本发明涉及一种多糖的制备方法，尤其涉及一种抗氧化作用好，，提高免疫力，抗衰老、清除自由基的羧甲基化多糖的制备方法。
背景技术：
多糖是一种免疫增强剂，它能增强动物的非特异性免疫功能，提高机体抗病能力，有抗衰老、防癌、抗癌、抗肝炎等作用，而且服用后机体无药残，近年来受到人们的普遍重视。
多糖的分子修饰是通过物理、化学及生物学等手段对其分子进行结构改造，以获得其它结构类型衍生物的方法。分子修饰可以通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、位置和数目等增强天然多糖的生物学活性或使多糖产生新的活性，有利于多糖类生物制剂在动物生产中的的开发与应用。常见的多糖分子修饰的方法有物理修饰法(如超声波降解、γ射线降解等)、化学修饰法(如硫酸酯化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化等)及生物修饰法(如基因工程修饰、酶法降解等)(王兆梅,李琳,郭祀远,胡松青.多糖结构修饰研究进展.中国医药工业杂志,2012,33(12):616-620)。多糖的分子修饰可能极大程度提高多糖的生物学功能，因此多糖的分子修饰已成为多糖构效关系研究的重要手段，也是发现和研制多糖类生物制剂的重要途径。
羧甲基化多糖是指多糖大分子链中单糖分子上的某一个或几个羟基被羧甲基基团取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效鲜明的阴离子多糖衍生物。有研究表明，许多原本不具有或仅有微弱抗病毒、抗肿瘤或抗氧化活性的多糖经过羧甲基化修饰后其抗病毒、抗肿瘤或抗氧化活性得到了显著提高。因此，多糖的羧甲基化修饰已经成为多糖分子修饰的一个重要方向，已成为人们关注的焦点。2011年，仰榴青，赵婷等申请的专利“一种羧甲基化黑木耳多糖、粗多糖及其制备方法和应用”(申请号：201110219047.3)，将水提醇沉所得黑木耳多糖与氯乙酸在碱溶液中反应得到羧甲基黑木耳多糖，并证明该多糖与未羧甲基化黑木耳多糖相比，对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除能力和溶解性得到显著的提高。2010年，吴广枫，李平兰等申请的专利“一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖及其制备方法”(申请号：201010248295.6)，利用双歧杆菌胞外多糖制备得到羧甲基化双歧杆菌胞外多糖，并证明该多糖能显著提高小鼠脾细胞中IL-2、IFNγ细胞因子水平，免疫调节力得到明显提高。
技术实现要素：
本发明的目的在于为了解决现有羧甲基化多糖制成的产品反应副产物多，的缺陷而提供一种抗氧化作用好，，提高免疫力，抗衰老、清除自由基的羧甲基化多糖的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种羧甲基化多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将100-120重量份的多糖溶于500-600份溶剂中，超声搅拌60-75min后加入溶剂体积一半的质量浓度为25-30％的氢氧化钠水溶液，继续超声搅拌80-85min后加入多糖质量20倍的氯乙酸，搅拌20min后升温至75℃恒温反应6h；然后降温至20℃，调节pH至7，加入溶剂体积4-6倍的无水乙醇，离心收集沉淀，放入透析袋中蒸馏水透析36h后取出，再分散在10倍质量的去离子水中，超声震荡30-60min后加入10-30重量份的海藻提取物与15-20重量份的油茶籽粕改性提取物，升温至100-130℃后保持75-90min，然后在50-65℃、0.06-0.08MPa下减压浓缩至原体积的60％，加入20-35重量份的蜂胶提取物，在6000-8000rpm下离心10min，最后收集沉淀物将沉淀物置于-30℃、50Pa的条件下冷冻干燥12-15h，得到羧甲基化多糖。在本技术方案中，蜂胶是工蜂采集长寿胶源植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的一种带有柔和香气的胶粘性物质，是蜜蜂用来修补巢房和内环境消毒杀菌以防护抵御病虫害和病原微生物入侵巢房的一种特殊物质。蜂胶中黄酮类化合物含量很高，是人体必须的营养素之一，体内不能合成，只能从饮食中摄取，因此蜂胶既是天然保健食品，又是天然抗生素，其具有强烈的广谱抗菌、抗氧化活性。
海藻提取物作为羧甲基化多糖与油茶籽粕改性提取物中的有效成分载体，并且海藻提取物的营养成分也是可以被人体吸收的。
作为优选，所述多糖为岩藻多糖、莱茵衣藻多糖或海地瓜多糖中的一种。
作为优选，所述溶剂为异丙醇。
作为优选，蜂胶提取物是通过二氧化碳超临界萃取制备而成的，具体步骤为：将蜂胶原料冷冻粉粹后，用超临界二氧化碳萃取，萃取塔压力为20-25MPa，萃取温度为65-75℃，萃取时间1-2h，夹带剂为萃取塔进料重量的20-25％的体积浓度为95％的乙醇溶液，分离塔压力10-15MPa，分离温度55-65℃，从分离塔出料得到蜂胶提取物。
作为优选，所述油茶籽粕改性提取物的制备方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比16-20mL/g将油茶籽粕添加到浓度为70-80wt％的乙醇溶液中并搅拌均匀，将乙醇溶液转移至微波提取器中进行加热提取，提取温度为60-70℃，提取时间为2-4min，微波功率为800-1000W；提取后得到粗提液，将粗提液过滤，取过滤液，向过滤液中添加过滤液体积0.02-0.04倍的30wt％双氧水溶液，在50-60℃下加热10-20min，在室温下静置10-20h，离心、过滤得到精提液，将精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；将油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得浓度为4-6wt％、pH为3-4的油茶籽粕提取物酸性溶液，在2-4h内向油茶籽粕提取物酸性溶液中匀速滴加质量为油茶籽粕提取物0.4-0.6倍的亚硒酸钠进行反应，反应温度为60-80℃；反应结束后经过浓缩、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。
作为优选，所述海藻提取物的制备方法如下：将切碎的海藻碎末与水混合，打浆后制得浓度为10-30wt％的海藻浆料；向海藻浆料中添加等体积的柠檬酸钠溶液，制得pH值为4-6的混合浆料，将混合浆料在60-80℃下提取2-4h，提取后过滤得到海藻粗提液，将海藻粗提液转移至高压灭菌锅内进行熟化灭菌；然后继续对海藻粗提液通过微滤膜去除大分子杂蛋白，最后冷冻干燥后制得海藻提取物。
作为优选，超声震荡的频率为65-75KHz。
本发明的有益效果是本发明的羧甲基化多糖具有调节免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗金属中毒、增强愈伤等作用，并提供了如黄酮类化合物、银杏黄酮等必须的营养物质，提高免疫力，抗衰老、清除自由基、清楚羟基自由基和超氧阴离子的能力，显示出良好的抗氧化活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种羧甲基化多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将100重量份的岩藻多糖溶于500份溶剂异丙醇中，超声搅拌60min后加入溶剂体积一半的质量浓度为25％的氢氧化钠水溶液，继续超声搅拌80min后加入多糖质量20倍的氯乙酸，搅拌20min后升温至75℃恒温反应6h；然后降温至20℃，调节pH至7，加入溶剂体积4倍的无水乙醇，离心收集沉淀，放入透析袋中蒸馏水透析36h后取出，再分散在10倍质量的去离子水中，超声震荡30min后加入10重量份的海藻提取物与15重量份的油茶籽粕改性提取物，升温至100℃后保持75min，然后在50℃、0.06MPa下减压浓缩至原体积的60％，加入20重量份的蜂胶提取物，在6000rpm下离心10min，最后收集沉淀物将沉淀物置于-30℃、50Pa的条件下冷冻干燥12h，得到羧甲基化多糖；其中，超声震荡的频率为65KHz；
蜂胶提取物是通过二氧化碳超临界萃取制备而成的，具体步骤为：将蜂胶原料冷冻粉粹后，用超临界二氧化碳萃取，萃取塔压力为20MPa，萃取温度为65℃，萃取时间1h，夹带剂为萃取塔进料重量的20％的体积浓度为95％的乙醇溶液，分离塔压力10MPa，分离温度55℃，从分离塔出料得到蜂胶提取物。
油茶籽粕改性提取物的制备方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比16mL/g将油茶籽粕添加到浓度为70wt％的乙醇溶液中并搅拌均匀，将乙醇溶液转移至微波提取器中进行加热提取，提取温度为60℃，提取时间为2min，微波功率为800W；提取后得到粗提液，将粗提液过滤，取过滤液，向过滤液中添加过滤液体积0.02倍的30wt％双氧水溶液，在50℃下加热10min，在室温下静置10h，离心、过滤得到精提液，将精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；将油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得浓度为4wt％、pH为3的油茶籽粕提取物酸性溶液，在2h内向油茶籽粕提取物酸性溶液中匀速滴加质量为油茶籽粕提取物0.4倍的亚硒酸钠进行反应，反应温度为60℃；反应结束后经过浓缩、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。
海藻提取物的制备方法如下：将切碎的海藻碎末与水混合，打浆后制得浓度为10wt％的海藻浆料；向海藻浆料中添加等体积的柠檬酸钠溶液，制得pH值为4的混合浆料，将混合浆料在60℃下提取2h，提取后过滤得到海藻粗提液，将海藻粗提液转移至高压灭菌锅内进行熟化灭菌；然后继续对海藻粗提液通过微滤膜去除大分子杂蛋白，最后冷冻干燥后制得海藻提取物。
实施例2
一种羧甲基化多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将110重量份的莱茵衣藻多糖溶于550份溶剂异丙醇中，超声搅拌65min后加入溶剂体积一半的质量浓度为28％的氢氧化钠水溶液，继续超声搅拌82min后加入多糖质量20倍的氯乙酸，搅拌20min后升温至75℃恒温反应6h；然后降温至20℃，调节pH至7，加入溶剂体积5倍的无水乙醇，离心收集沉淀，放入透析袋中蒸馏水透析36h后取出，再分散在10倍质量的去离子水中，超声震荡40min后加入20重量份的海藻提取物与18重量份的油茶籽粕改性提取物，升温至120℃后保持80min，然后在55℃、0.07MPa下减压浓缩至原体积的60％，加入25重量份的蜂胶提取物，在7000rpm下离心10min，最后收集沉淀物将沉淀物置于-30℃、50Pa的条件下冷冻干燥13h，得到羧甲基化多糖；其中，超声震荡的频率为70KHz；
蜂胶提取物是通过二氧化碳超临界萃取制备而成的，具体步骤为：将蜂胶原料冷冻粉粹后，用超临界二氧化碳萃取，萃取塔压力为22MPa，萃取温度为68℃，萃取时间1.5h，夹带剂为萃取塔进料重量的22％的体积浓度为95％的乙醇溶液，分离塔压力12MPa，分离温度60℃，从分离塔出料得到蜂胶提取物。
油茶籽粕改性提取物的制备方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比18mL/g将油茶籽粕添加到浓度为75wt％的乙醇溶液中并搅拌均匀，将乙醇溶液转移至微波提取器中进行加热提取，提取温度为65℃，提取时间为3min，微波功率为900W；提取后得到粗提液，将粗提液过滤，取过滤液，向过滤液中添加过滤液体积0.03倍的30wt％双氧水溶液，在55℃下加热15min，在室温下静置15h，离心、过滤得到精提液，将精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；将油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得浓度为5wt％、pH为3.4的油茶籽粕提取物酸性溶液，在3h内向油茶籽粕提取物酸性溶液中匀速滴加质量为油茶籽粕提取物0.5倍的亚硒酸钠进行反应，反应温度为70℃；反应结束后经过浓缩、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。
海藻提取物的制备方法如下：将切碎的海藻碎末与水混合，打浆后制得浓度为20wt％的海藻浆料；向海藻浆料中添加等体积的柠檬酸钠溶液，制得pH值为5的混合浆料，将混合浆料在70℃下提取3h，提取后过滤得到海藻粗提液，将海藻粗提液转移至高压灭菌锅内进行熟化灭菌；然后继续对海藻粗提液通过微滤膜去除大分子杂蛋白，最后冷冻干燥后制得海藻提取物。
实施例3
一种羧甲基化多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将120重量份的海地瓜多糖溶于600份溶剂异丙醇中，超声搅拌75min后加入溶剂体积一半的质量浓度为30％的氢氧化钠水溶液，继续超声搅拌85min后加入多糖质量20倍的氯乙酸，搅拌20min后升温至75℃恒温反应6h；然后降温至20℃，调节pH至7，加入溶剂体积6倍的无水乙醇，离心收集沉淀，放入透析袋中蒸馏水透析36h后取出，再分散在10倍质量的去离子水中，超声震荡60min后加入30重量份的海藻提取物与20重量份的油茶籽粕改性提取物，升温至130℃后保持90min，然后在65℃、0.08MPa下减压浓缩至原体积的60％，加入35重量份的蜂胶提取物，在8000rpm下离心10min，最后收集沉淀物将沉淀物置于-30℃、50Pa的条件下冷冻干燥15h，得到羧甲基化多糖；其中，超声震荡的频率为75KHz；
蜂胶提取物是通过二氧化碳超临界萃取制备而成的，具体步骤为：将蜂胶原料冷冻粉粹后，用超临界二氧化碳萃取，萃取塔压力为25MPa，萃取温度为75℃，萃取时间2h，夹带剂为萃取塔进料重量的25％的体积浓度为95％的乙醇溶液，分离塔压力15MPa，分离温度65℃，从分离塔出料得到蜂胶提取物。
油茶籽粕改性提取物的制备方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比20mL/g将油茶籽粕添加到浓度为80wt％的乙醇溶液中并搅拌均匀，将乙醇溶液转移至微波提取器中进行加热提取，提取温度为70℃，提取时间为4min，微波功率为1000W；提取后得到粗提液，将粗提液过滤，取过滤液，向过滤液中添加过滤液体积0.04倍的30wt％双氧水溶液，在60℃下加热20min，在室温下静置20h，离心、过滤得到精提液，将精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；将油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得浓度为6wt％、pH为4的油茶籽粕提取物酸性溶液，在4h内向油茶籽粕提取物酸性溶液中匀速滴加质量为油茶籽粕提取物0.6倍的亚硒酸钠进行反应，反应温度为80℃；反应结束后经过浓缩、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。
海藻提取物的制备方法如下：将切碎的海藻碎末与水混合，打浆后制得浓度为30wt％的海藻浆料；向海藻浆料中添加等体积的柠檬酸钠溶液，制得pH值为6的混合浆料，将混合浆料在80℃下提取4h，提取后过滤得到海藻粗提液，将海藻粗提液转移至高压灭菌锅内进行熟化灭菌；然后继续对海藻粗提液通过微滤膜去除大分子杂蛋白，最后冷冻干燥后制得海藻提取物。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。