一种真菌发酵产漆酶液态培养基及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种真菌发酵产漆酶液态培养基及其制备方法和应用。

背景技术：

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种蓝多铜氧化酶，由日本学者于1883年首次在一种日本漆树发现，是目前唯一一个实现工业化生产和应用的木质素降解酶。除植物之外，研究发现漆酶也存在于细菌、真菌和昆虫之中。尤其是一类对树木具有腐败作用的白腐真菌漆酶产量最高，同时也是目前最主要的漆酶生产菌种。漆酶是一种单电子氧化酶，能够以氧气作为电子受体生成水的同时对底物形成氧化作用。

由于漆酶具有较低的底物作用特异性，而对多种底物具有氧化作用，目前已研究发现漆酶的作用底物达200多种，主要是酚类化合物及其衍生物或酚类化合物结构类似物及其衍生物。由于漆酶对多种天然化合物或人工合成化合物具有降解作用，使得漆酶不仅在生物能源、造纸和纺织行业中得到广泛应用研究，同时在染料废水处理、生物修复、废报纸脱墨、新型生物传感器、生物燃料电池和食品检测等诸多领域中也备受关注。

目前制约漆酶普遍应用的主要因素是漆酶的发酵制备成本过高。漆酶的发酵制备成本主要由三个因素决定，一是生产菌株的产酶水平，二是发酵培养基价格，三是发酵周期；而发酵培养基的组成不仅直接决定了培养基的成本，同时对产酶水平和发酵周期的变化也具有较强的影响。

中国专利CN 102719410 B提供了一种专用于漆酶的培养基配方及其制备方法，该专利中使用的培养基主要含有红薯汁、甘露糖、酵母膏、蛋白胨、干酪素和麦芽糖等成分，利用该培养基发酵培养14天后发酵液中漆酶活力平均约0.34U/mL，具有培养基成本高，发酵时间长，产酶活力低的特点。

中国专利CN 102399704 B提供了一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基及其应用，该专利中使用的培养基主要含有麸皮、大量元素、微量元素以及价格较为昂贵的酸水解干酪素和维生素B1等成分，利用该培养基培养13d后发酵液中的漆酶活力为50U/mL，具有培养基制作复杂、成本较高和发酵效率低的特点。

中国专利CN 102181410 B提供了一种发酵生产漆酶的方法，该专利中使用的培养基主要含有葡萄糖、酒石酸铵、大量元素、微量元素以及价格较为昂贵的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和维生素B1等成分，利用一色齿毛菌经发酵6d后达到56.45U/mL，具有培养基制作复杂和成本较高的特点。

目前漆酶的主要产生菌株真菌的发酵培养基通常含有大量的酵母膏、蛋白胨、维生素、干酪素或其水解物等价格昂贵的营养物质，且产酶水平一般在几个至几十个单位每毫升不等，且发酵时间通常在两周左右，甚至达到一个月之久，致使漆酶的发酵制备成本居高不下并成为限制漆酶工业化生产和应用的主要瓶颈问题。

我国柚资源丰富，是柚子的主要生产国和消费国之一。柚皮约占整个柚果重量的40％～50％，一般在柚子果肉经加工或食用后直接作废弃物进行处理，造成资源的极大浪费，且废弃柚皮由于发霉、变味而对环境造成污染。柚皮中含有果胶、木质素、纤维素、多糖、柚皮苷、酯类、酚类、黄酮类化合以及多种矿物质，其中木质素、柚皮苷、酚类和黄酮类化合物等物质也是漆酶的作用底物，因此柚皮是一种理想的漆酶发酵原料或诱导物。

技术实现要素：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种真菌发酵产漆酶液态培养基及其制备方法和应用，目的是降低漆酶的工业制备成本，便于柚皮的废物利用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种真菌发酵产漆酶液态培养基，每L所述液体培养基包括如下组分:柚皮粉10～40g，麸皮粉5～10g，豆粕、豆渣之一或其混合物3～10g，氯化铵3～10g，五水硫酸铜0.1～0.5g，葡萄糖、麦芽糖之一或其混合物5～15g，氯化钠5～15g，磷酸二氢钾1～2g，氯化钙0.3～0.8g。

所述漆酶产生菌种包括栓菌(Trametes sp.)LS-10C、毛栓菌(Trametes hirsute)LS-7、二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4或白耙齿菌(Irpex lacteus)LS-6。其中，栓菌LS-10C已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015191，保藏日期为2015年04月03日,保藏地址为中国武汉武汉大学。栓菌LS-10C的相关保藏信息已经在申请号为201510391964.8，名称为栓菌及其应用的专利申请中提交。

所述真菌发酵产漆酶液态培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤，

A、柚皮粉的制备：收集柚皮经干燥、粉碎、过筛得柚皮粉，其中，干燥后的柚皮含水量在5％～10％之间；

B、麸皮粉的制备：将麸皮经粉碎过筛得到；

C、发酵培养基的制备：

组分(1)：将葡萄糖、麦芽糖之一或其混合物5～15g溶于100ml水中，高温灭菌处理后冷却至室温备用；

组分(2)：将磷酸二氢钾1～2g溶于100ml水中，高温灭菌处理后冷却至室温备用；

组分(3)：依次将氯化钠5～15g，氯化钙0.3～0.8g，氯化铵3～10g和五水硫酸铜0.1～0.5g溶于100ml水中，高温灭菌处理后冷却至室温备用；

组分(4)：依次将柚皮粉10～40g，麸皮粉5～10g，豆粕、豆渣之一或其混合物3～10g溶于700ml水中，高温灭菌处理后冷却至室温备用；

将组分(1)、组分(2)、组分(3)、组分(4)按1:1:1:7的比例进行混合，调节pH值在4.0～7.0之间，即制得真菌发酵产漆酶发酵培养基。

较好的是，组分(1)中高温灭菌的温度为105～110℃，组分(2)中高温灭菌的温度为110～115℃，组分(3)中高温灭菌的温度为115～121℃，组分(4)中高温灭菌的温度为121～123℃。

步骤A中柚皮的干燥温度为50～60℃，粉碎过80～120目筛子，此条件处理后的柚皮粉经后续处理得到的真菌发酵产漆酶发酵培养基具有较好的产漆酶活力值。

优选的，步骤B中粉碎过60～120目筛子。

所述调节pH值采用氨水或稀硫酸调节。

所述氨水为质量分数25％～28％的氨水，所述稀硫酸的浓度为0.2mmol/L。

所述真菌发酵产漆酶液态培养基在利用农业废弃物柚皮中的应用。

本发明有益效果是:

1.本发明培养基中使用农业废弃物柚皮作为主要的培养基质，降低漆酶工业制备成本的同时为柚皮的综合利用提供了一种方法；

2.本发明培养基中使用麸皮、豆渣或豆粕等农业副产物作为辅助营养成分，且不含有ABTS、干酪素或维生素B1等价格昂贵的原料，培养基制备简单、原料易得、价格低廉；

3.本发明培养基可显著提升多种真菌的漆酶发酵活力，具有发酵时间短和漆酶产量高的特点，对多种真菌发酵产漆酶具有普适性。

附图说明

下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1是本发明的实施例1产漆酶培养基中接种4种真菌培养9天后产漆酶活力示意图；

图2是本发明的实施例2产漆酶培养基中接种4种真菌培养9天后产漆酶活力示意图；

图3是本发明的实施例3产漆酶培养基中接种4种真菌培养9天后产漆酶活力示意图。

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

本发明的真菌发酵产漆酶液态培养基的制备步骤包括：

A、柚皮粉的制备

收集新鲜的柚皮并在50～60℃下干燥，使含水率在5％～10％之间，然后使用粉碎机将干燥柚皮粉碎，粉碎后过80～120目筛子，即得到柚皮粉。

B、麸皮粉的制备

将新鲜购买的麸皮使用粉碎机进一步粉碎后过60～120目筛子，即得到麸皮粉。

C、发酵培养基的制备

各营养组分的准备

组分(1)：在100mL自来水中加入葡萄糖、麦芽糖之一或其混合物5～15g，搅拌并充分溶解，备用。

组分(2)：在100mL自来水中加入磷酸二氢钾1～2g，搅拌并充分溶解，备用。

组分(3)：在100mL自来水中依次加入氯化钠5～15g，氯化钙0.3～0.8g，氯化铵3～10g和五水硫酸铜0.1～0.5g，搅拌并充分溶解，备用。

组分(4)：在700mL自来水中依次加入柚皮粉10～40g，麸皮粉5～10g，豆粕、豆渣之一或其混合物3～10g，搅拌均匀后于室温放置1～2h后备用。

各营养组分的灭菌

使用高压灭菌锅将上述组分(1)在105～110℃下灭菌10～20min后取出并冷却至室温，备用。

使用高压灭菌锅将上述组分(2)在110～115℃下灭菌15～25min后取出并冷却至室温，备用。

使用高压灭菌锅将上述组分(3)在115～121℃下灭菌20～30min后取出并冷却至室温，备用。

使用高压灭菌锅将上述组分(4)在121～123℃下灭菌30～40min后取出并冷却至室温，备用。

培养基各组分的混合

在超净工作台内将上述4种灭菌后的组分(1)、组分(2)、组分(3)和组分(4)按1:1:1:7的比例进行混合，混合后使用氨水(25％～28％)或稀硫酸(0.2mmol/L)调节pH，使pH值在4.0～7.0之间，即制得产漆酶发酵培养基。

下面通过优选的实施例进行具体说明：

实施例1

通过调整配制发酵培养基所需组分(1)、组分(2)、组分(3)、和组分(4)中的物质比例，按1:1:1:7比例混合后使每L发酵培养基中含有柚皮粉10g，麸皮粉10g，豆粕1g，豆渣2g，氯化铵3g，五水硫酸铜0.2g，葡萄糖10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，调节pH至5.0后在无菌条件下分别分装45mL培养基至250mL三角瓶，即值得产漆酶发酵培养基。

柚皮粉是新鲜柚皮在50℃下干燥后经粉碎、过100目筛子而制得，其含水率为5％。

麸皮粉是麸皮经粉碎、过80目筛子而制得。

组分(1)灭菌条件为：105℃，15min。

组分(2)灭菌条件为：115℃，20min。

组分(3)灭菌条件为：121℃，20min。

组分(4)灭菌条件为：121℃，30min。

按10％接种量接种至所述发酵培养基培养栓菌(Trametes sp.)LS-10C、毛栓菌(Trametes hirsute)LS-7、二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4或白耙齿菌(Irpex lacteus)LS-6，培养9天后发酵液中的漆酶活力最高达707.2U/mL(图1)。

漆酶活力的测定方法为：分别将ABTS溶液和酶液置于40℃恒温水浴锅中预热5min后，吸取1.5mL酶液加入1.5mL底物溶液中，立即充分混匀并分别记录在0至30秒、30至60秒、60秒至90秒内反应液在420nm处吸光值的变化，以上述3次测定的吸光值变化值的平均值记为反应体系平均吸光值的变化值。

漆酶活力的定义为：在上述酶促反应条件下，定义1min内氧化1μmol ABTS所需要的酶量为一个漆酶活力单位(U)，并将漆酶发酵活力表示为U/mL。

实施例2

通过调整配制发酵培养基所需组分(1)、组分(2)、组分(3)、和组分(4)中的物质比例，按1:1:1:7比例混合后使每L发酵培养基中含有柚皮粉30g，麸皮粉8g，豆粕5g，氯化铵5g，五水硫酸铜0.3g，葡麦芽糖10g，氯化钠10g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钙0.5g，调节pH至4.0后在无菌条件下分别分装45mL培养基至250mL三角瓶，即值得产漆酶发酵培养基。

柚皮粉是新鲜柚皮在50℃下干燥后经粉碎、过80目筛子而制得，其含水率为10％。

麸皮粉是麸皮经粉碎、过80目筛子而制得。

组分(1)灭菌条件为：105℃，15min。

组分(2)灭菌条件为：115℃，15min。

组分(3)灭菌条件为：121℃，20min。

组分(4)灭菌条件为：121℃，20min。

按10％接种量接种至所述产漆酶发酵培养基培养栓菌(Trametes sp.)LS-10C、毛栓菌(Trametes hirsute)LS-7、二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4或白耙齿菌(Irpex lacteus)LS-6，培养9天后发酵液中的漆酶活力最高达875.9U/mL(图2)。

实施例3

通过调整配制发酵培养基所需组分(1)、组分(2)、组分(3)、和组分(4)中的物质比例，按1:1:1:7比例混合后使每L发酵培养基中含有柚皮粉30g，麸皮粉8g，豆粕5g，氯化铵5g，五水硫酸铜0.3g，葡麦芽糖10g，氯化钠10g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钙0.5g，调节pH至7.0后在无菌条件下分别分装45mL培养基至250mL三角瓶，即值得产漆酶发酵培养基。

柚皮粉是新鲜柚皮在60℃下干燥后经粉碎、过120目筛子而制得，其含水率为5％。

麸皮粉是麸皮经粉碎、过100目筛子而制得。

组分(1)灭菌条件为：105℃，20min。

组分(2)灭菌条件为：115℃，20min。

组分(3)灭菌条件为：121℃，20min。

组分(4)灭菌条件为：123℃，40min。

按10％接种量接种至所述产漆酶发酵培养基培养栓菌(Trametes sp.)LS-10C、毛栓菌(Trametes hirsute)LS-7、二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4或白耙齿菌(Irpex lacteus)LS-6，培养9天后发酵液中的漆酶活力最高达645.7U/mL(图3)。

实施例4

通过调整配制发酵培养基所需组分(1)、组分(2)、组分(3)、和组分(4)中的物质比例，按1:1:1:7比例混合后使每L发酵培养基中含有柚皮粉30g，麸皮粉10g，豆粕5g，豆渣5g，氯化铵5g，五水硫酸铜0.3g，葡萄糖10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.5g，调节pH至5.0后在无菌条件下分别分装45mL培养基至250mL三角瓶，即值得产漆酶发酵培养基。

柚皮粉是新鲜柚皮在60℃下干燥后经粉碎、过120目筛子而制得，其含水率为5％。

麸皮粉是麸皮经粉碎、过120目筛子而制得。

组分(1)灭菌条件为：105℃，20min。

组分(2)灭菌条件为：110℃，20min。

组分(3)灭菌条件为：115℃，30min。

组分(4)灭菌条件为：123℃，40min。

按10％接种量接种至所述产漆酶发酵培养基培养栓菌(Trametes sp.)LS-10C、毛栓菌(Trametes hirsute)LS-7、二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4或白耙齿菌(Irpex lacteus)LS-6，培养9天后发酵液中的漆酶活力最高达1011.4U/mL(表1)。

分别采用PDA(每L含有200g土豆浸出汁和20g葡萄糖)以液态发酵培养基培养上述4种真菌，发酵9天后发酵液中漆酶活力最高达仅为8.4U/mL(表1)。

表1 4种真菌利用不同培养基发酵产漆酶活力(U/mL)

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。