一种以木质纤维素为原料制备高浓度发酵糖溶液的方法与流程

本发明属于再生资源循环利用和生物质能源领域，具体涉及一种以木质纤维素为原料制备高浓度发酵糖的方法。

背景技术：

近年来，社会对资源的需求与日俱增，传统化石资源储量逐渐减少，满足不了人类社会可持续发展的需要；另一方面，燃烧化石资源造成的环境污染和温室效应，也带来了严重的环境和社会问题。因此，寻求清洁可再生的“资源替代”和“过程替代”已经迫在眉睫。生物质是地球上储量最丰富的可再生资源库，可代替石油生产各种生物燃料和生物基化学品，产生良好的环境效益。譬如，生物乙醇代替汽油，可有效地降低温室气体排放量；生物乳酸可用作为生物兼容和可降解的医用材料。2004年，美国能源部指出，由生物质制取糖类化合物，是非常重要的平台化合物，然后通过生物炼制技术可以转化为各种各样的化学和生物产品：燃料替代品如乙醇，烷烃等；材料替代品如乳酸，丁二酸等；食品替代品如木糖醇，山梨糖醇等等。

通过查阅专利和文献报道，我们发现，木质纤维素制糖是决定木质纤维素生物炼制放大成本的关键步骤，至今仍存在诸多挑战。木质纤维素生物质中碳水化合物包含纤维素和半纤维素，其中纤维素是葡萄糖单体经过β1-4糖苷键聚合而成，约占30-40％，半纤维素主要成分是木聚糖，还包含少量的葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等，约占15-33％。目前，阻碍木质纤维素生物炼制产业化的困难在于，纤维素和半纤维素水解效率低，水解液中糖浓度不高，后续发酵目标产物浓度低，分离成本大。以生物乙醇发酵为例，工业化纤维素乙醇浓度要求达到40g/L以上，意味着水解液中糖浓度理论上至少需要80g/L。因此，高浓度可发酵糖溶液的制备，是木质纤维素生物炼制工程化的关键所在。

提高木质纤维素水解液中糖浓度和发酵目标产物产量的方法，主要集中于原料预处理和发酵过程优化。国外文献(DOI：10.1039/c5ee03718b，2016)报道了以玉米秸秆为原料，通过脱乙酰化-机械精炼和纤维素酶水解，制得总糖浓度为230g/L的水解液，酵母发酵后，乙醇浓度86g/L。国外文献(DOI：10.1039/c5ee02940f，2015)报道了一种以玉米秸秆为原料，通过离子液体预处理，分批补料(物料装载量～30％)，同步糖化发酵技术，乙醇浓度41g/L。国内文献(DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2015.01.005，2015)报道了以棉花秸秆为原料，通过浓度为2.3％稀硫酸预处理，水解时间为55min，得到可发酵糖产量最高为11.81g/100g棉花秸秆。发明专利(CN101899479A，2010)公布了一种以农业废弃物为原料，通过稀酸高温蒸煮预处理、脱毒、脱色、离子交换、浓缩等工艺步骤，制备了高浓度糖液，用于木糖醇的生产。专利(CN103467532A，2013)公开了一种以玉米芯为原料，通过稀酸预处理和闪蒸喷爆的技术路线，制备木糖溶液。专利(CN102766703A，2012)公布了一种以甲酸，乙酸和卤素盐催化木质纤维素，制备高浓度糖液的方法，糖浓度高为90.0-130g/L。

可以看出，目前公开有关木质纤维素制备高浓度糖溶液的专利和文献，技术上往往存在工艺操作过程繁杂(包括预处理、水解、浓缩等工艺)、水解时外加催化剂(如稀酸或离子液体等)、反应条件苛刻(反应温度≥200℃)、发酵糖浓度低(葡萄糖最高浓度～130g/L)、装载量少(固载量≤30％)等不足。针对上述问题，本发明提供了一种原料固相辐照预处理，继而通过高物料一次水解和二次酶解糖化，可获得高浓度发酵木糖和葡萄糖溶液的方法。本发明整个水解过程，无需添加酸催化剂，绿色经济。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种辐照预处理木质纤维素，高物料水解糖化，制备高浓度可发酵糖溶液的方法。

为实现上述目的，本发明以木质纤维素为原料，经由辐照预处理，高物料水解和酶解糖化，制备高浓度C5和C6可发酵糖溶液。主要包括以下操作步骤：

1.木质纤维素切成大块(5-10cm)，以固相形式进行高能辐照预处理，破坏木质纤维素化学和物理结构，促进后续粉碎和水解糖化。

(2)辐照预处理后物料经粉碎后进行第一步水解糖化，在溶液中进行催化降解，水解液过滤得到富含木糖的高浓度发酵糖，发酵糖浓度为100g/L以上，固体残渣回收进行第二步酶解糖化；水解糖化温度为100-200℃，水解时间为0.5-2h；

(3)第二步酶解糖化，是将固体残渣用纤维素酶进一步水解，得到富含葡萄糖的高浓度发酵糖溶液；发酵糖溶液浓度达200g/L；纤维素酶用量为1-50mg酶蛋白/g纤维素；酶解糖化温度为40-60℃，酶解时间为24-96h。

其中，第一步水解糖化溶液是指纯水、水与有机溶剂混合物，含酸水溶液中的任何一种。

所述方法，其中，高浓度发酵糖溶液是指，生物质第一步水解糖化时，富含木糖的发酵总糖浓度可达128g/L，纤维残渣第二步酶解糖化时，富含葡萄糖的发酵总糖浓度可达257g/L。

所述方法，其中，木质纤维素包括林业废弃物、农业废弃物和工业废弃物等生物质。

所述方法，其中，辐照预处理射线种类包含γ-辐射、电子、等离子体等任何一种。

所述方法，其中，辐射剂量范围为100-2000kGy。

所述方法，其中的，木质纤维素辐照预处理后，以高物料比进行第一步水解糖化，水解体系包括去离子纯水、有机溶剂/水混合溶液、稀酸水溶液等中的任何一种。

所述方法，其中，第一步水解糖化时，物料浓度为15-50wt.％，水解糖化温度为100-190℃，水解时间为0.5-2h。

所述方法，其中，稀酸水溶液中，酸的种类为硫酸、盐酸、乙酸、甲酸、固体酸等中的任何一种，酸浓度为1-50mM。

所述方法，其中，有机溶剂/水混合体系中，有机溶剂包括乙醇、四氢呋喃、γ-戊内酯、二恶烷、乙腈、丙酮等中的任何一种，水与有机溶剂体积比为1:9-9:1。

所述方法，其中，高物料酶解糖化时，所用酶为纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶等中的一种或一种以上混合酶。

所述方法，其中，酶用量为1-50mg酶蛋白/g纤维素。酶解糖化温度为40-60℃，酶解时间为24-96h。

本发明的积极作用

相对于已报道文献和专利，本发明具有以下积极作用：

1.本发明中，木质纤维素辐照预处理后容易粉碎，所需能耗降低3倍以上，时间缩短2倍以上，粉碎颗粒粒径更小，在高物料条件下黏度较低，传质效果佳，适合物料高装载量的水解糖化，有利于降低操作成本。

2.本发明中，木质纤维素辐照预处理后产生的乙酰基酸位点，具有自催化降解特性，无需添加外来催化剂，在温和条件下，半纤维素水解转化率为99％，第一步水解后，总糖浓度为73-127g/L。

3.本发明中，纤维素固体残渣很容易被酶解，纤维素酶解率为90-99％，葡萄糖最高浓度为204.5g/L，总糖最高浓度为257g/L，是目前文献报道最高。

附图说明

图1木质纤维素辐照预处理后粉碎所需能耗、时间及其粒径大小。

图2芦苇辐照预处理后的粒径分布、黏度大小和自催化降解效果。

图3 X射线光电子能谱分析芦苇辐照预处理前后的O/C质量比和化学态。

图4芦苇辐照预处理后的水解糖化物料衡算。

图5一种以木质纤维素为原料制备高浓度发酵糖溶液的技术路线。

具体实施方式

结合以下具体实施例，进一步解释本发明，仅以5种不同木质纤维素为原料，采用⁶⁰Co-γ辐照预处理，通过一次水解和二次酶解，制备高浓度发酵木糖和葡萄糖为例，来说明本发明的具体实施方式，而非用于限定本发明的范围。

案例1：木质纤维素辐照预处理后，一次水解糖化制备高浓度还原糖溶液，主要实验步骤和结果如下：

1.自然干燥的木质纤维素原料，包含芦苇，玉米芯，甘蔗渣，松木，桉木切成5-10cm碎片，用60Co-γ辐照预处理，辐照剂量约为800kGy，每次处理原料2000g，处理时间20d，之后，用粉碎机(DFY-1000C,大德药机)粉碎过60目筛子，备用。

2.采用激光粒度分析仪(MASTERSIZER 2000,MALVERN)和旋转黏度计(HB DV-II,BROOKFIELD)测定原料碎粒径和高物料条件下的黏度，采用酸碱滴定法和X射线光电子能谱测定(ESCALAB 250,ThermoFisher Scientific)分析原料的化学结构变化。

3.从图1可以看出，与未处理木质纤维素相比，辐照预处理后原料，粉碎所需能耗降低了3-4倍，时间缩短了2-4倍，粉碎颗粒粒径更小。

4.从图2可以看出，辐照原料粉碎后，粒径集中于29.4μm，未处理原料粉碎后，粒径主要为117.0μm。辐照原料粉碎后，堆积密度增加了2倍，在物料浓度是未辐照原料2倍条件下，剪切黏度低10倍以上。

5.从表1和图3看出，辐照预处理后，原料发生了氧化，O/C质量浓度比增加了17％，原料中酸位点增加了2-5倍。

6.采用以下2种方法，进行高物料浓度的第一步水解糖化，制备高浓度还原糖溶液：

方法1：辐照预处理生物质以一定物料比与去离子水混合(见表2)，在500ml反应釜中，反应1小时，反应结束后，冷却至40℃以下，过滤，分别收集滤液和固体残渣，滤液即为富含木糖水溶液，用高效液相色谱(ALLTECH 1500)分析糖类组成及其含量。

方法2：辐照预处理生物质以一定的物料比与水/γ-戊内酯(GVL，体积比6:4)混合(见表2)，170℃条件下，在500ml反应釜中，反应1小时，反应结束后，通冷凝水将反应釜温度降到40℃以下，反应物用布氏漏斗过滤，得滤液和残渣。残渣用水洗后，60℃烘箱干燥48h，保藏备用。滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，静置分相，有机相用于回收γ-戊内酯(Sigma,V900552)，水相即为富含木糖水溶液，用高效液相色谱(ALLTECH 1500)分析糖类组成及其含量。

7.从表2可以看出，木质纤维素经过辐照预处理后，都很容易降解，秸秆类原料半纤维素转化率为96-99％，软硬木类半纤维素转化率～85％，总发酵糖溶液浓度为75-128g/L。

表1辐照对木质纤维素酸密度的影响。

表2辐照木质纤维素的第一步水解效果与还原糖浓度

案例2：纤维素残渣高物料二次酶解糖化，制备高浓度发酵糖溶液，主要实验步骤和结果如下：

1.案例1得到的纤维素固体残渣按表3中的物料浓度，与浓度50mM，pH5.0柠檬酸缓冲液(北京化工厂)混合，加入纤维素酶(Sigma,C9748)，加酶量为20mg酶蛋白/g纤维素，在200rpm，50℃摇床(IS-RDV1,CRYSTAL)中反应96小时，水解液10,000×g离心10分钟，上清液即为高葡萄糖浓度溶液，含量采用高效液相色谱测定。

2.从表3可以看出，经过案例1水解糖化后残渣，纤维素酶解效果显著，纤维素和半纤维素转化率为90-99％，总发酵糖浓度高为173-257g/L。

表3纤维素残渣的第二步酶解效果与还原糖浓度

案例3.以芦苇生物质为例，分析生物质辐照预处理后，第一步水解和第二步酶解糖化，纤维素和半纤维素降解的物料衡算，主要实验步骤和结果如下：

1.以辐照芦苇为原料，根据案例1和案例2实验数据，建立纤维素、半纤维素、C5和C6等物质的衡算模型。

2.如图4所示，1kg芦苇中含有373g葡聚糖和171g木聚糖，经过两步高物料糖化后，分别得到413g葡萄糖和可溶性低聚葡萄糖，181g木糖和可溶性低聚木糖。C6得率为理论值的99％，C5得率为理论值的93％。