5所示，将NI-SH溶于10mM的PBS缓冲液中，配置成20uM的溶液。用荧光酶标仪(Thermofisher)检测器检测NASA水溶液的荧光激发光谱(a)、荧光发射光谱(b)；结果显示NASA代谢产物的最大激发/发射波长为380/470nm。

实施例4：

在196ul的PBS缓冲液中加2ul NASA的DMSO溶液(500uM)，2ul的酶(10mg/ml)。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量,每两分钟扫一次发射谱。λex＝380nm，光栅宽度为5nm，λem＝470nm，470nm处荧光值随时间作图为线性，结果如图6所示。

实施例5

将100mg/ml的SAHH酶储液浓度梯度稀释，得到50/25/10/5/2.5/1/0.5/0.25/0.1mg/ml的酶储液。每个反应在178ul的PBS缓冲液中加2ul NASA(500uM)以及20ul不同浓度的酶，孵育20min后测量。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝380nm，光栅宽度为5nm，发射范围从400nm-600nm。结果显示如图7，随酶浓度的增长，470nm处的荧光强度随之增强。

实施例6：

将100mg/ml的SAHH酶储液浓度梯度稀释，得到50/25/10/5/2.5/1/0.5/0.25/0.1mg/ml的酶储液。每个反应在178ul的PBS缓冲液中加2ul NASA(500uM)以及20ul不同浓度的酶，37℃下每2min扫一次470nm的荧光值(λex＝380nm)。结果显示如图8，470nm处的荧光强度随时间，随酶浓度而增强。

实施例7：

配置SAHH特异性抑制剂Dznep(5mM)，在176ul的PBS缓冲液中加2ul NASA(500uM)，2ul的抑制剂或2ul缓冲液(对照)以及20ul的酶，37℃孵 育下每2min扫一次470nm的荧光值(λex＝380nm)。如图9，NASA被SAHH的催化作用可以被50uM Dznep(SAHH经典抑制剂)完全抑制，再次证明NA SA是SAHH的探针底物。

实施例8：

配置NASA特异性抑制剂Dznep(5mM)/Adenosine(100mM)/3-deazaadenosine(100mM)/2-Deoxyadenosine(100mM)储液，以及十倍稀释的抑制剂储液，每个反应在176ul的PBS缓冲液(10mM)中加2ul NASA(500uM)以及20ul的酶(10mg/ml)以及2ul的抑制剂。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝380nm，光栅宽度为5nm，λem＝470nm。如图10所示，用log(抑制剂浓度)与酶残留活性百分比作图，得到四种化合物的IC50值分别是Dznep：0.88uM；Adenosine:8.02uM；2’-De oxyadenosine 56.77uM；3’-Deazaadenosine 11.02uM。