本领域涉及天然产物深加工技术领域，尤其是涉及一种甲基纤维素和柠檬酸三钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
背景技术：
藻蓝蛋白(又称藻蓝素，简称pc)是从螺旋藻中分离出来的一种深蓝色粉末，色泽美观。它是一类稀有的光合作用色素蛋白，氨基酸组成齐全，是藻类中特有的捕光色素蛋白。pc具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤以及无毒副作用等优势，在食品保健、药物治疗、化妆品以及荧光探针方面具有广泛的应用。
藻蓝蛋白是一种天然蓝色色素，已作为食物色素添加在软饮料，双水相萃取是生物物质分离纯化中一种有效且有价值的方法，近年来得到了人们广泛的关注，已经应用于蛋白质、酶、天然物质等的纯化过程中，常用的是peg/无机盐体系。其体系含水量高、温和且无毒，可以有效地保证生物分子的活性。与其他分离方法(如离子交换层析、凝胶过滤层析等)相比，双水相萃取具有分离时间短、萃取效率高、污染少等优势。
目前，缺乏一种分离效果好的甲基纤维素和柠檬酸三钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种分离效果好，过滤分离回收率高的甲基纤维素和柠檬酸三钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的一种甲基纤维素和柠檬酸三钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻2-4次，洗涤干净的螺旋藻，经压力为210-420kg/cm2的高压细胞匀浆机，破碎时间为5-6min，超声波处理时间为12-14min，将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中，离心时间为10-18min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4-5℃下储存；
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入甲基纤维素和柠檬酸三钠，震荡混合时间为1-2h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；
(3)采用膜孔径为3-5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为20-26小时，再于-10--12℃冷冻干燥10-12小时，制得双水相萃取藻蓝蛋白。
进一步地，在步骤(1)中，所述离心速率为800-1000r/min。
进一步地，在步骤(2)中，所述甲基纤维素的质量为双水相体系总质量的9-13％。
更进一步地，在步骤(2)中，所述柠檬酸三钠为双水相体系总质量的16-25％。
进一步地，在步骤(2)中，含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的70-75％。
进一步地，在步骤(3)中，所述滤膜的流速为150ml/min，渗透通量为60l/(h·m2)。
有益效果：本发明分离效果好，体系粘度较低，分相所需时间短，节约了时间又减小了能耗。过滤分离回收率高，产品质量高，运行成本低；过程无需添加化学药品、溶媒溶剂，不带入二次污染物质；设备可自动运行，稳定性好，容易实现工业化需求。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明的双水相体系用于萃取螺旋藻细胞破碎液中藻蓝蛋白,经一次萃取藻蓝蛋白收率可达90.6％，分配系数达到8.03，分离因数达到6.5。结果证实螺旋藻藻蓝蛋白在该体系中的分配系数和分离因数均较高。
(2)多次双水相萃取有利于c-pc纯度提高，三次双水萃取后，c-pc纯度为3.92，回收率为87.7％。继续增加萃取的次数，纯度不断增加。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的一种甲基纤维素和柠檬酸三钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻2次，洗涤干净的螺旋藻，经压力为210kg/cm2的高压细胞匀浆机破碎5min,超声波处理时间为14min,将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中离心时间为15min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4℃下储存；所述搅拌转速为800r/min。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入甲基纤维素和柠檬酸三钠，彻底搅拌1h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；所述甲基纤维素的质量为双水相体系总质量的9％。柠檬酸三钠为双水相体系总质量的16％。含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的68％。
(3)采用膜孔径为3um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为20小时，再于-12℃冷冻干燥10小时得藻蓝蛋白粉末。
藻蓝蛋白溶液在280nm和620nm处有最大吸收波长，螺旋藻蛋白在280nm处有最大吸收峰，藻蓝蛋白在620nm处有最大吸收峰，冻融破壁后螺旋藻溶液中藻蓝蛋白纯度为0.4，其中螺旋藻杂蛋白含量较多。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种甲基纤维素和柠檬酸三钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻3次，洗涤干净的螺旋藻经压力为300kg/cm2的高压细胞匀浆机破碎5.5min,超声波处理时间为12min,将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中离心时间为10min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于5℃下储存；所述搅拌转速为900r/min。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入甲基纤维素和柠檬酸三钠，彻底搅拌2h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；所述甲基纤维素的质量为双水相体系总质量的10％。柠檬酸三钠为双水相体系总质量的21％。含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的70％。
(3)采用膜孔径为4um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为24小时，再于-11℃冷冻干燥11小时得藻蓝蛋白粉末。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种甲基纤维素和柠檬酸三钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻4次，洗涤干净的螺旋藻经压力为420kg/cm2的高压细胞匀浆机破碎6min，超声波处理时间为14min,将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中离心时间为18min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4.5℃下储存；所述搅拌转速为1000r/min。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入甲基纤维素和柠檬酸三钠，彻底搅拌1.5h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；所述甲基纤维素的质量为双水相体系总质量的13％。柠檬酸三钠为双水相体系总质量的25％。含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的65％。
(3)采用膜孔径为5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为26小时，再于-10℃冷冻干燥12小时得藻蓝蛋白粉末。所述滤膜的流速为150ml/min，渗透通量为60l/(h·m2)。
试验1
柠檬酸三钠质量分数对c－pc分配影响
柠檬酸三钠质量分数对c－pc分配影响如表1所示，
表1
由表1所示，当甲基纤维素的质量分数一定时，柠檬酸三钠质量分数为16％，ph值为6.2，室温条件下，当柠檬酸三钠低于某一用量时不能形成双水相体系，随着柠檬酸三钠质量分数增加，相比值逐渐减小，分配系数、纯度和回收率逐渐增大。当柠檬酸三钠质量分数为21％时，c－pc的分配系数、纯度和收率最高，然后逐渐减小。造成这种现象的原因可能是，柠檬酸三钠的质量分数增加，下相的盐析作用增加，使c－pc由下相向上相迁移。但柠檬酸三钠的质量分数过高时，下相盐析作用过强，破坏c－pc表面的水化层，c－pc被部分或全部析出。再者，在甲基纤维素的质量分数不变的情况下，随着柠檬酸三钠质量分数在一定范围内的提高，双水相体系逐渐远离临界点，物质在两相中界面张力增大，有利于藻蓝蛋白在上相富集，多糖在下相富集；当柠檬酸三钠质量分数更大时，上相体积逐渐减小，上相体积逐渐减小，同时粘度逐渐增大，不利于藻蓝蛋白的在上相的富集。c－pc的迁移能力受到限制，不利于c－pc的富集。
由表1所示，16％-21％柠檬酸三钠析得到的藻蓝蛋白纯度较低，21％-25％柠檬酸三钠析出藻蓝蛋白，藻蓝蛋白纯度逐渐增加，大于25％饱和度柠檬酸三钠盐析藻蓝蛋白纯度变化不大。确定：16％-25％之间的柠檬酸三钠饱和度可以用来除去大量螺旋藻杂蛋白，大于25％饱和度的柠檬酸三钠用于沉淀藻蓝蛋白和藻蓝蛋白的富集纯化。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。