具有免疫疾病治疗效果的新型化合物及其应用的制作方法

本发明涉及免疫疾病的治疗及预防效果优异的新型化合物及其应用。
背景技术：
：免疫疾病是哺乳类免疫系的组成成分导致或介导哺乳类的病理状态，或者对哺乳类的病理状态作出其它贡献的疾病，尤其，炎症性疾病是在全世界最为重要的健康问题中的一种。通常，炎症是对根据外部物质或有害刺激的宿主侵入作出的身体组织的局部化的保护反应。炎症的原因有诸如细菌、病毒及寄生虫的感染性原因；诸如烧伤或放射线照射的物理性原因；诸如毒素、药物或产业型制剂的化学药品；诸如过敏及自身免疫反应的免疫性反应，或者与氧化应激关联的状态。炎症的特征在于，疼痛、泛红现象、浮肿、发烧及被感染的区域的终极功能损失。这些症状为在免疫系的细胞之间产生的一系列复杂的相互作用的结果。由于细胞的反应最终形成多个组的炎症介质的相互作用网。蛋白质(例如，细胞因子、酶(例如，蛋白酶、过氧物酶)、主要碱性蛋白质、粘附分子(ICAM,VCAM)、脂质介质(例如，类二十烷酸、前列腺素、白三烯、血小板活化因子(PAF))、活性氧(例如，过氧化氢、超氧阴离子O2-、一氧化氮(NO)等)。然而，炎症的这些介质中的大部分也是正常的细胞活性的调节者。因此，由于炎症反应的缺乏，宿主会不受控制地受到损伤(即，感染)，因此，由于慢性炎症而部分地导致炎症性疾病，所述炎症性疾病是因上面提及的介质中的多个过多生成而介导的。并且，作为免疫疾病中的一种的自身免疫疾病，其特征在于，免疫体系攻击其自身的器官，从而产生自发性反应。这些反应是根据T淋巴细胞的自身抗原(auto-antigen)的认知所引起的，由此诱发体液(生成自身抗原)及细胞(淋巴细胞及巨噬细胞的细胞毒性活性得到增加)免疫反应。自身免疫疾病可以例举如下：类风湿性疾病，银屑病，全身性皮肌炎，多发性硬化症，红斑狼疮，或者根据抗原的免疫反应恶化，即哮喘，对药物或食物的过敏等。这些疾病均为限制性且慢性的疾病，根据情况会是致命的，目前为止没有能够治疗上述疾病的有效的治疗方法。因此，在这些疾病的进行过程中，只要是能够减轻或缓解的药物、医药或介质，为了患者的健康，将会成为重要的解决手段。为了探索自身免疫疾病的治疗方法从而找到适当的药物和方法，一直进行了集中的努力。如今，自身免疫疾病的治疗主要是根据免疫抑制药物的使用，例如，根据糖皮质激素(glucocorticoids)、钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurininhibitors)及抗增殖-抗代谢药物(antiproliferatives-antimetabolites)的使用。然而，如上所述的药理疗法将对多种靶起到作用，因此整体上可能会降低免疫功能。另一方面，长时间使用这些药理疗法的情况下，多种细胞毒性作用将成为问题，因此通过非特异性的方式来抑制免疫体系，从而会使患者暴露在得感染症及癌的危险中。就钙调磷酸酶和糖皮质激素而言，因它们的肾毒性和糖尿病诱发特性而显示出另一种问题，因此在几种临床症状的情况(例：肾功能不全、糖尿病等)中的使用会受到限制。因此，目前需要开发出作为能够治疗诸如自身免疫疾病、炎症性疾病等免疫疾病的物质的没有副作用且治疗效果优异的新免疫疾病治疗剂。对此，本发明人在摸索既对人体副作用小且能够有效地预防或治疗免疫疾病的材料时，确认了新合成的新型化合物能够有效地治疗免疫疾病，从而完成了本发明。技术实现要素：要解决的技术问题因此，本发明的目的在于，提供新型化合物。此外，本发明的另一目的在于，提供用于预防或治疗免疫疾病的药学组合物，其包含所述新型化合物作为有效成分。此外，本发明的另一目的在于，提供免疫调节剂，其包含所述新型化合物作为有效成分。此外，本发明的另一目的在于，提供减少由未分化T细胞分化为Th17细胞、以及减少Th17细胞活性的方法，其通过在试管内用所述本发明的新型化合物对未分化T细胞进行处理来实现。此外，本发明的另一目的在于，提供增加由未分化T细胞分化为调节性T(Treg)细胞、以及增加Treg细胞活性的方法，其通过在试管内用所述本发明的新型化合物对未分化T细胞进行处理来实现。技术方案为了实现上述目的，本发明提供新型双胍衍生物化合物。此外，本发明提供用于预防或治疗免疫疾病的药学组合物，其包含所述本发明的新型化合物作为有效成分。本发明的一实施例中，所述化合物能够减少或抑制炎症性细胞因子的生成，抑制自身抗体的生产，抑制破骨细胞的分化。本发明的一实施例中，所述炎症性细胞因子可以为IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9或STAT-3。本发明的一实施例中，所述抗体可以为IgG、IgG1或IgG2a。本发明的一实施例中，所述化合物可以为促进或增加调节性T细胞(RegulatoryTcell)的活性且减少或抑制作为病原细胞的Th17细胞的活性的化合物。本发明的一实施例中，所述化合物可以以0.1mM～10mM的浓度包含在组合物中。本发明的一实施例中，所述免疫疾病可以选自自身免疫疾病；炎症性疾病；以及细胞、组织或器官的移植排斥(transplantationrejection)疾病。本发明的一实施例中，所述免疫疾病可以选自类风湿性关节炎、白塞氏病、多发性肌炎或皮肌炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、特应性皮炎、哮喘、原发性肝硬化、皮肌炎、肺出血肾炎综合征、自身免疫性脑膜炎、干燥综合征、狼疮、爱迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、胰岛素依赖型糖尿病、营养不良型大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、多发性硬化症、重症肌无力症、寻常型天疱疮、银屑病、风湿热、结节病、硬皮症、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、线粒体相关综合征及溃疡性结肠炎。本发明的一实施例中，所述移植排斥疾病可以为移植物抗宿主病(Graftversushostdisease)。此外，本发明提供免疫调节剂，其包含所述本发明的新型化合物作为有效成分。此外，本发明提供减少由未分化T细胞分化为Th17细胞、以及减少Th17细胞活性的方法，其通过在试管内用所述本发明的新型化合物对未分化T细胞进行处理来实现。此外，本发明提供增加由未分化T细胞分化为Treg细胞、以及增加Treg细胞活性的方法，其通过在试管内用所述本发明的新型化合物对未分化T细胞进行处理来实现。发明效果本发明涉及能够有效地预防及治疗免疫疾病的新型化合物及其应用。本发明的新型化合物不仅抑制炎症性细胞因子的生成，增加具有免疫调节功能的调节性T细胞的活性，而且抑制自身抗体的生产，从而能够控制过度的免疫反应，并且具有能够抑制破骨细胞的分化的效果，从而能够以用于治疗免疫疾病的用途使用，所述免疫疾病为因各种免疫反应的调节异常所诱发的诸如自身免疫疾病、炎症性疾病及移植排斥疾病。附图说明图1是示出将正常小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-281化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。此时，观察用SD-281化合物处理后破骨细胞分化是否得到调节。图2是示出将正常小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-281化合物进行处理，对抑制Th17、促进Treg活性、抑制过度活化的Th17的程度进行分析的结果，以及对从小鼠骨髓细胞(BM)诱导的破骨细胞的分化抑制能力进行分析的结果。图3是示出将被诱导出类风湿性关节炎的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-281化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体的生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图4是示出将被诱导出类风湿性关节炎的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-281化合物进行处理，对抑制Th17、促进Treg活性、抑制破骨细胞分化的程度进行分析的结果。图5是示出将狼疮发病的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-281化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体的生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图6是示出将狼疮发病的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-281化合物进行处理，对抑制Th17及促进Treg活性的程度进行分析的结果。图7是示出将从人外周血液分离的淋巴细胞作为对象，用不同浓度的SD-281化合物进行处理，对细胞毒性及炎症性细胞因子的生成程度进行分析的结果。图8是示出将正常小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-282化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体的生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图9是示出将正常小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-282化合物进行处理，对抑制Th17、促进Treg活性、抑制破骨细胞分化及抑制过度活化的Th17的程度进行分析的结果。图10示出将被诱导出类风湿性关节炎的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-282化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体的生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图11是示出将被诱导出类风湿性关节炎的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-282化合物进行处理，对抑制Th17、促进Treg活性、抑制破骨细胞分化的程度进行分析的结果。图12是示出将狼疮发病的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-282化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体的生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图13是示出将狼疮发病的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-282化合物进行处理，对抑制Th17及促进Treg活性的程度进行分析的结果。图14是示出将从人外周血液分离的淋巴细胞作为对象，用不同浓度的SD-282化合物进行处理，对细胞毒性及炎症性细胞因子的生成程度进行分析的结果。图15是示出将正常小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-283化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图16是示出将正常小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-283化合物进行处理，对抑制Th17、促进Treg活性、抑制破骨细胞分化以及抑制过度活化的Th17的程度进行分析的结果。图17是示出将被诱导出类风湿性关节炎的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-283化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体的生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图18是示出将被诱导出类风湿性关节炎的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-283化合物进行处理，对抑制Th17、促进Treg活性、抑制破骨细胞分化的程度进行分析的结果。图19是示出将狼疮发病的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-283化合物进行处理，对细胞毒性、自身抗体的生产程度、炎症性细胞因子的生成及炎症性基因的表达程度进行分析的结果。图20是示出将狼疮发病的小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-283化合物进行处理，对抑制Th17及促进Treg活性的程度进行分析的结果。图21是示出将从人外周血液分离的淋巴细胞作为对象，用不同浓度的SD-283化合物进行处理，对细胞毒性及炎症性细胞因子的生成程度进行分析的结果。图22是示出将正常小鼠的脾细胞作为对象，用不同浓度的SD-284化合物进行处理，对细胞毒性、炎症性细胞因子的生成及抑制Th17及促进Treg活性的程度进行分析的结果。图23是示出将从人外周血液分离的淋巴细胞作为对象，用不同浓度的SD-284化合物进行处理，对细胞毒性及炎症性细胞因子的生成程度进行分析的结果。图24是示出本发明的新型化合物对作为炎症性细胞因子的TNF-a及IL-17生成的抑制活性进行分析的结果。优选实施方式本发明的特征为，最早查明可以使用下述新型化合物作为能够有效预防或治疗免疫疾病的新治疗剂。因此，本发明可以提供以下述化学式表示的新型化合物或其药学上可接受的盐：所述式中，X为一个以上的F、Cl、Br或H；R为氢或烷基。更优选地，所述化学式的化合物为选自下述表中记载的24个化合物中的任一种：本发明人进行了用于确认所述本发明中合成的新型化合物是否能够治疗免疫疾病的实验，根据本发明的一实施例，所述化合物均显示出具有减少或抑制炎症性细胞因子的生成的活性、抑制自身抗体的生产的活性、抑制破骨细胞的分化的活性，此时，所述炎症性细胞因子并不限定于此，但可以为IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9或STAT-3。并且，本发明中可以得知所述化合物会抑制作为自身抗体的IgG、IgG1或IgG2a的生产，从而具有能够抑制过度的免疫反应的调节能力。进而，可以确认所述本发明的化合物具有促进或增加调节性T细胞(RegulatoryTcell)的活性，并且还具有减少或抑制作为病原细胞的Th17细胞活性的活性。因此，通过这些结果，本发明人可以确认所述本发明的新合成的所述化合物作为能够有效治疗免疫疾病的新治疗剂的可能性。另外，有在免疫体系中负责中心作用的细胞群的一种的T细胞作为对各种病原体的生物防护体系。就T细胞而言，在人体的胸腺生成，并经过一系列分化过程而分化成具有固有特性的T细胞，完成分化的T细胞根据其功能大致分为1型辅助细胞(Th1)和2型辅助细胞(Th2)。其中，Th1细胞的主要功能是参与细胞介导免疫，Th2细胞参与体液性免疫，在免疫体系中这两种细胞群体通过相互牵制，以使不得相互过度活化，从而维持免疫体系的均衡。因此，免疫疾病的大部分可以看作是由这两种免疫细胞之间的不均衡引起的，例如，已知当Th1细胞的活性非正常地增加时，会发生自身免疫疾病，当Th2细胞的活性非正常地增加时，会发生由过敏反应引起的免疫疾病。另外，根据对于Th1细胞分化的近期研究结果，随着得知能够调节Th1细胞活性的、作为新群体的免疫调节性T细胞(Treg)的存在，对于利用其治疗免疫疾病的研究呈上升趋势，Treg细胞具有会抑制非正常地活化的免疫细胞的功能而控制炎症反应的特性，因此，报告有很多通过增加Treg细胞活性的作用来治疗免疫疾病的实验。并且，除了Treg细胞以外，还有在分化过程中形成的另一组Th17细胞，已知Th17细胞是在未分化T细胞的分化过程中经过与Treg细胞的分化类似的过程而形成。即，Treg细胞和Th17细胞的分化是共同地在TGF-β的存在下进行，但是Treg细胞不需要IL-6，而Th17细胞是在TGF-β和IL-6同时存在的状况下进行分化。并且，分化的Th17细胞的特征在于分泌IL-17。已发现Th17细胞不同于Treg细胞，Th17细胞会参与免疫疾病中显示的炎症反应的最前方，使炎症反应的信号最大化，从而使疾病的进行加速化。因此，在自身免疫疾病中不能通过Treg细胞来控制的自身免疫疾病的情况下，将抑制Th17细胞活性作为靶的自身免疫疾病的治疗剂的开发日益突出。然而，目前所使用的免疫疾病治疗剂中使用最多的有阻断T细胞中的信号变换路径的免疫抑制剂，这些免疫抑制剂有产生毒性、感染、淋巴瘤、糖尿病、震颤(tremor)、头痛、腹泻、高血压、恶心、肾功能障碍等副作用的问题。并且，除了通过抑制T细胞的活化来治疗免疫疾病的方法以外，还有调节从免疫细胞分泌的细胞因子的量的治疗法及利用将从免疫细胞分泌的细胞因子作为靶的抗体的治疗法正在开发中。然而，实质上这些方法经过临床实验到适用于患者需要很长的时间，利用抗体的方法在抗体制备过程中需要太多的费用。考虑到这一点，本发明中提供的新型化合物具有炎症性细胞因子生成抑制和Th17细胞抑制及Treg细胞活性作用能够同时起作用的功能，从而与现有的治疗剂相比，预期能够更有效地治疗免疫疾病。进而，从本发明的一实施例的结果可以看出，本发明的化合物还具有抑制STAT3基因表达的活性，近来，在多种癌种中发现有STAT1、STAT3及STAT5的被活化的形态，STAT3不仅在诸如白血病的血癌中被活化，而且在诸如乳腺癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌的多种实体癌中也被活化，从而成为重要的抗癌目标物(HuaYuandRichardJove，NatureReviewCancer.，2004，8，945)。并且，已知STAT3的活性会抑制细胞凋亡，诱导血管生成(angiogenesis)，并且诱导免疫赦免(WangT.etal.，NatureMedicine.，2004，10，48)。因此，STAT3活性抑制具有通过复合的抗癌机制来控制肿瘤的效果，STAT3蛋白质不仅参与肿瘤的功能，而且还参与多种细胞内功能，因此，其的阻碍剂也可以作为免疫抑制剂来开发。并且，作为参考，免疫体系在正常状态下控制对自身抗原的特异性免疫反应，并且也有抑制对外部抗原的免疫反应的情况，可以例举如孕妇对胎儿的反应及对处于慢性感染状态的微生物的免疫反应。这些现象为能够诱导抗原特异性免疫耐受的机制，已知是由克隆缺失(clonaldeletion)、克隆无能(anergy)及通过免疫调节性T细胞(Treg)的能动性管制所诱导的。对偶然获得对移植抗原的免疫耐受的部分患者或实验性地诱导免疫耐受的动物模型进行调查，可以确认上述三种机制均参与移植免疫耐受的事实，尤其，最近免疫调节性T淋巴细胞作为重要的细胞备受瞩目，该细胞不仅参与管制移植免疫反应，而且还参与管制自身免疫、肿瘤免疫、感染免疫反应等活体的几乎所有的免疫反应。最近被发现的免疫调节性T细胞，即免疫调节性T淋巴细胞(Treg)可以大致分为自然性(natural)Treg和适应性(adaptive)Treg细胞，作为自然性Treg的CD4+CD25+T细胞自该细胞在胸腺新形成时开始具有免疫抑制功能，在正常个体的外周CD4+T淋巴细胞中以5～10％的频度存在。到目前为止，还没有正确掌握该细胞的免疫抑制机制，但是最近发现称作Foxp3的基因的表达控制因子对该细胞的分化和活性起到重要作用。并且，当外周自然性T细胞在特定环境下受到自身抗原或外部抗原的刺激时，能够分化成显示免疫抑制效果的细胞，将其称为适应性(adaptive)或诱导性(inducible)Treg，分泌IL-10的Tr1、分泌TGF-β的Th3及CD8Ts等属于其中。并且，就T细胞而言，除了Treg细胞以外，通过分化过程还分化成Th17细胞，Th17细胞与Treg细胞共同地在TGF-β的存在下形成，但是Treg不需要IL-6，而Th17细胞是在TGF-β和IL-6同时存在的状况下进行分化，并且其特征在于分泌IL-17。并且，Th17细胞具有以下特性，即，使炎症反应的信号最大化，从而具有使疾病的进行加速化的细胞毒性。因此，分化成Th17细胞或抑制活性是能够治疗免疫疾病的方法中的一种。并且，Treg细胞表达Foxp3，Foxp3主要存在于源自胸腺(thymus)的免疫调节性T细胞(RegulatoryTcell)，Foxp3是存在于具有CD4+CD25+表面抗原的细胞中的转录调节因子(transcriptionalfactor)，Foxp3的功能在于，当识别出对表达Foxp3的T细胞的抗原时，对抗原具有低反应性，并同时在不表达从胸腺分化出来的Foxp3的CD4+CD25-T细胞中，对潜在的能够诱发自身免疫症的T细胞起到作为抑制IL-2的生成和细胞分裂现象的抑制性T细胞(suppressorTcell)的作用。并且，已发现Foxp3通过表达Foxp3的调节性T细胞及与其细胞-细胞之间接触(cell-cellcontact)，对于CD25-T细胞不仅起到抑制IL-2的转录调节的功能，还起到受作为转录因子的NFAT的影响的IL-4、IFN-γ等的转录调节的功能。因此，就表达起到如上所述的作用的Foxp3的T细胞而言，通过抑制或调节免疫反应的作用来应用于免疫疾病的治疗。并且，一直试图将表达存在于人的Foxp3的CD4T细胞的自身抗原特异性T细胞(self-antigenspecificTcellclone)，通过高浓度的IL-2细胞因子处理及与抗-CD3、抗-CD28抗体的组合处理来增加其数量，并用作细胞治疗方法。因此，当观察这些现有的与免疫疾病治疗有关的技术开发现状时，本发明中提供的新型化合物解决了现有技术中未能解决的问题，并同时显示出有效的药理效果，从而能够作为免疫疾病治疗剂而非常有效地使用。因此，本发明中提供的所述用于预防或治疗免疫疾病的药学组合物可以包含本发明的所述新型化合物或其药学上可接受的盐。所述盐优选为由药学上可接受的游离酸(freeacid)形成的酸加成盐，所述游离酸可以使用有机酸和无机酸。所述有机酸包含柠檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、间位磺酸乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸及天冬氨酸，但并不限于此。并且，所述无机酸包含盐酸、溴酸、硫酸和磷酸，但并不限于此。根据本发明的化合物可以使用天然分离的，或者通过本领域公知的化学合成方法制备的，本发明人通过下述实施例中记载的方法来合成制备了这些化合物。本发明中，所述“免疫疾病”表示哺乳类免疫体系的组成成分导致或介导哺乳类的病理状态，或者作出其他贡献的疾病。并且，可以包含免疫反应的刺激或中断对该疾病的进行有补偿效应的所有疾病，本发明中可以包含由过敏性免疫反应导致的疾病。这些免疫疾病例如可以包含自身免疫疾病；炎症性疾病；以及细胞、组织或器官的移植排斥(transplantationrejection)疾病等，但并不限定于此。并且，就所有正常个体来说，最重要的特性中之一为，对组成自身(self)的抗原物质不会产生有害的反应，而对非自身(non-self)抗原具有能够识别并进行反应而去除的能力。像这种对自身抗原的活体的无应答称作免疫无应答性(immunologicunresponsiveness)或耐受(tolerance)。然而，当诱导或继续维持这种自身耐受方面发生问题时，则会对自身抗原产生免疫反应，由此会产生攻击自身组织的现象，由这种过程所产生的疾病称作“自身免疫疾病”。并且，“炎症性疾病”是指因炎症诱发因子或放射线照射等有害的刺激，使人体免疫体系过度亢进，从而由炎症诱发物质(炎症性细胞因子)所诱发的疾病，其中所述炎症诱发物质为诸如巨噬细胞的免疫细胞分泌的TNF-α(tumornecrosisfactor-α(肿瘤坏死因子-α))、IL-1(interleukin-1(白介素-1))、IL-6、前列腺素(prostagladin)、白三烯(leukotriene)或一氧化氮(nitricoxide，NO)等。并且，为了器官移植的成功，需要克服要移植的细胞及接受者对器官的免疫排斥反应。移植免疫排斥反应的主要介质为T细胞，T细胞受体(Tcellreceptor)识别移植物(graft)上表达的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，从而诱导免疫反应，产生移植排斥反应。主要组织相容性复合体由糖蛋白抗原的种类所决定，组织相容性抗原不一致所产生的免疫反应成为阻碍移植成功的障碍，因此组织相容性抗原检查的正确性和一致与否的调查是非常重要的因素。人有多种组织相容性抗原，其中有包含HLA-A、-B、-C的I类抗原，还有包含HLA-DR、-DP、-DQ的Ⅱ类抗原。这些抗原的生物学功能是向淋巴细胞传递抗原，I类抗原是在大部分的有核细胞中表达，并通过其传递的抗原是通过CD8+细胞毒性T淋巴细胞来识别。Ⅱ类抗原是在已知为抗原呈递细胞的树突状细胞、B淋巴细胞、活化的T淋巴细胞、巨噬细胞等中表达，并起到向CD4+T淋巴细胞传递抗原的功能。传递到T淋巴细胞的抗原结合于T淋巴细胞受体，从而使T淋巴细胞识别抗原，在移植过程中，与自己的抗原相比，会以高的频度识别源自其他人的组织相容性抗原。捐赠者或患者的整体T淋巴细胞中的1～10％左右将识别源自患者或捐赠者的组织相容性抗原，并通过对其的反应进行增殖，并产生一系列的免疫反应，这称作“同种异体反应(Alloresponse)”。并且，捐赠者的T淋巴细胞对患者的组织相容性抗原产生免疫反应的现象称作“移植物抗宿主病(GVDH)”，另一方面，患者的T淋巴细胞对捐赠者的组织相容性抗原产生的反应称作“移植排斥反应(graftrejection)”。因此，为了减少在移植过程中发生的免疫反应引起的非正常反应而在使用免疫抑制剂，这些免疫抑制剂的共同目的是抑制对移植物的T细胞-介导免疫反应。最近，正试图利用调节性T细胞来抑制免疫反应，从而治疗移植排斥疾病。并且，本发明中能够预防或治疗的所述免疫疾病的种类可以包含类风湿性关节炎、白塞氏病、多发性肌炎或皮肌炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、特应性皮炎、哮喘、原发性肝硬化、皮肌炎、肺出血肾炎综合征、自身免疫性脑膜炎、干燥综合征、狼疮、爱迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、胰岛素依赖型糖尿病、营养不良型大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、多发性硬化症、重症肌无力症、寻常型天疱疮、银屑病、风湿热、结节病、硬皮症、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、线粒体相关综合征及溃疡性结肠炎等，但并不限定于此。因此，本发明的所述组合物可以用作能够预防或治疗免疫疾病的药学组合物。就所述“治疗”而言，在没有提及其它意思的情况下，是指适用所述术语的疾病或病症，或者使所述疾病或病症中的一种以上的症状逆转或缓解，或者抑制或预防其进行，本文中所使用的所述术语治疗是指“进行治疗”被定义为如上所述的情况下进行治疗的行为。因此，对于哺乳动物，免疫疾病的“治疗”或“治疗疗法”可以包含下述中的一种以上。(1)阻碍免疫疾病的成长，即阻止其发展，(2)预防免疫疾病的扩撒，即，预防转移，(3)减轻免疫疾病，(4)预防免疫疾病的复发，以及(5)缓解(palliating)免疫疾病的症状。本发明的用于预防或治疗免疫疾病的组合物可以单独包含药学上有效量的本文的所述新型化合物中的一种以上的化合物或其盐，或者可以包含一种以上的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述药学上有效的量是指能够预防、改善及治疗免疫疾病的症状的充分的量。本发明的所述新型化合物或其盐的药学上有效的量可以根据免疫疾病症状的程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、施用途径及治疗时间等来适当地变化。并且，所述“药学上可接受”是指生理学上可接受且向人施用时通常不会引起诸如胃肠障碍、眩晕症的过敏反应或与其类似的反应的组合物。所述的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，可以进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂及防腐剂等。并且，本发明的组合物可以通过本领域中公知的方法来进行剂型化，以向哺乳动物施用后，能够提供活性成分的迅速、持续或延迟的释放。剂型可以是粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊、无菌注射溶液、无菌粉末的形式。并且，本发明的用于预防或治疗免疫疾病的组合物可以通过各种途径进行施用，所述途径包括口服、经皮、皮下，静脉或肌肉，活性成分的施用量可以根据施用途径、患者的年龄、性别、体重及患者的严重程度等各种因素来适当地选择，本发明的用于预防或治疗免疫疾病的组合物可以与公知的具有预防、改善或治疗免疫疾病症状效果的化合物并行施用。此外，本发明提供包含所述化合物作为有效成分的组合物的应用，所述化合物用于制备用于预防或治疗免疫疾病的医药。包含本发明的化合物作为有效成分的本发明的组合物可以用于制备用于预防或治疗免疫疾病的药物。此外，本发明提供预防或治疗免疫疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗上有效量的本发明的药学组合物。这里使用的术语“哺乳动物”是指作为治疗、观察或实验的对象的哺乳动物，优选是指人。这里使用的术语“治疗上有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医师所想到的从组织体系、动物或人中诱导生物学或医学反应的有效成分或药学组合物的量，其包含能够诱导所治疗的疾病或障碍症状缓解的量。本发明的对有效成分的治疗上有效施用量及施用次数是根据希望的效果会有变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本领域技术人员可以容易地决定最适当的施用量，并且可以根据疾病的种类、疾病的严重程度、组合物中含有的有效成分或其它成分的含量、剂型的种类及患者的年龄、体重、一般健康状态、性别及饮食、施用时间、施用途径及组合物的分泌率、治疗时间、同时使用的药物等多种因素来进行调节。进而，本发明可以提供免疫调节剂，其包含上述本发明中提供的化合物作为有效成分。此外，本发明可以提供在细胞中减少Th17细胞活性的方法，其通过在试管内用所述本发明的化合物对细胞进行处理来实现，，还可以提供在细胞中增加Treg细胞活性的方法，其通过在试管内用本发明的新型化合物对细胞进行处理来实现。具体实施方式以下，通过实施例来更详细说明本发明。这些实施例是用于更加具体说明本发明的，本发明的范围并不限定于这些实施例。<实施例1>本发明的具有免疫疾病治疗效果的新型化合物的合成通过下述反应式的方法制备了以下述表1的化学式表示的新型化合物。具体地，首先在密封反应器中分别将苯胺化合物(1.0mmol)溶解在乙腈溶剂中，然后添加双氰胺(1.0mmol)和浓硫酸(1.0mmol)并密封，然后在175℃下搅拌1个小时。然后冷却至室温，从而生成白色固体，并且去除溶剂后用己烷和异丙醇进行洗涤，从而合成白色固体形态的下述化合物。就总24个化合物的合成过程而言，除了苯胺化合物不同以外，均在相同的条件下进行了合成，各化合物的合成中使用的苯胺的种类及合成的化合物的化学式名称和结构式如下述表所示。为了合成所述化合物而使用的代表反应式如下所示。双氰胺苯胺上述式中R＝烷基，X＝一个以上的F、Cl或Br表1通过1H-NMR分析，对通过如上所述的方法合成的本发明的衍生物化合物进行了鉴定，其结果如下述表所记载。表2<实验方法><1>分析对象细胞本发明人为了确认本文中新合成的上述各化合物能否治疗及预防免疫疾病，基于如下所述的实验组实施了下述实验。表3本发明的实验中实施的实验组更具体地，就所述正常小鼠组而言，以从DBA/1J系正常小鼠获得的脾细胞作为对象，在用本发明的化合物进行处理之前，在抗(anti)-CD30.5ug/ml刺激条件下培养72小时，使所述细胞活化后使用。此外，类风湿性关节炎小鼠是使用DBA/1J系正常小鼠来制备的，对于所述正常小鼠，在0.1N乙酸溶液中溶解II型胶原(Cll)，使其达到4mg/ml，然后用透析缓冲液(dialysisbuffer，50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.2N氯化钠(Nacl))进行透析，并与含结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的完全弗氏佐剂(completeFreund'sadjuvant，CFA，Chondrex)以相同的量混合，然后向小鼠的尾巴基底部进行皮下注射，每只注射100μl(即，100μl/100μg)的免疫原(第一次注射)。然后在两周后，将相同的Cll与相同量的不完全弗氏佐剂(incompleteFreud'sadjuvant，IFA，Chondrex)混合，然后以100μl(即，100μl/100μg)的量对一条后退(脚底(footpad))进行第二次注射，由此制备了类风湿性关节炎发病的小鼠，并且从制备的关节炎小鼠获得脾细胞并使用，同样在抗-CD30.5ug/ml刺激条件下培养72小时，使所述细胞活化后使用。此外，作为狼疮发病小鼠模型使用了本领域中作为狼疮模型使用的sanroque小鼠，作为人P.B组使用了从人外周血液获得的淋巴细胞。所述从各小鼠及人外周血液分离脾细胞及分离淋巴细胞是使用本领域已知的通常的方法来实施的，并且，获得的细胞均在抗-CD30.5ug/ml刺激条件下培养72小时，使所述细胞活化后使用。<2>细胞毒性分析(MTT分析)为了确认本发明中合成的化合物是否对细胞诱发毒性，实施了MTT分析，将对象细胞作为对象，将各细胞以每孔2×105个的细胞数添加到孔板(96wellplate(96孔板))中，用不同浓度的本发明的化合物进行处理，并培养72小时，然后在细胞中添加MTT溶液(0.5％3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide))，并再培养4小时，然后用ELISA(enzymelinkedimmunospecificassay(酶联免疫特异性测定))测定仪在540nm下测定了吸光度，并观察有无细胞毒性。<3>根据自身抗体生产的免疫反应调节分析为了确认本发明的新型化合物是否影响血清内总IgG和总IgG1及IgG2a抗体的生产，实施了酶联免疫测定法(ELISA)。因此，将用本发明的化合物处理的细胞作为对象，利用夹心(sandwich)ELISA测定了总(Total)IgG和抗体特异性IgG1及IgG2a。在96孔板(wellplate)中，在常温下分别用单克隆性抗-小鼠(anti-mouse)IgG和CII进行1小时反应，然后用阻断溶液(1％BSA/PBST)阻断了非特异性结合。将小鼠对照血清(Mousecontorlserum)连续进行稀释，每次稀释1/2，并将其用作标准(standard)，并且添加细胞培养上清液并在室温反应1小时。之后，使抗-小鼠IgG-HRP、抗-小鼠IgG2a-HRP在室温反应1小时，并洗涤4次，然后用TMB系统进行显色，并在450nm波长下测定了吸光度。<4>对炎症性细胞因子生成带来的影响分析本发明人为了确认本文的新型化合物能否影响作为炎症及免疫疾病原因物质的炎症性细胞因子的生成，将各实验组作为对象，对IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9、STAT-3的生成程度及这些细胞因子的mRNA表达程度进行了分析，就炎症性细胞因子的生成程度而言，将用本发明的化合物进行处理并培养的细胞作为对象，获得上清液，然后用酶联免疫测定法(ELISA)进行了分析，具体地，使所述细胞与对各细胞因子的特异性抗体(抗-IL-17、抗-IL-6、抗-TNF-a、抗-IFN-r、抗-MMP-9、抗-STAT-3)在4℃下反应一整夜，然后用阻断溶液(1％BSA/PBST)阻断了非特异性结合。之后，使生物素化(biotinylated)的所述各抗体在室温反应2小时后洗涤4次，然后将ExtraAvidin-碱性磷酸酶缀合物(ExtraAvidin-AlkalinePhosphataseconjugate)稀释并添加，并在室温下反应2小时。之后，添加PNPP/DEA溶液并进行显色，然后在405nm波长下测定了吸光度。并且，就炎症性细胞因子的表达程度分析而言，从分析对象细胞获得总RNA后，使用对IL-17、IL-6、TNF-a及IFN-r进行特异性结合的引物，实施RT-PCR，并分析了mRNA的量。<5>Th17细胞抑制及Treg细胞诱导活性分析进而，本发明人为了确认本发明的新型化合物能否抑制与炎症诱发相关的Th17细胞的分化及活性，以及能否促进具有免疫调节能力的Treg细胞的活性，使用流式细胞分析仪进行了分析。即，将T细胞作为对象，以Th17细胞或Treg细胞分化条件培养细胞，然后通过流式细胞分析仪分析了Foxp3+Treg细胞或Il-17+Th17的细胞数。<6>破骨细胞分化抑制效果为了调查在破骨细胞分化过程中的本发明的新型化合物的影响，获得小鼠的骨髓细胞，并诱导该骨髓细胞在MCSF(macrophagecolony-stimulatingfactor(巨噬细胞集落刺激因子))及溶解性RANKL的存在下进行分化(参照Sugatanietal.2003，J.Cell.Biochem.90，59-67方法)。从6周龄小鼠的股骨和胫骨准备了骨髓细胞，在37℃下，在8孔腔室载玻片(3×105细胞/孔；NalgeNunc国际公司，内珀维尔，伊利诺伊州)中在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(30ng/ml：R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州)的存在下放置，3天后去除包括淋巴细胞的非粘附性细胞，然后在M-CSF(30ng/ml)及RANKL(30ng/ml，施特拉特曼，汉堡，德国)的存在下，进一步培养粘附性破骨细胞的前体细胞4天，从而获得破骨细胞。这时，细胞培养培养基在添加有M-CSF及RANKL的期间更换了一次。固定细胞并利用染色试剂盒(sigma)，根据制造商的协议，对TRAP(tartrate-resistantacidphosphatase(抗酒石酸酸性磷酸酶))实施了染色。在各腔室中用显微镜(40倍率)观察的结果，包含三个以上的核的TRAP阳性多核细胞计数为破骨细胞(Sugatani.etal.2003，J.Cell.biochem.90，59-67)。并且，将骨髓细胞分化为破骨细胞，并在M-CSF及RANKL的存在下用本发明的新型化合物以各浓度进行处理，然后培养48小时，之后将细胞对TRAP进行染色，并对TRAP阳性多核细胞进行了计数。<实验例1>本发明的新型化合物的细胞毒性分析结果为了确认所述实施例1中合成的新型化合物是否具有细胞毒性，将上述表3中记载的各实验组的细胞作为对象，通过MTT分析确认了细胞生存率。即，以每孔2×105个的细胞数添加各实验组的细胞，并用本发明的新型合成化合物以不同浓度进行处理，然后分析了细胞生存率。其结果为，将SD-281、SD-282、SD-283、SD-284化合物与对照组或二甲双胍处理组进行比较时，没有观察到根据各细胞浓度处理的细胞毒性，由此可以知道这些化合物对正常细胞及病症组细胞均没有细胞毒性。<实验例2>本发明的新型化合物对根据自身抗体生产的免疫反应的调节效果的结果为了调查在所述实施例1中合成的新型化合物是否影响根据自身抗体生产的免疫反应，从上述的4个组的小鼠通过眼窝采血来从各小鼠组获得血液，然后分离血清并测定了IgG、IgG1、IgG2a的量。分析结果为，本文的化合物均显示出以下特征，即在病症条件下处于自身抗体生产状态的免疫球蛋白(总IgG、IgG1、IgG2)的量随化合物的处理浓度减少，并且可以知道下述表4中记载的化合物的抑制过度的免疫反应的免疫调节功能优异。表4单位：ng/mlA:正常小鼠，B：类风湿性关节炎细胞，C：狼疮细胞，D：人外周血液的淋巴细胞<实验例3>炎症性细胞因子的生成及基因表达抑制分析结果就用于确认本发明的新型化合物是否抑制能够诱导炎症及免疫疾病的炎症性细胞因子的生成，以及进而确认是否在基因水平上抑制这些因子的实验而言，通过在所述<4>中记载的对炎症性细胞因子生成带来的影响分析中记述的方法来实施了实验。分析结果显示本发明中合成的新型化合物均在作为炎症性细胞因子的IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9、STAT-3的生成及基因水平上的表达方面均依赖于处理浓度而进行抑制。因此，通过这种结果可以得知本发明的新型化合物能够通过抑制炎症性细胞因子的生成来预防及治疗免疫疾病。表5本发明的新型化合物对炎症性细胞因子生成带来的影响分析单位：ng/mlA:正常小鼠，B：类风湿性关节炎细胞，C：狼疮细胞，D：人外周血液的淋巴细胞表6将正常小鼠细胞作为对象，SD-284化合物对炎症性细胞因子的生成带来的影响分析IL-17IL-6TNF-αIFN-γ对照组7.61.80.710SD-2846.50.70.54.9单位：ng/ml表7本发明的化合物抑制炎症性因子活性的分析单位：基因表达A:正常小鼠，B：类风湿性关节炎细胞，C：狼疮细胞<实验例4>Th17及Treg细胞的调节活性分析结果本发明人为了调查本文的新型化合物能否同时调节分泌作为炎症性细胞因子的IL-17的Th17细胞的分化及活性和具有免疫调节能力的Treg细胞的分化及活性，实施了所述<5>中记载的Th17细胞抑制及Treg细胞诱导活性分析。分析结果为，本发明的新型化合物均显示出在Th17分化条件下具有以下活性，即减少病症细胞中的IL-17表达的活性，以及抑制分化成作为病症细胞的Th17细胞的活性，并且在Treg条件下，作为免疫调节细胞的标记的Foxp3的表达及Foxp3表达细胞数会增加。进而，可以得知能够有效地抑制过度活化的Th17细胞。表8本发明的化合物对Th17抑制及Treg活性带来的影响分析A:正常小鼠，B：类风湿性关节炎细胞，C：狼疮细胞表9本发明的化合物在Th17分化条件下对Th17带来的影响分析因此，本发明人通过这些结果可以得知本发明的新型化合物不是对Th17及Treg进行个别调节，而是能够同时调节，从而能够更有效地诱导免疫调节能力，由此可以得知这些化合物可以用作更有效的免疫调节剂或免疫疾病治疗剂。<实验例5>破骨细胞分化抑制分析结果本发明人为了确认本发明的新型化合物能否有效治疗免疫疾病，在用M-CSF及RANKL刺激的细胞中，通过作为破骨细胞分化因子的TRAP染色来确认本发明的化合物对破骨细胞分化抑制程度。分析结果为，本发明的新型化合物均显示出，表达作为破骨细胞分化标记的TRAP的细胞数会减少。通过所述结果可以得知，本发明的新型化合物能够有效地减少诱发关节破坏的破骨细胞的分化能力，从而能够有效使用于由破骨细胞的分化所引起的疾病的预防及治疗。表10本发明的化合物的破骨细胞分化抑制效果分析A:正常小鼠，B：类风湿性关节炎细胞<实验例6>将小鼠脾细胞作为对象，作为炎症性细胞因子的TNF-a及IL-17的生成抑制效果进而，本发明人为了将在所述本发明的实施例中合成的各化合物作为对象来对炎症性细胞因子的抑制效果进行有效性评价，对从DBA1/J正常小鼠组的脾脏获得的细胞，用0.5ug/ml浓度的抗小鼠CD3进行处理，并用200及500uM浓度的各化合物共同刺激，然后通过ELISA法来确认了炎症性细胞因子IL-17和TNFa的抑制程度。其结果如图24所示，可以看出SD-563、SD-564、SD-566、SD-567、SD-573、SD-574、SD-580的化合物具有能够同时抑制炎症性细胞因子IL-17和TNFa的活性，并且这种抑制效果依赖于浓度而增加。对于本发明，以优选实施例作为中心进行了说明。本发明所属
技术领域：
的普通技术人员应能够理解本发明可以在不超出本发明的本质特性的范围内以变形的形态体现。因此，对于公开的实施例，不应以限定的观点考虑，而应当以说明的观点考虑。本发明的范围并不是体现在前述的说明中，而是体现在权利要求书中，并应解释为与其在同等范围内的所有不同点均包括在本发明中。当前第1页1 2 3