本申请要求2014年10月17日提交的美国临时申请号62/065,598的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
炎症性肠病(ibd)是胃肠道的慢性炎症性病变，在美国有大约一百万名患者患有此病。ibd的两种最常见形式是克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)。尽管cd能够影响整个胃肠道，但它主要影响回肠(小肠的远端或下部)和大肠。uc主要影响结肠和直肠。当前用于cd和uc两者的治疗包括氨基水杨酸(例如，5-氨基水杨酸、柳氮磺吡啶和美沙拉嗪)、抗生素(例如，环丙沙星和甲硝唑)、皮质类固醇(例如，布地奈德或强的松)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤或甲氨蝶呤)、和肿瘤坏死因子(tnf)拮抗剂(例如英夫利昔单抗(
尽管cd和uc的病因未知，但两者都被认为是肠粘膜的炎性疾病。最近的研究证实，tgf-β1起到能够控制肠粘膜炎症的强力免疫调节剂的作用。tgf-β1结合含有两个亚基(tgf-β1r1和tgf-β1r2)的异源二聚的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体。在配体结合后，tgf-β1r1受体被组成性活化的tgf-β1r2受体磷酸化，并通过属于smad家族的蛋白将信号传导到细胞核。激活的tgf-β1r1直接磷酸化smad2和smad3蛋白，然后它们与smad4相互作用。smad2/smad3/smad4的复合体易位到细胞核，并调节某些基因的转录。
其他研究证实，另一种smad蛋白smad7也在炎症中发挥作用。细胞内蛋白smad7已被证明干扰smad2/smad3与tgf-β1r1的结合，阻止这些蛋白的磷酸化和活化。此外，smad7蛋白的表达增加与tgf-β1介导的信号传导的抑制相关。来自于ibd患者的粘膜样本的特征在于高水平的smad7和低水平的磷酸化smad3，表明在这些患者中tgf-β1介导的信号传导受损。
最近的研究聚焦于将smad7作为治疗患有ibd的患者的靶点。这样的疗法包括抗smad7反义疗法。
技术实现要素：
本发明基于使用针对smad7的反义疗法治疗患有炎症性肠病的患者的方法的研发，该针对smad7的反义疗法是按照患者存在的smad7的特定多态形式定制的。在特定实例中，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism)(参考snprs144204026)存在于smad7的编码序列的核苷酸108-128中，其对应于反义疗法mongersen靶向的smad7mrna区域，该单核苷酸多态性的存在使得能够期望地使用包含多态性的mongersen的改性形式靶向此区域。因此，本发明的特征为使用具有对于多态基因序列特异的(例如完全匹配)序列的反义疗法治疗在smad7mrna序列中具有多态性的患者的方法。本发明的特征还为包含多态序列的反义寡核苷酸。
根据第一方面，本发明的特征为一种治疗或控制患有炎症性肠病(ibd；例如克罗恩病(cd)或溃疡性结肠炎(uc))的患者的ibd的方法，该患有ibd的患者携带不同于共有smad7核苷酸序列的smad7的第一多态形式的至少一个拷贝。所述方法包括对所述患者施用有效量的第一smad7反义寡核苷酸，所述第一smad7反义寡核苷酸特异性靶向所述smad7的第一多态形式。smad7的多态形式可以包含单核苷酸多态性(snp)并且/或者可以包含表1或表2中列出的多态性。第一多态形式可以包含在对应于seqidno:1的核酸位置108-128的区域中的多态性(例如，在seqidno:1的位置114的腺嘌呤(“a”)或鸟嘌呤(“g”))；例如，其中多态形式包含seqidno:9的核酸序列(5'-gctgcggagagaaggggcgac-3')。在一些实施方式中，第一多态形式可以包含seqidno:3的核酸序列(5'-gctgcggggagaaggggcgac-3')。在特定实施方式中，第一smad7反义寡核苷酸包含seqidno:11的核酸序列(5'-gtcgccccttctctccgcagc-3')，例如，其中第一smad7反义寡核苷酸是包含以下序列：5'-gtxgccccttctctcxgcagc-3'(seqidno:13)的反义寡核苷酸硫代磷酸酯，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。在其他特定实施方式中，第一smad7反义寡核苷酸包含seqidno:5的核酸序列(5'-gtcgccccttctccccgcagc-3')，例如，其中第一smad7反义寡核苷酸是包含以下序列：5'-gtxgccccttctcccxgcagc-3'(seqidno:7)的反义寡核苷酸硫代磷酸酯，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
在另一方面，本发明的特征为一种用于治疗或控制患有ibd(例如cd或uc)的患者的ibd的方法。所述方法包括(a)分析患者的一种以上smad7多态形式的存在或缺失；以及(b)基于多态形式的存在或缺失，对患者施用一种以上smad7反义寡核苷酸，其中(i)如果患者存在第一smad7多态形式(例如野生型形式)，则对患者施用靶向第一smad7多态形式的第一smad7反义寡核苷酸；或者(ii)如果患者存在第二smad7多态形式，则对患者施用靶向第二smad7多态形式的第二smad7反义寡核苷酸；或者(iii)如果患者存在第一smad7多态形式和第二smad7多态形式，则对患者施用靶向第一smad7多态形式和第二smad7多态形式的第一smad7反义寡核苷酸和第二smad7反义寡核苷酸中的一者或两者。多态性可以包含snp并且/或者可以包含表1或表2中列出的多态性。第一多态性可以出现在对应于seqidno:1的核酸位置108-128的区域中(例如，其中第一smad7多态变体在seqidno:1的位置114包含鸟嘌呤(“g”))。第二smad7多态形式可以包含在seqidno:1的位置114的腺嘌呤(“a”)。在某些实施方式中，第一smad7多态形式包含seqidno:3的核酸序列(5'-gctgcggggagaaggggcgac-3')。在特定实施方式中，第一smad7反义寡核苷酸包含seqidno:5的核酸序列(5'-gtcgccccttctccccgcagc-3')，例如，其中第一smad7反义寡核苷酸是包含以下序列：5'-gtxgccccttctcccxgcagc-3'(seqidno:7)的反义寡核苷酸硫代磷酸酯，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。在某些实施方式中，第二smad7多态形式包含seqidno:9的核酸序列(5'-gctgcggagagaaggggcgac-3')。在特定实施方式中，第二smad7反义寡核苷酸包含seqidno:11的核酸序列(5'-gtcgccccttctctccgcagc-3')，例如，其中第二smad7反义寡核苷酸是包含序列：5'-gtxgccccttctctcxgcagc-3'(seqidno:13)的反义寡核苷酸硫代磷酸酯，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。可以通过dna测序、通过基因表达图谱、使用下一代测序、或使用基因表达微阵列分析来分析一种以上smad7多态形式的存在或缺失。一种以上smad7多态形式的存在或缺失可以在从所述患者获得的样本(例如，液体、活检样本、或组织样本)中分析。
在以上方面的任意一项中，可以以10mg/天至约300mg/天之间的剂量对患有ibd的患者施用第一和/或第二smad7反义寡核苷酸，例如以约10mg/天、20mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天、约100mg/天、约110mg/天、约120mg/天、约130mg/天、约140mg/天、约150mg/天、约160mg/天、约170mg/天、约180mg/天、约190mg/天、约200mg/天、约210mg/天、约220mg/天、约230mg/天、约240mg/天、约250mg/天、约260mg/天、约270mg/天、约280mg/天、约290mg/天、或约300mg/天的剂量。在特定实施方式中，以约40mg/天、约80mg/天、或约160mg/天的剂量施用第一和/或第二smad7反义寡核苷酸。
在另一方面，本发明的特征为：(a)一种smad7反义寡核苷酸，包含seqidno:11的核苷酸序列；(b)一种smad7反义寡核苷酸，包含seqidno:13的核苷酸序列，其中x是包含5-甲基-2'-脱氧胞苷的核苷酸并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键；或者(c)一种smad7反义寡核苷酸，包含seqidno:13的核苷酸序列，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷或其补体。smad7反义寡核苷酸可以包含至少一个是硫代磷酸酯键的核苷酸间键合，例如，其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。寡核苷酸的2'-脱氧核糖核苷酸可以被对应的核糖核苷酸替代。本发明的特征还为药物组合物(例如，适合于口服施用的组合物)，该药物组合物包含smad7反义寡核苷酸和药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
在另一方面，本发明的特征为治疗ibd(例如cd或uc)的方法，包括对有需要的患者施用(例如，口服施用)有效量的前述方面的smad7反义寡核苷酸，其中该smad7反义寡核苷酸对于治疗ibd是有效的。
反义寡核苷酸是短的合成寡核苷酸序列，其与从目标基因(例如，smad7的多态形式)转录的信使rna(mrna)互补。反义寡核苷酸与mrna杂交并且产生双链杂合体，该杂合体能够导致诸如核糖核酸酶h的泛素催化酶的激活，其降解dna/rna杂交链，从而阻止蛋白质翻译。不受缚于理论，本文中提供的反义寡核苷酸能够作为rna或dna与其靶序列杂交。因此，即使提供dna序列作为靶标，也包括了对应的rna序列(包含尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。
在另一方面，本发明提供了一种用作药物的如上所述的针对smad7的反义寡核苷酸。本发明提供了一种按照患者存在的smad7的特定多态形式定制的针对smad7的反义疗法，该反义疗法在治疗患有炎症性肠病的患者的方法中使用。在特定实例中，单核苷酸多态性(参考snprs144204026)存在于smad7编码序列的核苷酸108-128中，其对应于反义疗法mongersen靶向的smad7mrna区域，该单核苷酸多态性的存在使得能够期望地使用包含多态性的mongersen的改性形式靶向此区域。本发明还提供了一种反义疗法，该反义疗法在治疗在smad7mrna序列中具有多态性的患者的方法中使用，所述反义疗法具有对于多态基因序列特异的(例如完全匹配)序列。
本发明还提供了一种smad7反义寡核苷酸，该smad7反义寡核苷酸在治疗或控制患有炎症性肠病(ibd；例如克罗恩病(cd)或溃疡性结肠炎(uc))的患者的ibd的方法中使用，所述患者携带不同于共有smad7核苷酸序列的smad7的第一多态形式的至少一个拷贝。优选地，smad7反义寡核苷酸特异性靶向所述smad7的第一多态形式。smad7的多态形式可以包含单核苷酸多态性(snp)并且/或者可以包含表1或表2列出的多态性或如第[0007]段中所列出。
本发明还提供了一种smad7反义寡核苷酸，该smad7反义寡核苷酸在治疗或控制患有炎症性肠病(ibd；例如克罗恩病(cd)或溃疡性结肠炎(uc))的患者的ibd的方法中使用。优选地，该方法(a)分析患者的一种以上smad7多态形式的存在或缺失；以及(b)基于多态形式的存在或缺失，对患者施用一种以上smad7反义寡核苷酸，其中(i)如果患者存在第一smad7多态形式(例如野生型形式)，则对患者施用靶向第一smad7多态形式的第一smad7反义寡核苷酸；或者(ii)如果患者存在第二smad7多态形式，则对患者施用靶向第二smad7多态形式的第二smad7反义寡核苷酸；或者(iii)如果患者存在第一smad7多态形式和第二smad7多态形式，则对患者施用靶向第一smad7多态形式和第二smad7多态形式的第一smad7反义寡核苷酸和第二smad7反义寡核苷酸中的一者或两者。多态性可以包含snp并且/或者可以包含表1或表2中列出的多态性或如第[0008]段中所列出。
在另一方面，本发明提供了在治疗ibd(例如cd或uc)的方法中使用的有效量的如上所述的smad7反义寡核苷酸，其中所述方法包括对有需要的患者施用(例如，口服施用)有效量的smad7反义寡核苷酸，其中该smad7反义寡核苷酸对于治疗ibd是有效的。
“特异性靶向”不同于共有序列的基因的多态形式的反义寡核苷酸包括相对于基因或转录本共有序列具有取代的核苷酸序列，与共有序列相比，该取代增加反义寡核苷酸与多态形式的杂交。例如，在靶序列中包括鸟嘌呤向腺嘌呤(g→a)的改变的多态形式会被在寡核苷酸的对应位置包含胞嘧啶向胸腺嘧啶(c→t)取代的反义寡核苷酸所特异性靶向。
“共有”smad7核苷酸序列意指与参考数据库中描述的基因的“野生型”序列相关联的rna序列或dna序列。例如，smad7的共有序列能够以登记号nm_005904.3、nm_001190821.1、nm_001190822.1、和nm_001190823.1被找到，其是美国国家生物技术信息中心(ncbi)数据库中人类smad7的参考转录本。
“治疗”意指减少与被治疗的疾病或病症相关联的至少一种症状。
本文中使用的术语“控制(manage)”，“控制(management)”，“控制(managing)”等通常是指控制疾病的症状的严重性或表现，或治疗疾病的方式。通常，控制用于获得期望的药理学和/或生理学效应。就部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的不良作用或确保疾病的特定症状或表现不会在患者中发生或重现，或不会在患者中发展成不希望的或无法忍受的水平，该效果是治疗性的。本文中使用的术语“控制”涵盖哺乳动物，特别是人的疾病的任何控制，并且包括：(a)抑制疾病，例如防止疾病的严重性或范围增加；(b)缓解疾病，例如使疾病部分或完全改善；或(c)防止疾病的复发，即防止在先前的成功治疗疾病症状或疾病之后疾病恢复到活跃状态。本文所用的“控制”还可以用于针对疾病的具体治疗的施用，例如smad7反义寡核苷酸。
本文中描述的“受试者”或“患者”是指处于罹患或诊断为ibd的风险中的任何动物，包括但不限于哺乳动物、灵长类动物和人。在某些实施方式中，受试者可以是非人哺乳动物，例如猫、狗或马。在优选的实施方式中，受试者是人类受试者。受试者可以是诊断为具有发展ibd的高风险的个体、已经诊断为患有ibd的个体、先前患有ibd的个体、或评估ibd的症状或适应症(indication)(例如高cdai指数分值)的个体。
本文中使用的“患有ibd的患者”是指患有ibd的任何症状或表现的患者、可能患有ibd的任何症状或表现的患者、或可能受益于用于治疗ibd或ibd的评价处理的本发明的治疗方法的任何患者。有需要的患者可以包括被诊断为具有发展ibd的风险的患者、过去患有ibd的患者或之前已经接受过ibd治疗的患者。特别相关的是患有与增加的crp、tnfα和/或il8表达水平相关的ibd的个体。在一些实施方式中，ibd患者是克罗恩病(cd)患者。在一些实施方式中，ibd患者是溃疡性结肠炎(uc)患者。
本文中使用的“克罗恩病活性指数”或“cdai”是指用于评估患有cd的患者的进展的测量或指数，如best等，gastroenterology，70:439-44(1976)所述。150以下的cdai分值通常与非活动性疾病相关，并且比高的得分表示更好的预后。高于150的值通常与活动性疾病相关，高于450的值与极端严重的疾病相关。cdai分值可以用于确定患者对治疗响应的良好程度，并且可以用于识别缓解中的患者。在某些实施方式中，基准临床响应是指受试者展现cdai分值降低至少100分。在临床试验中，150以下的cdai分值通常与缓解相关。
本文中使用的“溃疡性结肠炎疾病活动指数”或“ucdai”是指用于评估患有uc的患者的进展的测量或指数，如sutherland等，gastroenterology，92:1894-98(1987)所述。ucdai是关于uc症状的一系列限定词，包括大便频率、直肠出血、结肠粘膜的出现和医生对疾病活动的评级。这些限定词中的每一个给出从0到3的数字，其中3是最高的疾病活性。在临床试验中，缓解通常定义为1以下的ucdai分值，并且改善是从试验开始时的分值减少3分以上。ucdai可用于临床试验以确定患者对治疗响应的程度，并可用于识别缓解的患者。用于测量uc患者的疾病严重性的其它常用指数包括truelove和witts指数、st.mark指数、简易临床结肠炎疾病活动指数(sccai)、lichtiger指数、溃疡性结肠炎的症状评分(ucss)、和mayo临床评分。
本文中使用的“smad7”(也称为crcs3、flj16482、madh7、madh8、mad(母亲成形素(mothersagainstdecapentaplegic)，果蝇)同源物7，mad同源物8、smad、母亲(mothersagainst)dpp同源物7、母亲dpp同源物8)是由entrezgeneidno.4092指定的基因编码的人蛋白或任何mrna转录本及其等位基因变体。
本文中使用的“crp”(也称为c反应蛋白，凝集素相关的；凝集素；和ptx1)是指由entrezgeneidno.1401指定的基因编码的人蛋白质或任何mrna转录本及其等位基因变体。
本文中使用的“il8”(也称为白介素-8(il-8)；肿瘤坏死因子诱导的基因1；naf；粒细胞趋化蛋白1(gcp1)；lect；luct；蛋白质3-10c；β-血小板球状蛋白；中性粒细胞活化肽1；中性粒细胞活化蛋白1(nap1；nap-1)；依莫白介素；gcp-1；lynap；淋巴细胞衍生的中性粒细胞活化肽；肺巨细胞癌衍生的趋化蛋白；小诱导细胞因子亚家族b，成员8；β内皮细胞衍生的中性粒细胞活化肽；单核细胞衍生的中性粒细胞趋化因子(mdncf)；单核细胞衍生的中性粒细胞活化肽(monap)；肺泡巨噬细胞趋化因子i；c-x-c基序趋化因子8；和趋化因子(c-x-c基序)配体8(cxcl8))是指由entrezgeneidno.3576指定的基因编码的人蛋白或任何mrna转录本及其等位基因变体。
本文中使用的“tnfα”(也称为肿瘤坏死因子、dif、肿瘤坏死因子配体超家族成员2(tnfsf2)、apc1蛋白、恶病质素、肿瘤坏死因子a(tnfa)、肿瘤坏死因子-a(tnf-a)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α))是指由entrezgeneidno.7124所指定的基因编码的人蛋白或任何mrna转录本及其等位基因变体。
具体实施方式
本发明涉及治疗具有smad7基因的多态形式的患者的炎症性肠病(ibd；例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)的方法。该方法使用特异性设计以靶向包含多态性的smad7转录本的反义寡核苷酸，从而使得能够以更高的效能靶向那些患者。以下更详细地解释该方法。
smad7多态变体
本发明的方法和反义寡核苷酸能够靶向任何smad7多态性。一般来说，被靶向的多态性存在于mrna序列中。在smad7mrna中找到的snp包括在表1中列出的那些。尽管表1中的smad7snp的序列作为dna序列示出，但是本领域技术人员应当理解，细胞中的杂交能够与代替胸腺嘧啶(t)而包含尿嘧啶(u)的rna发生。smad7编码序列中的snp在表2中列出。
表1
表2
smad7多态变体在患者存在的判定
能够使用本领域已知的任意方法实现smad7多态变体的存在的判定。一般来说，在从患者获取的样本中检测存在。smad7多态变体在患者中的存在的鉴别能够使用标准技术实现，包括基于杂交的技术、测序技术、以及基于阵列的技术。
smad7多态变体的存在的判定能够在任意生物学样本中检测，并且可以是从患者或测试受试者获得的包含编码smad7的核酸(例如，基因组dna或rna)的任意样本。示例性样本包括组织活检、细胞、体液(例如血液、血清、血浆、精液、尿液、唾液、羊膜液、或脑脊液)。
获得之后，能够使用任意合适的方法检测smad7多态变体的存在。在一些实施方式中，使用杂交方法。杂交方法包括动态等位基因特异性杂交(howell等，nat.biotechnol.17:87，1999)。该方法依赖于包含多态性的序列与不含多态性的序列相比较之间的差异解链温度。简要地，使用生物素化的引物通过pcr扩增关注的dna区域。所得的pcr产物接附至链亲和素支持体，并且在dna双链体结合荧光分子的存在下与等位基因特异性探针杂交。加热双链体，基于荧光损失判定双链体变性的温度。变性温度是多态性的存在或缺失的判定因素。
检测snp的其他方法包括使用分子信标，如mhlanga等，methods25:463，2001所述。此方法涉及包含茎环结构的单链探针的使用。结构的环部包含当序列完全匹配时能够与所讨论的基因组dna杂交的序列，并且茎的末端分别包含荧光团和淬灭剂。当信标与其靶序列结合时，荧光团和淬灭剂分离，从而允许荧光发光，指示snp的存在。
用于识别snp存在的另一个杂交方法是使用为此目的设计的核酸阵列。例如，能够使用全基因组人snp阵列6.0(affymetrix，部件#901182)在从患者获取的样本中检测某些snp的存在。
用于识别snp的又另一个方法包括序列方法。随着高通量基因筛选(例如，所谓的“下一代”测序)在技术上变得可行，这样的方法也能够用于识别患者中snp的存在。这些方法包括单分子实时测序(pacificbiosciences)、离子半导体(iontorrentsequencing；lifetechnologies)、焦磷酸测序(454lifesciences)、合成测序(illuminainc.)、以及连接测序(solidsequencing；appliedbiosystems)。
患者群体(population)
反义寡核苷酸能够施用于期望降低smad7活性的任意患者。因为已知smad7与炎症性肠病诸如溃疡性结肠炎和克罗恩病中的炎症相关，所以其对降低这样的患者的smad7活性能够是有益的。
本发明的组合物和方法可用于治疗类固醇耐性的患者、类固醇依赖的患者、或者对于其他抗smad7疗法耐性的患者(例如，对于用相对于患者基因组中存在的至少一个对应核苷酸具有核苷酸不匹配的寡核苷酸治疗的耐性)。
在特定实施方式中，患者是被鉴定为具有与ibd或炎症相关的生物标志物的水平改变的受试者。例如，相对于正常对照或正常对照值，患者可具有升高的白细胞介素-8(il-8)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)或c反应蛋白(crp)水平。
在特定实施方式中，如果患者显示对抗smad7疗法的响应性的一些可能性，则选择该患者。对抗smad7治疗的响应性的可能性部分地基于ibd患者中crp、tnfα和/或il8的水平的确定而提出，例如，预先存在的crp、tnfα和/或il8水平(即在施用初始剂量的smad7反义寡核苷酸之前患者的crp、tnfα和/或il8水平)或在初始剂量或一个以上后续剂量的smad7反义寡核苷酸后确定的crp、tnfα和/或il8水平。例如，在本发明的一些实施方式中，在检测或分析绝对或相对crp、tnfα和/或il8水平或crp、tnfα和/或il8水平的变化后，选择用smad7反义寡核苷酸治疗或进一步治疗的患者。可以将ibd患者的crp、tnfα和/或il8水平与crp、tnfα和/或il8的正常水平比较，例如用所匹配的对照组中的crp、tnfα和/或il8中位水平定义的crp、tnfα和/或il8的正常水平，或crp、tnfα和/或il8的绝对水平。在某些实施方式中，如果血液中的crp水平大于3.0mg/ml、大于3.5mg/ml或大于4.0mg/ml，则选择该患者进行用抗smad7疗法的治疗。
在一些实施方式中，如果相对于匹配的对照组中的crp、tnfα和/或il8的平均、中位或均值水平，患者的crp、tnfα和/或il8水平提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则选择该患者进行用smad7反义寡核苷酸治疗或进一步治疗。
在一些实施方式中，如果相对于匹配对照组中的crp、tnfα和/或il8的平均、中位或均值水平，患者的crp、tnfα和/或il8的水平升高超过2倍、超过3倍、超过4倍、超过5倍、超过6倍、超过7倍、超过8倍、超过9倍或超过10倍，则选择该患者进行用smad7反义寡核苷酸的治疗或进一步治疗。
通常，将按浓度测量crp、tnfα和/或il8水平，浓度是例如每体积样本(例如血液或组织体积)中crp、tnfα和/或il8蛋白、肽或rna的质量。因此，对于初始或持续治疗的患者的选择与患者的crp、tnfα和/或il8水平相关，使得例如crp、tnfα和/或il8的高初始水平可以指示对smad7反义寡核苷酸治疗的响应性的可能性。此外，高水平的crp、tnfα和/或il8(即，高于il8的正常水平)可以指示smad7反义寡核苷酸需要增加剂量，而正常的或低于正常的crp、tnfα和/或il8水平可以指示需要减少或不改变smad7反义寡核苷酸的剂量，特别是在一个以上剂量之后。或者，重复剂量后crp、tnfα和/或il8的高于正常水平的持续水平可以指示患者对治疗不响应。
crp、tnfα和/或il8的对照水平可以通过确定在用抗smad7疗法治疗之前从受试者获得的样本(例如，血液样本)中的crp、tnfα和/或il8蛋白或mrna转录本的水平来确定。crp、tnfα和/或il8的对照水平可以提供用于监测受试者对治疗的响应的基线。可以在首次施用抗smad7疗法当天(例如，治疗方案的第1天)，例如在施用至少一种抗smad7疗法之后立即从受试者获得对照样本。在其它实施方式中，可以在抗smad7疗法开始前一天(例如，治疗方案的第0天)从受试者获得对照样本。或者，可以在抗smad7疗法开始前2、3、4、5、6、7或更多天从受试者获得对照样本。例如，可以在治疗前(例如，在对照样本中)、治疗期间和/或治疗后测量il8浓度的增加或减少，以监测受试者对疗法，例如，抗smad7疗法的响应。
在一些实施方式中，可基于对受试者中的循环crp、tnfα和/或il8浓度的长期监测来对受试者建立对照水平。在这种情况下，预期受试者可以用抗smad7疗法进行多轮治疗。在多轮治疗后检测的循环crp、tnfα和/或il8浓度可以与受试者的crp、tnfα和/或il8的先前对照水平进行比较，以确定受试者是否响应于治疗和/或可能对用抗smad7治疗的进一步治疗有响应。在其它实施方式中，可以基于循环crp、tnfα和/或il8浓度的平均测量值建立受试者的对照或基线水平，所述循环crp、tnfα和/或il8浓度是从随时间获得的(例如，以天、周、月或年为期获得的)多个基线样本确定的。因此，可以将如本文所公开的任何测试或测定与先前的或建立的对照水平进行比较，并且可能不需要从受试者获得新的对照样本用于比较，例如，如果受试者接受超过一轮的用抗smad7疗法的治疗。
crp、tnfα和/或il8的正常水平可以基于数值参考值或相对于健康对照组中的crp、tnfα和/或il8水平来确定。
在本发明的其它实施方式中，crp、tnfα和/或il8的正常水平定义为健康对照组中crp、tnfα和/或il8的中位水平。
健康对照组可以基于与患者中的相同标准组相匹配的遗传背景、习惯和物理属性相关的各种标准来限定。例如，在一些实施方式中，健康对照组和患有ibd的患者在年龄、性别、种族起源、吸烟习惯、饮食习惯、体重指数(bmi)、消遣性毒品的吸食、医疗药物使用、与ibd相关的药物使用、和/或运动习惯相匹配。可以在患者和对照组之间匹配的其他因素包括但不限于临床标准(例如，cdai分值、mayo分值、ibd相关症状的严重性)、代谢、ibd患者的个人疾病史、遗传因素、ibd患者家族疾病史、暴露于环境因素(例如污染物、毒素、过敏原)和生活方式(例如，城市、郊区或农村工作场所和/或住所)。
在一些实施方式中，对照组是在接受初始剂量的smad7反义寡核苷酸之前接受利用smad7反义寡核苷酸的治疗的患者。在一些实施方式中，患者是未治疗的患者。
smad7反义寡核苷酸
在本文中描述的方法和组合物中使用的抗smad7反义寡核苷酸特异性靶向患者的特定smad7序列(例如，包含一个以上多态性)。smad7反义寡核苷酸可以并入对应于smad7中的任意多态性的存在的序列，例如，从患者检测到的多态性。多态性可以包括smad7转录本(参见例如表1)或smad7编码区域(参见例如表2)中描述的任意多态性。
在一个实例中，smad7寡核苷酸序列是mongersen(seqidno:7)的序列。此序列靶向smad7编码序列的核酸108-128(seqidno:1，其对应于登记号nm_005904.3的mrna转录本的核苷酸396-416)。此区域包含snprs144204026，其涉及g→a取代。对于具有此多态性的一个或两个拷贝的患者，能够使用在其序列中包含对应的多态性的反义寡核苷酸(例如，seqidnos:10-13)。本文中提供的反义寡核苷酸与缺少完全对应的序列的寡核苷酸相比，对于减少smad7表达能够提高效能。
当患者对于反义序列内的多态性是杂合体型时(即，具有包含诸如snprs144204026的多态性的smad7基因的一个拷贝与包含共有序列的smad7的一个拷贝)，能够期望地施用反义寡核苷酸的组合，该组合作为混合物或者两个单独组合物，其中一个对应于共有序列(例如，seqidno:1和nm_005904.3)并且一个对应于包含多态性的序列(例如，seqidno:9和10)。基于讨论的患者是否是多态性的携带者，能够判定对于任意特定患者适合的寡核苷酸或寡核苷酸的组合。例如，使用本文中描述的任意方法，能够实现任意多态性的存在(或缺失)的识别。
本领域技术人员应当认可，一些靶向共有序列的smad7反义寡核苷酸，例如包含seqidno:7的核苷酸序列的smad7反义寡核苷酸，能够对下列患者施用，该患者对于缺少反义寡核苷酸(例如，包含seqidno:7的核苷酸序列的smad7反义寡核苷酸)的完全对应靶序列的smad7多态性是纯合体型或杂合体型。这样的smad7反义寡核苷酸，例如包含seqidno:7的核苷酸序列的smad7反义寡核苷酸，能够减少缺少反义寡核苷酸的完全对应靶序列的smad7多态形式的表达。
在某些实施方式中，抗smad7反义寡核苷酸可以靶向人smad7mrna(例如，ncbi参考nm_005904.3)的位点403、233、294、295、296、298、299、和/或533(即，分别为核苷酸403、233、294、295、296、298、299、和/或533)。以上描述的rs144204026多态性位于人smad7序列的位置402。因此靶向核苷酸403的寡核苷酸能够被设计为并入rs144204026多态性。在其他实例中，靶向位点294、295、296、298、或299(例如，294、295、或296)的寡核苷酸可以靶向在转录本位置277包含rs374325868多态性的smad7mrna。
靶向smad7的反义寡核苷酸可以包含混合骨架，其中cpg对中的胞嘧啶残基被5'-甲基胞嘧啶所替代(缩写为me-dc)。也可以在反义寡核苷酸的5'和/或3'末端放置甲基膦酸酯键(缩写为mep)。
靶向smad7的多态形式的示例性反义寡核苷酸疗法包括但不限于：5'-gtxyccccttctctcxycagc-3'(seqidno:21)，其中x是包含选自由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或者2'-o-甲基胞嘧啶核苷酸，并且其中y是包含选自由鸟嘌呤和5-甲基鸟嘌呤所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或者2'-o-甲基鸟嘌呤核苷酸，可选择的条件是核苷酸x或y中的至少一个包含甲基化的含氮碱基；
5'-gtxgccccttctctcxgcag-3'(seqidno:12)，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键；
5'-gtxgccccttctctcxgcagc-3'(seqidno:13)，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键；
5'-ztxgccccttctctcxgcaz-3'(seqidno:18)，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯；
5'-ztxgccccttctctcxgcazc-3'(seqidno:19)，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯；
5'-gtxgccccttctctcxgcagc-3'(seqidno:20)，其中x是5-甲基-2'-脱氧胞苷。
当对患有ibd的患者口服施用时，公开的疗法可以向患者的肠道系统递送有效量的反义寡核苷酸，例如，向患者的末端回肠和/或右半结肠递送有效量的反义寡核苷酸。
预期的反义寡核苷酸包括：包含seqidno:5或者seqidno:11的那些反义寡核苷酸：5'-gtc*gccccttctc(c/t)cc*gcagc-3'，其中c*表示5-甲基-2'脱氧胞苷。在一些实施方式中，预期的反义寡核苷酸的至少一个核苷酸间键合是o,o连接的硫代磷酸酯，例如，seqidno:5的20个核苷酸间键合中的每一个是o,o连接的硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，预期的反义寡核苷酸是包含seqidno:7或13的反义寡核苷酸，其中20个核苷酸间键合中的每一个是o,o连接的硫代磷酸酯键。在特定实施方式中，预期的反义寡核苷酸是包含seqidno:7的反义寡核苷酸，其中20个核苷酸间键合中的每一个是o,o连接的硫代磷酸酯键，在本文中称为“mongersen”。在一些实施方式中，本文中公开的预期的组合物可以包括药学上可接受的盐，例如，seqidno:5、7、11或13的反义寡核苷酸的钠盐，其可选择地可以包含1至20个o,o连接的硫代磷酸酯键核苷酸间键合。预期的寡核苷酸的盐包括完全中和的那些盐，例如，每个硫代磷酸酯键都与诸如na+的离子关联。寡核苷酸可以包含天然存在的核酸碱基、糖类和共价核苷间(骨架)键以及非天然存在的部分。
表3列出示例性smad7反义寡核苷酸的靶序列和被smad7反义寡核苷酸靶向的seqidno:1的smad7编码序列中的区域。靶序列作为dna靶序列示出。但是，对应的rna靶序列也能够被表3所列出的smad7反义寡核苷酸所靶向。
表3
药物组合物
包含针对smad7的反义寡核苷酸(例如本文中公开的那些)的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何合适的方法制备。药物组合物应当配制成与其预期的施用途径兼容。可以通过制药领域熟知的方法制备有用的剂型。例如，参见remington'spharmaceuticalsciences，第22版(pharmaceuticalpressandphiladelphiacollegeofpharmacyatuniversityofthesciences，2012)。
药物剂型优选为无菌的。可以例如通过经由无菌过滤膜过滤来实现灭菌。当组合物被冻干时，过滤灭菌可以在冻干和还原之前或之后进行。
口服施用
在本发明的一些实施方式中，抗smad7疗法可以适于口服递送，例如包含例如抗胃包衣的肠溶衣的片剂，使得该组合物可将反义化合物递送至例如患者的末端回肠和/或右半结肠。例如，这种施用可以导致局部效应，基本上将反义化合物直接局部应用于受试者的胃肠道的受影响部分。在一些实施方式中，这种施用可以基本上避免反义化合物的不希望的全身吸收。
例如，用于口服施用的片剂可以包括颗粒(例如，至少部分地由颗粒形成)，该颗粒包含公开的反义化合物(例如本发明中提供的smad7反义寡核苷酸)和药学上可接受的赋形剂。这种片剂可以用肠溶衣包衣。预期的片剂可以包括药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、崩解剂、和/或润滑剂、以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂(诸如鹿蹄草(wintergreen)、橙、木糖醇、山梨醇、果糖、和麦芽糖糊精)、和芳香剂、防腐剂、和/或抗氧化剂。
在一些实施方式中，预期的药物剂型包括晶内相(intra-granularphase)，其包括预期的反义化合物或药学上可接受的盐，例如本文中提供的smad7反义寡核苷酸，和药学上可接受的填充剂。例如，本文中提供的smad7反义寡核苷酸和填充剂可以与任选的其它赋形剂混合在一起，并形成颗粒。在一些实施方式中，可以使用湿法制粒形成晶内相，例如将液体(例如水)加入到混合的反义化合物和填充剂中，然后将组合物干燥、研磨和/或筛分以产生颗粒。本领域技术人员应当理解，可以使用其他方法来实现晶内相。
在一些实施方式中，预期的剂型包括晶外相(extra-granularphase)，其可以包括一种以上药学上可接受的赋形剂，并且其可以与晶内相混合以形成公开的剂型。
抗smad7疗法的剂型可包括包含填充剂的晶内相。示例性的填充剂包括但不限于纤维素、明胶、磷酸钙、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、微晶纤维素、果胶、聚丙烯酸酯、葡萄糖、乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素、部分预胶化淀粉、碳酸钙、以及包括其组合的其它。
在一些实施方式中，抗smad7疗法剂型可以包括晶内相和/或晶外相，其包括通常可用于将药物剂型的成分保持在一起的粘合剂。本发明的示例性粘合剂包括但不限于下列：淀粉、糖、纤维素或改性纤维素诸如羟基丙基纤维素、乳糖、预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、糖醇、以及包括其组合的其它。
预期的抗smad7疗法剂型(例如包括晶内相和/或晶外相的)可以包括崩解剂，诸如但不限于淀粉、纤维素、交联的聚乙烯吡咯烷酮、乙醇酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸盐、玉米淀粉、交联甲基纤维素钠(crosmellosesodium)、交联羧甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、阿拉伯树胶、以及包括其组合的其它。例如，晶内相和/或晶外相可以包含崩解剂。
在一些实施方式中，预期的抗smad7疗法剂型包括：晶内相，其包含公开的反义化合物；和选自以下的赋形剂：甘露醇、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、和乙醇酸淀粉钠或其组合；以及包含以下一种以上的晶外相：微晶纤维素、乙醇酸淀粉钠、和硬脂酸镁或其混合物。
在一些实施方式中，预期的抗smad7疗法剂型可以包括润滑剂，例如晶外相可以含有润滑剂。润滑剂包括但不限于滑石、硅石(silica)、脂肪、硬脂精、硬脂酸镁、磷酸钙、二氧化硅(siliconedioxide)、硅酸钙、磷酸钙、二氧化硅胶体、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、聚乙二醇、乙酸钠、硬脂酸钙、十二烷基硫酸钠、氯化钠、十二烷基硫酸镁、滑石、和硬脂酸。
在一些实施方式中，药物剂型包含肠溶衣。通常，肠溶衣产生口服药物的屏障，其控制药物沿消化道吸收的位置。肠溶衣可以包含根据ph以不同速率崩解的聚合物。肠溶衣可包含例如醋酸邻苯二甲酸纤维素、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物、c型甲基丙烯酸共聚物、聚醋酸乙烯酯-邻苯二甲酸酯、和醋酸邻苯二甲酸纤维素。
示例性肠溶包衣包括：
在一个实施方式中，抗smad7疗法可以是口服使用的片剂，包含：约0.5％至约10％重量的本文中描述的反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐；约30％至约50％重量的甘露醇；以及约10％至约30％重量的微晶纤维素。
例如，提供了片剂形式的抗smad7疗法，其包含或基本上由下列组成：约0.5％至约70％(例如约0.5％至约10％，或约1％至约20％)重量的反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐(例如，本文中提供的smad7反义寡核苷酸)。这种片剂可以包含：例如约0.5％至约60％重量的甘露醇，例如约30％至约50％重量的甘露醇，例如约40％重量的甘露醇；和/或约20％至约40％重量的微晶纤维素，或约10％至约30％重量的微晶纤维素。例如，预期的片剂可以包含晶内相，其包括约30％至约60％、例如约45％至约65％重量，或可选地，约5至约10％重量的本文中提供的smad7反义寡核苷酸；约30％至50％，或可选地，约5％至约15％重量的甘露醇；约5％至约15％的微晶纤维素；约0％至约4％或约1％至约7％的羟丙基甲基纤维素；和约0％至约4％重量、例如约2％至约4％重量的乙醇酸淀粉钠。
在本发明的一个示例性实施方式中，提供了用于口服施用的药学上可接受的片剂，其包含晶内相，其中晶内相包含约50％重量的本文中提供的smad7反义寡核苷酸(或其盐)、约11.5％重量的甘露醇、约10％重量的微晶纤维素、约3％重量的羟丙基甲基纤维素、和约2.5％重量的乙醇酸淀粉钠；并且还包括晶外相，其中晶外相可以包含20％重量的微晶纤维素、约2.5％重量的乙醇酸淀粉钠、和约0.5％重量的硬脂酸镁。片剂还可以包含肠溶衣。
在另一个示例性实施方式中，提供了用于口服施用的药学上可接受的片剂，其包含或基本上由下列组成：晶内相，其可以包含或基本上由下列组成：约5％至约10％(例如约8％)重量的本文中提供的smad7反义寡核苷酸(例如，其中核苷酸间键合各自是o,o连接的硫代磷酸酯，和/或其盐，例如钠盐)、约40％重量的甘露醇、约8％重量的微晶纤维素、约5％重量的羟丙基甲基纤维素、和约2％重量的乙醇酸淀粉钠；和晶外相，其可以包含约17％重量的微晶纤维素、约2％重量的乙醇酸淀粉钠、和约0.4％重量的硬脂酸镁。
非肠道施用
本发明的药物组合物可以配制成用于非肠道的施用，例如配制成用于通过静脉内、肌内、皮下、病灶内、或腹膜内途径注射。根据本公开，水性组合物，诸如包含smad7抑制剂的水性药物组合物的制备将为本领域技术人员所了解。通常，这样的组合物可以制备为作为液体溶液或悬浮液的注射剂；也可以制备为适于在注射前加入液体以制备溶液或悬浮液的固体形式；并且制剂也可以乳化。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；剂型包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，剂型必须是无菌的，并且必须是程度为存在容易注射性的流体。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用地保存。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在适当地与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备。此外，无菌的不挥发油可以用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸可以用于制备注射剂。无菌注射制剂也可以是在无毒的非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液、或乳液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液、u.s.p.、和等渗氯化钠溶液。在一个实施方式中，可以将smad7抑制剂悬浮在包含1％(w/v)羧甲基纤维素钠和0.1％(v/v)tweentm80的载液中。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制注射制剂，例如无菌注射水性或油性悬浮液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和上文列举的那些的需要的其它成分。可以通过将smad7抑制剂以及根据需要的多种上述其它成分并入所需量的适当溶剂中，然后过滤灭菌来制备本发明的无菌注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何额外的所需成分的粉末。可注射剂型可以例如通过细菌截留过滤器过滤而灭菌。
也预期了用于肌内注射的更高浓度或高度浓缩的溶液的制备。在此方面，优选使用dmso作为溶剂，因为这将导致极其快速的渗透，将高浓度的smad7抑制剂递送至小区域。
用于这种溶液的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等。合适的缓冲剂包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠10和碳酸钾10、乙酸钠、磷酸二氢钠等，其用量足以将ph保持在约ph6和ph8之间，并且优选在约ph7和ph7.5之间。合适的张度剂是右旋糖苷40、右旋糖苷70、葡萄糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠等，使得眼用溶液的氯化钠当量在0.9±0.2％的范围内。合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲等。合适的润湿剂和澄清剂包括聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊。合适的增粘剂包括右旋糖苷40、右旋糖苷70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等。
在一个示例性实施方式中，针对smad7的反义寡核苷酸的用于皮下施用的药物组合物包含：反义寡核苷酸，诸如由seqidno:7表示的反义寡核苷酸，或其药学上可接受的盐(诸如钠盐)，以及药学上可接受的载体。
预期的片剂可以包含肠溶衣，例如，公开的片剂可以包含约13％、约14％、约15％、约16％、约17％重量的肠溶衣，例如丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物(例如
例如，抗smad7疗法可以是用于口服使用的药学上可接受的片剂的形式，其包含晶内相和晶外相，其中例如，晶内相包含约5％至约10％重量(例如约8％重量)的由seqidno:7表示的反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐、约40％重量的甘露醇、约8％重量的微晶纤维素、约5％重量的羟丙基甲基纤维素、和约2％重量的乙醇酸淀粉钠，并且例如，晶外相包含约17％重量的微晶纤维素、约2％重量的乙醇酸淀粉钠、和约0.4％重量的硬脂酸镁，其中该片剂可以进一步包含肠溶衣。
在一些实施方式中，当对患者口服施用时，预期的剂型(例如片剂)可以对患者产生寡核苷酸的最小血浆浓度。在另一个实施方式中，当对患者口服施用时，预期的剂型将局部递送至患者的末端回肠和/或右半结肠，例如患者的受影响或患病的肠位点。
施用和剂量
示例性剂型包括剂量形式，其包含或基本上由约10mg至约500mg的针对smad7的反义寡核苷酸组成。例如，本文中预期了包含约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约200mg、或约250mg针对smad7的反义寡核苷酸的剂型。在一个实施方式中，剂型可以包括约40mg、80mg、或160mg针对smad7的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，剂型可以包括至少100μg针对smad7的反义寡核苷酸。例如，剂型可以包括约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、或25mg针对smad7的反义寡核苷酸。施用的量将取决于变量，诸如待治疗的疾病或适应症的类型和程度、患者的整体健康和体型、反义寡核苷酸的体内效力、药物剂型和施用途径。初始剂量可以增加到超过较高水平(upperlevel)以便快速达到期望的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以小于最佳剂量，并且剂量可以在治疗过程中逐渐增加。可以例如在设计为从40mg至160mg进行的常规i期剂量递增试验中优化人用剂量。给药频率可以根据诸如施用途径、剂量和所治疗的疾病的因素而变化。示例性给药频率为每天一次、每周一次和每两周一次。在一些实施方式中，给药是每天一次，持续7天。
联合治疗
在本发明的一些实施方式中，抗smad7疗法可以在其它治疗之后施用或与其它治疗同时施用，其它治疗例如但不限于一种以上的类固醇、一种以上的免疫调节剂、和/或美沙拉嗪。抗smad7疗法可以在这些治疗的任何组合之后施用或与其同时施用。例如，在一些实施方式中，抗smad7疗法可以仅与一种以上的类固醇、仅与一种以上的免疫调节剂、仅与美沙拉嗪、与一种以上的类固醇和一种以上的免疫调节剂、与一种以上的类固醇和美沙拉嗪、或与一种以上的免疫调节剂和美沙拉嗪一起施用。
免疫调节剂的实例包括硫唑嘌呤、巯嘌呤、甲氨蝶呤、环孢霉素a、和他克莫司。类固醇的实例包括皮质类固醇，例如强的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、强的松、和布地奈德。在一些实施方式中，代替美沙拉嗪，可以施用不同的水杨酸，例如柳氮磺吡啶。在本发明的一些实施方式中，类固醇、免疫调节剂、或美沙拉嗪可以通过与抗smad7疗法相同的途径(即，口服)施用。在本发明的一些实施方式中，类固醇、免疫调节剂、或美沙拉嗪可以通过与抗smad7疗法不同的途径施用。例如，类固醇、免疫调节剂、或美沙拉嗪可以非肠道、直肠、静脉内、局部、或通过吸入喷雾施用。
监测疗法
可以使用任何适当的方法来监测反义疗法在治疗炎症性肠病中的有效性。例如，可使用已知与炎症性肠病或过量的smad7活性相关联的任何生物标志物来监测患者的治疗的有效性，如任何主观或客观临床量表。监测治疗在评估治疗效果和安全性以及评估调节治疗的需要方面可能是有用的。监测治疗还可用于评估施用于患者或将施用于患者的smad7反义寡核苷酸的量是否应当增加或减少或者反义是否有效。此外，监测治疗在确定smad7反义寡核苷酸的剂量应该被调节(即增加或减少)的量或相对量方面可能是有用的。
监测，例如监测患有ibd的患者的生物标志物或生物标志物的组合(例如，crp、tnfα、和il8)的水平，可以在smad7反义寡核苷酸的初始剂量之前、期间、或之后开始。此外，监测可以在初始剂量之后继续。例如，可以在施用初始剂量之后进行监测。监测也可以在smad7反义寡核苷酸的后续剂量之前、期间、或之后进行。监测可以是连续或不连续的，使得可以以规律的间隔进行监测，例如，在对患者施用每个剂量smad7反义寡核苷酸之后、在对患者施用每个剂量smad7反义寡核苷酸之前、或者在对患者施用每个剂量的smad7反义寡核苷酸之前和之后进行监测。监测可以在单日中多次(例如，在单日中2次、3次、4次、约5次、或约10次)、每天一次、单周多次(例如，在单周中2次、3次、4次、约5次、或约10次)、每周一次、单月多次(例如，在单月内2次、3次、4次、约5次、或约10次)、或每月一次地进行。在本发明的方法中，可以在相对于施用步骤的各种时间进行监测。例如，在一些实施方式中，监测可以在施用步骤之后立即、或施用步骤之后至少1天、至少3天、至少5天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、或至少6个月后进行。在一些实施方式中，在施用步骤后约15天或约28天进行监测。
在一些情况下，知道生物标志物的正常或异常水平的阈值将是有用的，以便确定smad7反义寡核苷酸的水平是否应当增加、减少或保持不变。crp的正常水平可以与特定值有关，例如，约0.01mg/l、约0.05mg/l、约0.1mg/l、约0.2mg/l、约0.3mg/l、约0.4mg/l、约0.5mg/l、约0.6mg/l、约0.7mg/l、约0.8mg/l、约0.9mg/l、约1.0mg/l、约1.5mg/l、约2.0mg/l、约2.5mg/l、或约3.0mg/l的值。取决于对照受试者，tnfα的正常水平可以是约11μg/l(例如，11.2μg/l)，或可以是其他值(例如，5μg/l、6μg/l、7μg/l、8μg/l、9μg/l、10μg/l、12μg/l、13μg/l、14μg/l、或15μg/l)。取决于对照受试者，血清中il8的正常水平可以是约13μg/l(例如，12.9μg/l)，或可以是其他值(例如，6μg/l、7μg/l、8μg/l、9μg/l、10μg/l、11μg/l、12μg/l、14μg/l、15μg/l、16μg/l或17μg/l)。参见，例如，arican等，mediatorsinflamm.2005:273，2005。在一些实施方式中，可以通过与健康对照组中的生物标志物的中位水平进行比较来确定一生物标志物的正常水平，所述健康对照组与患者相对于各种因素，例如年龄、性别、种族起源、吸烟习惯、饮食习惯、体重指数(bmi)、和/或运动习惯进行匹配。
生物标志物或生物标志物组合(例如，crp、tnfα、和il8)的水平可以通过从患者获得样本来确定。根据本文中描述的方法，样本可以是组织样本(例如胃肠组织样本)或体液样本(例如唾液样本、粪便、尿液样本或任何液体活检)。样本可以包括含有生物标志物表达细胞(例如结肠上皮组织细胞)的固体组织活检。样本可以是从患者组织活检(例如粘膜组织活检(例如肠粘膜组织活检))获得的样本。此外，样本可以是血液、血清或血浆样本。可以使用本领域熟知的技术获得来自受试者的血液样本。血液样本可以包括外周血单核细胞(pmbc)、rbc缺失的全血、或血清。可以使用不同密度梯度(例如，ficoll密度梯度)离心程序从全血样本中分离pbmc。例如，将全血(例如抗凝全血)在分离介质上分层并离心。在离心步骤结束时，从顶部到底部目视观察到以下层：血浆/血小板、pbmc、分离介质和红细胞/粒细胞。
还可以基于时间参数从患者获得或提取样本。例如，可以在给定时间段内，例如约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约3天、约1周、或约1个月内，在不同的时间点，例如约每30分钟、约每小时、约每3小时、约每6小时、或约每12小时，从同一患者获取样本。也可以在个体餐后，例如，餐后立即、约30分钟后、约1小时后、约2小时后、约3小时后、约4小时后、约5小时后、或约6小时后，获得样本。
监测治疗的方法还可以包括监测其它因素的方法，其它因素包括但不限于生物标志物(例如，crp、tnfα、和il8)的水平、cdai分值、临床缓解、以及ibd症状的存在或严重程度。
在本发明的实施方式中，其中测量了生物标志物或生物标志物的组合(例如，crp、tnfα、和il8)的水平，可以使用各种方法测量生物标志物。例如，可以使用免疫化学和/或通过核苷酸分析来确定生物标志物例如il8、tnfα、或crp的水平。例如，可以通过免疫化学确定血液或组织样本、或已知体积的血液或组织样本的一部分中的生物标志物的量。通过免疫化学确定生物标志物浓度的方法包括但不限于western印迹、elisa、和免疫染色方法。在一些实施方式中，使用可以结合目标生物标志物的抗体、例如直接针对生物标志物的抗体进行通过免疫化学确定生物标志物浓度的方法。通过免疫化学分析生物标志物浓度需要例如至少一种针对生物标志物的抗体。一抗可以用可检测标记(例如荧光标记物)标记。可替代地，可以使用由可检测标记(例如荧光标记物)标记的、与一抗的物种同种型特异性结合的二抗进行免疫化学。通过免疫化学确定生物标志物浓度的方法还可包括使用缓冲液、封闭试剂、未偶联的一抗、以及与允许抗体检测的标记(诸如荧光探针或底物特异性酶)偶联的一抗和/或二抗。
通过核苷酸分析确定生物标志物浓度的方法包括但不限于分析生物标志物mrna转录本水平的方法，诸如northern印迹和聚合酶链反应法，例如定量聚合酶链反应法。可以使用结合生物标志物核苷酸序列(例如，crp核苷酸序列)的寡核苷酸探针或能够通过聚合酶链反应(例如，通过定量聚合酶链反应)扩增生物标志物核苷酸序列的寡核苷酸引物对来进行核苷酸分析。寡核苷酸探针和寡核苷酸引物可以连接到可检测标签，例如荧光标签。在通过核苷酸分析确定生物标志物浓度时，医师可以评估样本中的特定生物标志物的mrna转录本浓度。可替代地，在通过核苷酸分析确定生物标志物浓度时，医师可以建立特定生物标志物mrna转录本丰度与特定生物标志物蛋白质丰度之间的相关性，以便基于生物标志物mrna转录本丰度的测量外推生物标志物蛋白质浓度。
本发明的方法包括可以在体外进行的步骤。例如，预期测量受试者的生物标志物水平、确定样本中生物标志物的水平、和/或确定cdai分值或进行确定cdai分值所必需的测量的步骤可以在体外进行。例如，可以通过在体外对样本进行免疫化学或核苷酸分析来确定样本中生物标志物的水平。可替代地，在本发明的一些实施方式中，确定和分析患有ibd的患者的生物标志物水平、确定和分析样本中的生物标志物水平、和/或确定cdai分值或进行确定cdai分值所必需的测量的步骤可以在体内进行。
适合于免疫化学的抗il8抗体是可商购的，包括但不限于来自abcam的羊抗人il8(目录号ab10769)、来自santacruz的小鼠抗人il8(目录号sc-73321、sc-52870和sc-7302)、来自pierce的小鼠抗人il8(3il8-h10)(目录号m801)、和来自sigma-aldrich的小鼠抗人il8(目录号wh0003576m5)抗体。
适合于免疫化学的抗tnfα抗体是可商购的，包括但不限于来自abcam的兔抗人tnfα(目录号ab9635)、来自cellsignalingtechnology的兔抗人tnfα(目录号3707)、来自affymetrixebioscience的小鼠抗人tnfα(目录号14-7348-81)、和来自rocklandantibodies&assays的抗体的兔抗人tnfα(目录号209-401-306s)的抗体。
适合于免疫化学的抗crp抗体是可商购的，例如来自santacruzbiotechnology的羊抗人crp多克隆抗体(目录号sc-18304和sc-18306)、来自santacruzbiotechnology的兔抗人crp多克隆抗体(目录号sc-30047)、来自santacruzbiotechnology的小鼠抗人crp单克隆抗体(目录号sc-70883)、来自sigma-aldrich的小鼠抗人crp单克隆抗体(目录号c1688-.2ml)、来自abcam的兔抗人单克隆抗体(目录号ab32412)、来自abcam的小鼠抗人crp单克隆抗体(目录号ab13426)、和来自thermoscientific的羊抗人crp多克隆抗体(目录号g0301-1b)。
通过参考下列实例，已经一般地描述的本发明将会更容易理解，其中下列实例的包括仅出于说明本发明的特定方面和实施方式的目的，并且无意以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1对于rs144204026snp为杂合体型的患者
患者被诊断为患有克罗恩病。在疗法开始之前，使用标准测序技术分析患者的smad7基因序列，以判定rs144204026snp的存在与否。
作为测序结果，患者被判定为具有smad7基因rs144204026多态性(即，该位置为“a”)的一个拷贝和共有序列(即，该位置为“g”)的一个拷贝。基于此判定，对患者施用两种不同的反义疗法，一种具有mongersen的序列(即seqidno:5)、一种具有mongersen的对应于rs144204026多态性的核苷酸被取代的序列(即seqidno:11)。
在使用反义疗法的组合治疗之后，患者与克罗恩病相关联的症状得到减轻。
实施例2对于rs144204026snp为纯合体型的患者
患者被诊断为患有克罗恩病。在疗法开始之前，使用标准测序技术分析患者的smad7基因序列，以判定rs144204026snp的存在与否。
作为测序结果，患者被判定为具有smad7基因rs144204026多态性(即，该位置为“a”)的两个拷贝。基于此判定，对患者施用单一反义疗法，其具有mongersen的对应于rs144204026多态性的核苷酸被取代的序列(即seqidno:11)。
在使用反义疗法治疗之后，患者与克罗恩病相关联的症状得到减轻。
序列
seqidno:1(nm_005904.3的编码序列cds(288-1568)；智人smad家族成员7(smad7)，转录变体1，mrna)-下划线标注了mongersen靶点的靶序列及其衍生物(108-128)；双下划线标注了snp(g/a)
seqidno:2(截短的mongersen靶序列；突出标注了snprs144204026位置)
5'-ctgcggggagaaggggcgac-3'
seqidno:3(mongersen靶序列；突出标注了snprs144204026位置)
5'-gctgcggggagaaggggcgac-3'
seqidno:4(截短的mongersen序列；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-gtcgccccttctccccgcag-3'
seqidno:5(mongersen序列；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-gtcgccccttctccccgcagc-3'
seqidno:6(截短的mongersen；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-gtxgccccttctcccxgcag-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键
seqidno:7(mongersen；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-gtxgccccttctcccxgcagc-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键
seqidno:8(截短的mongersen靶序列的多态变体；突出标注了snprs144204026位置)
5'-ctgcggagagaaggggcgac-3'
seqidno:9(mongersen靶序列的多态变体；突出标注了snprs144204026位置)
5'-gctgcggagagaaggggcgac-3'
seqidno:10(截短的mongersen序列的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-gtcgccccttctctccgcag-3'
seqidno:11(mongersen序列的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-gtcgccccttctctccgcagc-3'
seqidno:12(截短的mongersen的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-gtxgccccttctctcxgcag-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键
seqidno:13(mongersen的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-gtxgccccttctctcxgcagc-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且其中全部核苷酸间键合是硫代磷酸酯键
seqidno:14(mongersen的变体；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-ztxgccccttctcccxgcazc-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯
seqidno:15(截短的mongersen的变体；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-ztxgccccttctcccxgcaz-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯
seqidno:16(mongersen的变体；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-gtxgccccttctcccxgcagc-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷
seqidno:17(mongersen的变体；突出标注的位置对应于snprs144204026位置)
5'-gtxyccccttctcccxycagc-3'
x是包含选自由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或者2'-o-甲基胞嘧啶核苷酸，并且y是包含选自由鸟嘌呤和5-甲基鸟嘌呤所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或者2'-o-甲基鸟嘌呤核苷酸，条件是核苷酸x或y的至少一个包含甲基化的含氮碱基
seqidno:18(截短的mongersen变体的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-ztxgccccttctctcxgcaz-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯
seqidno:19(mongersen变体的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-ztxgccccttctctcxgcazc-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷并且z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯
seqidno:20(mongersen变体的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-gtxgccccttctctcxgcagc-3'
x是5-甲基-2'-脱氧胞苷
seqidno:21(mongersen变体的多态变体；突出标注了靶向snprs144204026的位置)
5'-gtxyccccttctctcxycagc-3'
x是包含选自由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或者2'-o-甲基胞嘧啶核苷酸，并且y是包含选自由鸟嘌呤和5-甲基鸟嘌呤所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或者2'-o-甲基鸟嘌呤核苷酸，条件是核苷酸x或y的至少一个包含甲基化的含氮碱基。
等同物
尽管已经讨论了主题发明的具体实施例，但是上述说明是示意性的而非限制性的。在阅读本说明书之后，本发明的许多变体对于本领域技术人员将是明显的。本发明的完整范围应当通过参考权利要求书及其等同物的完整范围、以及说明书及这些变体来确定。
除非另有说明，说明书和权利要求书中表示成分的量、反应条件等等的全部数字应被理解为在所有情况下被术语“约”所修饰。因此，除非有相反说明，本说明书及随附的权利要求书中记载的数值参数是可以取决于于本发明试图获得的期望性质而变化的近似值。
通过引用并入
本文引用的所有专利、公开的专利申请、网站和其他参考文献的全部内容通过引用以其整体明确并入本文。