本发明涉及一种能在黑曲霉，特别是无孢突变株黑曲霉中组成型高效表达CALB脂肪酶的重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA，以及该质粒转化无孢黑曲后获得的黑曲霉表面展示的固定化脂肪酶，以及该黑曲霉展示CALB全细胞催化剂催化乙醇和多种卵磷脂(PC)反应生产甘油磷脂酰胆碱(GPC)的反应体系。
背景技术：
脂肪酶，在酯化、水解、转酯、以及其它类型反应中都显示了较其它酶更为出色的催化性能。然而，游离脂肪酶对温度及有机溶剂的稳定性较差，反应产物分离困难，难以适应不同工业生产条件的需求。利用细胞表面展示技术，外源脂肪酶可借助于锚定在细胞壁的载体蛋白固定在黑曲霉细胞表面，类似酶的固定化，保持了脂肪酶相对独立的空间构象和原有的生物活性，表现出耐温、耐有机溶媒以及热稳定性好等优良特性。尽管脂肪酶在毕赤酵母细胞壁上的展示相当成功，但始终难于绕过毕赤酵母本身是甲醇型酵母，外源蛋白多是受有毒性的甲醇诱导的尴尬。黑曲霉表达异源蛋白具有胞外分泌率高、表达量大、蛋白具有天然活性和蛋白修饰模式接近高等真核生物等优点，被美国FDA和世界卫生组织认定为一般认为安全可靠无毒的(Generally regarded as safe，GRAS)菌种。脂肪酶在黑曲霉表面展示，可以在标准的发酵过程中实现酶在黑曲霉菌丝体表面的固定(展示)，不仅保留了固定化酶回收方便、可重复使用的优点，更省去了酶的分离纯化以及固定化等步骤。
目前关于在黑曲霉菌丝体表面展示脂肪酶的报道较少，申请人在2014年首次报道了采用黑曲霉内源性的葡糖淀粉酶启动子(Pgla)，该启动子多用于控制外源蛋白在黑曲酶中的分泌表达，但在高葡萄糖浓度条件下却表现出来较低的启动基因表达能力，因而外源蛋白积累过程中需要保持低的诱导糖浓度，这使得在工程菌发酵过程需要分成明显两阶段，第一阶段采用非诱导型糖实现长菌，第二阶段改用诱导型糖启动外源蛋白表达(Pan Z‐Y,Yang Z‐M,Pan L,Zheng S‐P,Han S‐Y,Lin Y.Displaying Candida antarctica lipase B on the cell surface of Aspergillus niger as a potential food‐grade whole‐cell catalyst.Journal of industrial microbiology&biotechnology 2014:1‐10)。除了分段诱导的缺陷外，诱导型表达的发酵工艺复杂、周期长，且低浓度碳源的限制性营养难以保证和维持黑曲霉工程菌良好的生长状态。对在菌丝体表 面展示脂肪酶的黑曲霉工程菌来讲，良好的生长以及菌丝体保持优良的形态是保证菌丝体表面展示高活力脂肪酶的前提。因而在黑曲霉菌丝体表面展示脂肪酶时，采用诱导型启动子，控制较低的诱导糖浓度下诱导产酶，与展示脂肪酶的黑曲霉细胞需要良好生长、维持菌体丝本身的形态、保持较高的菌体酶活存在天然的矛盾。组成型启动子pGpdA是来自3‐磷酸甘油醛脱氢酶的启动子，在工程菌整个发酵过程中均可持续表达相对稳定的蛋白量，不受外界诱导因素的影响。同时，实际生产过程中，使用组成型启动子GpdA能够做到黑曲霉工程菌边生长边产酶，有效避免了分段诱导操作的繁琐和难以控制，也有效避免了诱导型启动子时发酵后期因为菌丝体生长状态不佳而导致的大量酶活泄漏到上清中，菌体丝表面展示的脂肪酶活力低的问题。
同时，已有多种报道提到，诱导型启动子Pgla不仅受到高葡萄糖浓度的抑制，而且还被木糖等非葡糖类碳源抑制。组成型启动子使用后，有效拓展了黑曲霉表达体系使用碳源的种类，解除了葡萄糖、木糖等抑制，可实现以甘蔗渣等木质纤维素水解物为碳源发酵生产脂肪酶，具有巨大的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于避开甲醇利用型毕赤酵母工程菌生产食品的安全隐患，克服诱导型黑曲霉工程菌展示脂肪酶活力低、发酵阶段需要分段诱导的缺陷以及受葡萄糖、木糖多种抑制的缺点，提供一种低成本，易制备、易培养的组成型表达黑曲霉表面展示脂肪酶的重组质粒。
本发明的第二个目的是提供包含所述重组质粒的黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂。
本发明的第三个目的是提供所述黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂在甘油磷脂酰胆碱的催化合成中的应用。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种组成型表达黑曲霉表面展示脂肪酶的重组质粒，以黑曲霉表面展示载体pCALB-C为出发质粒，将诱导型启动子葡糖淀粉酶启动子Pgla替换为组成型启动子PgpdA；得到重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA；该重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA转化大肠杆菌，得到重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA；该重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA转化大肠杆菌，得到大肠杆菌(Escherrichia coli)DH5α携带质粒/pGpdA‐CALB‐CwpA；保藏号为GDMCC No.60024。保藏日期2016年3月24日；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：中国广州市先烈中路100号59号楼省微生物所实验楼5楼；邮编：510075。
包含所述重组质粒的黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂：重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA 转化黑曲霉原生质体，获得在黑曲霉表面展示脂肪酶CALB的工程菌AN‐GpdA‐CALB‐CwpA，该工程菌经发酵培养后，离心收集菌丝体并冷冻干燥后，获得黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂。
所述黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂在甘油磷脂酰胆碱的催化合成中的应用。
将卵磷脂和无水乙醇加入有机溶剂中，加入所述的黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂，在温度为45℃～65℃条件下反应1‐15h，得到甘油磷脂酰胆碱。
优选地，底物中卵磷脂浓度为4mg/mL‐20mg/mL，无水乙醇和中卵磷脂的摩尔比为4:1～20:1。
优选地，底物中水含量相对于卵磷脂和无水乙醇的总重量为10％～40％。
优选地，底物中催化剂含量为5mg/mL‐25mg/mL。
优选地，所述有机溶剂为叔丁醇、环己烷、正己烷和异辛烷中的一种或多种。
本发明黑曲霉固定化脂肪酶的制备：将携带来源于南极假丝酵母的脂肪酶B(CALB，GI:515791)与黑曲霉內源细胞壁蛋白CwpA(GI:51860184)融合基因的黑曲霉表面展示载体pCALB-C中，诱导型启动子葡糖淀粉酶(糖化酶)启动子Pgla替换为组成型启动子PgpdA(3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子，GI:1490227，1-1261bp)控制脂肪酶CALB基因表达，获得重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA。
重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA转化无孢突变株黑曲霉SH‐1后得到的工程菌AN‐GpdA‐CALB‐CwpA，该菌株具有不产孢子、菌丝粗短、发酵粘度小的特点。将重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA转化入无孢突变株黑曲霉SH‐1得到的组成型表达CALB的黑曲霉工程菌，该工程菌经发酵培养后，最大干重达到35g/L发酵液，菌体表面固定的CALB脂肪酶活力达到1100U/g干菌体。
本发明提供的重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA，携带了组成型启动子pGpdA以及CALB和黑曲霉内源蛋白的融合基因，在常规的发酵培养条件下，即可全程实现该脂肪酶在黑曲霉细胞表面的高效展示，有效的降低了固定化脂肪酶的生产成本，克服诱导型黑曲霉工程菌展示脂肪酶活力低、发酵阶段需要分段诱导的缺陷以及受葡萄糖、木糖多种抑制的缺点并且该固定化脂肪酶可用于甘油磷脂酰胆碱(GPC)的生产。
(1)组成型展示脂肪酶的重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA的构建
黑曲酶表达载体pUAGA为现有技术已经建立的已知载体(Pan Z‐Y,Yang Z‐M,Pan L,Zheng S‐P,Han S‐Y,Lin Y.Displaying Candida antarctica lipase B on the cell surface of Aspergillus niger as a potential food‐grade whole‐cell catalyst.Journal of industrial microbiology&biotechnology 2014:1‐10)。该载体是将来 源于Aspergillus.Nidulans(构巢曲霉)的丝状真菌显性筛选标记AMDS(编码乙酰胺酶的基因)、Aspergillus.Niger(黑曲霉)内源的强启动子Pgla(葡糖淀粉酶启动子)、Aspergillus oryzae(米曲霉)的终止子TagdA(α‐葡糖苷酶终止子)、pUC19上含有AMP(氨苄青霉素抗性基因)、Ori(复制子)等克隆载体基本元件的骨架片段进行连接，从头构建的可在黑曲霉细胞表达载体。将C端添加有FLAG标签的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB，GI:515791)与Aspergillus niger内源的GPI细胞壁锚定蛋白CwpA(GI:51860184)融合，连接到pUAGA载体的启动子Pgla和终止子TagdA之间，可获得基于CwpA的黑曲霉细胞表面展示脂肪酶的质粒pCALB‐C。本发明中，在pCALB‐CwpA的基础上，以黑曲霉SH‐1基因组为模板，设计gpdA1261F和gpdANEWR为引物进行PCR扩增，扩增出启动子pGpdA；以黑曲霉SH‐1基因组为模板，再设计ssGlaAF和ssGlaAR为引物进行PCR扩增，扩增出信号肽ssglaA；最后将pGpdA和ssglaA做融合PCR，扩增出pGpdA‐ssglA。将融合后的序列与Not1和Sal1双酶切后的质粒载体pCALB‐CwpA做连接，连接产物转化大肠杆菌后，提质粒得到新的组成型表达的重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA。
(2)提供菌丝体表面展示CALB的黑曲霉工程菌
首先制备无孢黑曲霉原生体并进行纯化，然后将水洗脱质粒用2×STC缓冲液等倍稀释一倍后；离心管加入160ml原生质体悬液，100μL质粒。120μlPEG混匀；冰上放置30min，再加入6mlPEG充分混匀，室温放置25min。取3mLSTC buffer和60ml Cscl加到上述转化液稀释，记为转化悬液。取1.5mL转化悬液加入乙酰胺蔗糖CD高渗软琼脂6ml，加到乙酰胺蔗糖CD高渗固体平板表面。轻轻转动平板使软琼脂在平板上展开，正置30℃培养8-14天，其中12-14天阳性率较高。将转化子单菌落挑至三丁酸甘油酯平板上，30℃培养18小时进行初筛，然后取水解圈直径与菌体直径比值大的发酵摇瓶复筛。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
1)本发明采用组成型驱动脂肪酶CALB在无孢黑曲霉中的表达，大幅度提高了黑曲霉表)面展示脂肪酶活力(1100U/g)，解除了诱导型驱动时存在的分阶段诱导，低浓度C源诱导以及多种单糖抑制作用；标准发酵过程结合冷冻干燥即可获得全细胞催化剂，相比游离酶或固定化酶省略了纯化分离的繁琐步骤，更具有固定化酶的优点，可以反复使用，操作稳定性强，且其符合食品级的安全要求。
2)本发明所得工程菌可有效利用木质纤维素水解物实现酶的生产，利用甘蔗渣水解物，发酵菌体酶活力可达到600U/g干菌体，生物量可以达到35g/L发酵液。
3)本发明采用卵磷脂和无水乙醇为原料，使用有机溶剂，在黑曲霉展示的南极假丝酵 母脂肪酶B全细胞催化剂的作用下发生转酯反应，得到甘油磷脂酰胆碱(GPC)产品；产物甘油磷脂酰胆碱(GPC)的含量达到47.57～94.48％。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1：携带重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA的大肠杆菌菌株的获得
重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA是在诱导型黑曲酶表达载体pCALB‐C上改造而成的。pCALB‐C由来源于Aspergillus.Nidulans(构巢曲霉)的丝状真菌显性筛选标记AMDS(编码乙酰胺酶的基因)、Aspergillus.Niger(黑曲霉)内源的强启动子Pgla(葡糖淀粉酶启动子)、Aspergillus oryzae(米曲霉)的终止子TagdA(α‐葡糖苷酶终止子)、来源于商用载体pUC19上的AMP(氨苄青霉素抗性基因)、Ori(复制子)等克隆载体基本元件，构成基本骨架，将C端添加有FLAG标签的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB，GI:515791，1029bp)与Aspergillus niger内源的GPI细胞壁锚定蛋白CwpA(GI:51860184)融合，连接到启动子Pgla和终止子TagdA之间，获得了基于CwpA锚定的黑曲霉细胞表面展示脂肪酶的质粒pCALB‐C。(Pan Z‐Y,Yang Z‐M,Pan L,Zheng S‐P,Han S‐Y,Lin Y.Displaying Candida antarctica lipase B on the cell surface of Aspergillus niger as a potential food‐grade whole‐cell catalyst.J ournal of industrial microbiology&biotechnology 2014:1‐10)。
本发明中，在pCALB‐C的基础上，以黑曲霉SH‐1基因组为模板，设计gpdA1261F(5’‐CAATAGACATCAGTAGCGGCCGCACAGAGGCCAGAGCATCACC‐3’))和gpdANEWR(5’‐AGATCGGAACGACATTGTTTAGATGTGTCTATGTGGCG‐3’)为引物进行PCR扩增，扩增出启动子pGpdA(3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子，GI:1490227，1-1261bp)；以黑曲霉SH‐1基因组为模板，再设计ssGlaAF(5’‐TAGACACATCTAAACAATGTCGTTCCGATCTCTACTCGC‐3’)和ssGlaAR(5’‐CACCAAAGGAGTGGCGTCGACGCGCTTGGAAATCACATTTGC‐3’)为引物进行PCR扩增，扩增出信号肽ssglaA；最后将pGpdA和ssglaA做融合PCR，扩增出pGpdA‐ssglA。pGpdA和ssglaA3的PCR反应模板都是SH‐1基因组，而融合PCR中加入pGpdA和ssglaA3的PCR的产物为模板。反应体系如下：模板1μL；2×KOD FX Buffer 25μL(含Mg2+)；2.5mmol/L dNTP 10μL；20μM mol/L的上下游引物各1.5μL；KOD FX聚合酶1μL，加无菌水至总体积为50μL。反应条件为:94℃变性5min后，98℃变性10s，60℃(pGpdA)或55℃(ssglaA)退火30S，68℃延伸1min20s(pGpdA)或20s(ssglaA)，共30个循环；第30个循环68℃延伸10min。将融合后的序列和用NotI和Sal I双酶切后的pCALB‐C载体连接，连接反应如下： 融合目的基因1200ng，纯化后的载体800ng，10X CloneEZ Buffer 2μL，CloneEZ Enzyme 2μL，添加无菌水到20μL。之后连接产物转化大肠杆菌用CaCl2转化法转入E.coli DH5α，在LB(含Amp 100mg/L)平板上涂板，过夜培养后挑选转化子，进行菌落PCR鉴定，最终获得了携带重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA的大肠杆菌工程菌，命名为：大肠杆菌(Escherrichia coli)DH5α携带质粒pGpdA‐CALB‐CwpA，保藏号为GDMCC No.60024，保藏时间：2016年3月24日；保藏地址：中国广州市先烈中路100号59号楼省微生物所实验楼5楼；邮编：510075。
实施例2：展示高活力脂肪酶的黑曲霉工程菌的构建、培养及鉴定
无孢黑曲霉SH‐1的‐80℃甘油管，37℃水浴快速解冻，取50μl解冻的菌液、接种到含有50ml黑曲霉CD培养基于250ml的三角瓶中。34℃恒温培养3‐4天。培养的过程中早晚各定时摇动三角瓶，直至瓶中长出大量的小菌丝球。将长好黑曲霉液体CD培养基移入100ml无菌离心管中，8000rpm离心5min，弃上清清，加入适量无菌生理盐水，反复吹吸混均匀，至OD为2.0，得到菌丝悬液。接种菌丝悬液200μl接种到装有100ml的YPD培养基的500ml三角摇瓶中。35℃的条件250rpm培养3天。抽滤并用0.8M Na Cl溶液洗涤菌体，抽滤好的菌体转移到原生质体酶解液中，30℃的条件下120rpm酶解1h后，开始通过血球计数板测量原生质体的浓度。每隔30min测定一次，直至原生质体的浓度达到3×106时停止酶解。用6层擦镜纸过滤收集原生质体，然后用20ml的0.8M NacRCl洗涤擦镜纸。然后在4℃的条件下600g离心原生质体10min，弃上清。用20ml的STC溶液重悬离心洗涤原生质体两次，离心条件为4℃的条件下900g离心原生质体10min。用600μL的STC重悬原生质体，得到原生质体转化悬液。
将实施例1构建好的带重组质粒pGpdA‐CALB‐CwpA转化无孢黑曲霉原生质体得到表面展示CALB的无孢黑曲霉AN‐GpdA‐CALB‐CwpA。在50mL的离心管中分别加入适量的无孢黑曲霉原生质体、PEG和质粒，用去尖枪头轻轻吹打混均匀，冰上放置30min。加入15ml PEG后盖上离心管盖上下颠倒使其充分混均匀，室温放置25min。按照如下的方法进行原生质体在高渗平板上的分散：
实验组：按照以上步骤转化后加入适量预热的含有1M乙酰胺的软琼脂培养基，轻轻的上下颠倒混均匀。然后将含有原生质体和DNA的软琼脂培养基均匀的倾倒在含有乙酰胺为唯一氮源的蔗糖高渗固体培养基上，34℃培养。
对照组：阴性对照用无菌超纯水代替PCR产物，按照实验组的过程转化。阳性对照用无菌超纯水代替PCR产物，转化用的软琼脂和蔗糖高渗CD中，唯一氮源为NaNO3。
脂肪酶可以分解三丁酸甘油酯从而在三丁酸甘油酯平板上形成水解圈，因此将转化子 涂布于三丁酸甘油酯平板进行初筛，只有转入了GpdA‐CALB‐CwpA质粒的转化子才可以表达出南极假丝酵母脂肪酶B。通过肉眼直接观察油脂平板上是否形成透明圈、以及透明圈直径和菌体直径的比值来判断该转化子是否表达脂肪酶，以及表达脂肪酶的活性高低。挑取透明圈比菌体直径比值大的转化子无孢黑曲霉AN‐GpdA‐CALB‐CwpA于玻璃管，接入1mL含有乙酰胺的液体CD培养基(乙酰胺蔗糖CD液体培养基(W/V)：蔗糖2％，KH2PO4 0.1％，FeSO4·7H2O 0.001％，MgSO4·7H2O 0.05％，KCl 0.2％，pH5.5，0.07％琼脂粉。115℃灭菌20min。灭菌后加入过滤除菌的1mL 1M乙酰胺)，34℃静置培养3‐4天，用均质机进行短暂均质，打散菌体，再将分散的菌体接种到含有50ml CD培养基于250ml的三角瓶中。30℃恒温培养3‐4天。培养的过程中早晚各定时摇动三角瓶，直至瓶中长出大量的小菌丝球。然后将10ml上述培养液接种于装有100ml乙酰胺蔗糖CD液体培养基的500ml摇瓶中，静置培养四天，每天震荡若干次。四天后，将菌液用8000rpm离心，用生理盐水洗涤2次后，全部接种到葡萄糖发酵培养基GAPY中(葡萄糖碳源发酵培养基(GAPY)：6％葡萄糖，1.5％(NH4)2SO4，0.75％peptone，1％yeast extract，0.84％KH2PO4，0.18％Na2HPO4·12H2O)，30℃，250rpm。第48小时取样后，采用捷贝斯公司生产的真菌DNA提取试剂盒(Hp ure Fungal DNA Kit)说明书提取样品基因组，再进行PCR鉴定，CALBF(5’CCGGAATTCCT GCCTTCCGGTTCGGAC 3’)和CALBR(5’AAATATGCGGCCGCTCAAGGGGTGACGATGCC 3’)为引物进行PCR扩增。体系为模板1μL；10×Taq DNA聚合酶buffer 5μL(含Mg2+)；2.5mmol/L dNTP 4μL；20μM mol/L的上下游引物各1μL；Taq DNA聚合酶0.75μL，加无菌水至总体积为50μL。反应条件为:94℃变性5min后，94℃变性45s，50℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。鉴定正确后，同样委托上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果与Genbank中提供的南极假丝酵母脂肪酶B(GI:515791，1029bp)序列完全一致。
实施例3黑曲霉菌丝体表面展示CALB脂肪酶活力检测
黑曲霉展示CALB全细胞催化的脂肪酶酶活力的测定方可采用吸光度法。葡萄糖发酵培养基摇瓶发酵48h后，以硝基苯酚丁酸酯为底物，在45℃与条pH＝8.0条件下，水解对硝基苯酚丁酸酯底物(C4底物)，用酶标仪测定405nm波长下的吸光值，再计算酶活力。酶活力单位定义：1U等于每分钟水解pNPB生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。测定步骤如下：
(1)无孢黑曲霉AN‐GpdA‐CALB‐CwpA发酵菌液14000rpm离心2min，弃去上清，加入等体积的Tris‐HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体，混匀，14000rpm离心2min，弃上清，重 复此操作两次，目的是洗涤菌体；
(2)将样品稀释一定倍数，取50μL稀释样品与900μL Tris‐HCl缓冲液(pH8.0)混合置于2.0mL离心管中，45℃，1400rpm振荡孵育5min；
(3)加入50μL 25mmol/L的pNPB底物溶液，45℃，1400rpm，振荡反应5min后10000rpm高速离心30s终止反应；
(4)快速量取200μL反应液于96孔板中，测定OD405；
(5)实验中以Tris‐HCl缓冲液(pH8.0)代替样品作为空白对照，样品的稀释倍数需经过预实验，使最后测定的OD405在酶标仪的量程内。
计算公式为：
酶活力U/ml＝(OD405‐ODblank)×M×K/T
酶活力U/g＝U/mL×1000/(W×OD595)
OD405：待测样品反应液吸光值；
ODblank：空白对照反应液吸光值；
M：酶液的总稀释倍数；
K：水解对硝基苯酚的标准曲线系数，数值上等于标准曲线方程x＝1时的y值(μmol/L)，本实验室测得该系数的值为0.12；
T：反应时间，5min；
W：1L发酵液1OD595对应的菌体干重(g/L)，本实验所用的系数值为0.33；
OD595：待测样品在595nm波长下的吸光值。
实施例2中无孢黑曲霉AN‐GpdA‐CALB‐CwpA经葡萄糖发酵培养基摇瓶发酵48h后采用上述方法，黑曲霉展示CALB酶活达到396U/g干菌体。72h后，黑曲霉展示CALB达到422U/g干菌体。
实施例4非葡萄糖类碳源对黑曲霉展示CALB工程菌产酶的影响
按照实施例2中进行无孢黑曲霉AN‐GpdA‐CALB‐CwpA菌种的扩大培养，100ml乙酰胺蔗糖CD液体培养基的500ml摇瓶静置培养4天后，将菌液用8000rpm离心，用生理盐水洗涤2次后，分别接种葡萄糖发酵培养基、木糖发酵培养基以及果糖发酵培养基。木糖和果糖的发酵培养基只需要将实施例2中的葡萄糖碳源发酵培养基(GAPY)中葡萄糖分别换成加入40％木糖母液(称取40g xylose，加水定容至100ml，121℃，20min灭菌)、果糖母液7.5ml(40g fructose，加水定容至100ml，121℃，20min灭菌)，至碳源终浓度为6％即可。上述各个培养基中，30℃，250rpm，发酵168小时，收菌丝体称细胞干重以及按照实施例 3的方法检测脂肪酶活力。结果表明，果糖的菌体干重为35g/L，明显高于木糖为碳源的菌体干重(22g/L)和葡萄糖为碳源的发酵(16g/L)。同时，木糖作为碳源，展示酶活可以达到1100U/g干菌体，产酶高峰点比另外葡萄糖和果糖组靠后，出现在144小时；使用葡萄糖作为碳源时，展示酶活达到450U/g干菌体左右。使用果糖为碳源，最高展示酶活达到470U/g干菌体，与葡萄糖基本持平，且都在发酵96小时达到最高。
实施例5纤维素水解物为碳源对黑曲霉展示CALB工程菌产酶的影响
首先使用碱法预处理甘蔗渣得到纤维素水解物。预处理采用4.5％氢氧化钠处理甘蔗渣，固液比1:25，80℃处理4小时，蒸馏水洗涤至中性。此后将预处理固形产物与柠檬酸‐柠檬酸钠(pH＝4.8)按照固液比1:20混合后，加入纤维素酶(20U/g底物)。48℃，反应80h。反应完全后，过滤后得到浓度为26.8g/L纤维素水解物。经过2h旋转蒸发，得到浓度为60g/L的水解物。121℃灭菌20min。将实施例2中葡萄糖碳源发酵培养基(GAPY)中葡萄糖换成纤维素水解糖作为无孢黑曲霉AN‐GpdA‐CALB‐CwpA的C源进行摇瓶发酵，发酵168h后，黑曲霉展示脂肪酶活力高达600U/g干菌体，生物量可以达到35g/L发酵液。
实施例6黑曲霉展示CALB全细胞催化剂冻干粉制备
实施例2的葡萄糖发酵培养基摇瓶发酵96h后得到的发酵液，或实施例5纤维素水解物发酵168h得到的发酵液经4℃、8000rpm/min下离心10min，弃去上清，收集细胞，用50mM Tris‐HCl buffer(pH8.0)洗三次，弃上清，加入2％海藻糖作为冻干保护剂，倒入玻璃皿后均匀铺开，在‐80℃下预冻2h，在ALPHA2‐4冻干机冻干12h后，放置于含有饱和LiCl溶液的密闭平衡皿中平衡水分2天即可得到黑曲霉展示CALB全细胞催化剂。
实施例7：利用卵磷脂(PC90)制备甘油磷脂酰胆碱(GPC)
甘油磷酸胆碱(Glycerophosphatidylcholine,GPC)是机体内磷脂代谢的产物之一，也是重要的神经传递介质乙酰胆碱(Acetylcholine)的生物合成前体。GPC可作食品、化妆品、药辅料的添加剂。
采用卵磷脂(PC90：磷脂的含量约为90％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号L105733‐25g，CAS号8002‐43‐5)和无水乙醇为原料，使用有机溶剂，在黑曲霉展示的南极假丝酵母脂肪酶B全细胞催化剂的作用下发生转酯反应，得到甘油磷脂酰胆碱(GPC)产品。
利用HPLC‐ELSD可分析PC或GPC浓度，分析条件为，Waters2695液相色谱；Waters2424蒸发光检测器；GRACE Si60硅胶柱，柱温为40℃，流速1ml/min，流动相A为甲醇，流动相B为水，混合比例为85/15，进样量10μL。首先绘制PC和GPC的标准曲线，PC标准品 用乙醇溶解充分，GPC标准品用甲醇溶解充分，然后均用甲醇稀释成0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL，经HPLC‐ELSD检测，以峰面积的对数值对PC/GPC浓度对数值绘制标准曲线(LogA＝k(LogC)+b，R2>0.99，A:PC或者GPC标准品的峰面积，C：PC或者GPC标准品的浓度)。本实验得到
PC浓度与峰面积的对应关系为：
LogA1＝1.8119(LogC1)+8.3772 R2＝0.9963
A1：样品的PC峰面积，C1：样品汇总PC浓度。
GPC浓度与封面积的对应关系为：
LogA2＝1.74(LogC2)+8.0353 R2＝0.9994
A2：样品的GPC峰面积，C2：样品中GPC的浓度。
催化反应操作如下：取约2mL底物(其中卵磷脂24mg，无水乙醇12.2μL，异辛烷2mL，醇脂摩尔比为7:1)混合物于10mL具塞三角瓶中，然后加入13.6μL蒸馏水，50mg(约1.2U)黑曲霉工程菌菌体冻干粉(实施例6所得)，反应温度60℃，然后于200rpm下振荡且避光反应，反应12h，反应完成后用叔丁醇和甲醇(叔丁醇：甲醇＝4:3，体积比)的混合溶剂溶解产物，然后上HPLC‐ELSD分析，最终PC的转化率能达到98.2％，GPC的产率能达到91.6％以上。
在上述条件下反应且溶解产物后，离心回收菌体，经溶剂叔丁醇洗涤，减压浓缩得到干粉状菌体，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化转酯反应，经过9批次的连续使用，黑曲霉展示的CALB仍然在每批次中使卵磷脂的转化率保持在96％以上。
实施例8：液体磷脂PC25制备甘油磷脂酰胆碱(GPC)中试
采用浓缩磷脂PC25(大豆来源液体磷脂磷脂的含量约为25％，广州海莎生物科技有限公司，)和无水乙醇为原料，使用有机溶剂(可以是叔丁醇、环己烷、正己烷或异辛烷，本实施例使用环己烷)，在黑曲霉展示的南极假丝酵母脂肪酶B的作用下发生转酯反应，得到甘油磷脂酰胆碱(GPC)产品。
底物浓度(12mg/mL)反应体系：180g浓缩磷脂PC25，15L异辛烷，102mL蒸馏水，168.75mL无水乙醇，375g脂肪酶AN‐CALB，于65℃，500r/min的溶剂为30L的恒温反应罐中反应。反应9h，取样经HPLC‐ELSD(实施例7)分析，PC转化率为5h，PC转化率为96.56％，GPC产率为90.51％。
本发明提供了一种新形式的固定化酶‐‐‐‐黑曲霉展示脂肪酶CALB全细胞催化剂，主要 有以下优势：1)工程菌中脂肪酶的的表达改用了组成型启动子驱动，解除了木糖，葡萄糖抑制。本发明采用木糖作为碳源，展示酶活可以达到1100U/g干菌体，而现有报道，黑曲霉展示酶活仅为400U/g干菌体(Pan Z‐Y,Yang Z‐M,Pan L,Zheng S‐P,Han S‐Y,Lin Y.Displaying Candida antarctica lipase B on the cell surface of Aspergillus niger as a potential food‐grade whole‐cell catalyst.Journal of industrial microbiology&biotechnology 2014:1‐10)；2)实现了以纤维素水解物为C源作为碳源可以代替葡萄糖和木糖等碳源生产黑曲霉宿主的外源脂肪酶，为首次报道；3)全细胞高催化性能，12h内，PC的转化率达到90％以上；4)类似于固定化酶，不溶于水且易于回收使用，操作稳定性强(可反复使用9次以上，卵磷脂的转化率保持在96％以上)；在标准的发酵过程中，脂肪酶分子就固定在了黑曲霉菌丝体上，离心或过滤收集到的菌丝体经简单冻干或喷雾干燥即可得到固定化酶。而现有技术制备游离酶(可溶)或固定化酶(不可溶)时，蛋白的分离、纯化必不可少，并且游离酶要经过专门的包埋、吸附等固定化步骤才能得到固定化形式的酶，因而本发明提供的新型固定化酶大大降低了固定化酶的制备成本和周期。5)黑曲霉属于美国FDA提出的GRAS(Generally regarded as safe)菌种，符合日益增加的食品安全需求要求。