本发明涉及植物甾醇的生产制备领域，具体涉及一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法。
背景技术：
豆甾醇(stigmaster01)，C29H450。分子量为412，又称豆甾一5，22一二烯一3B一醇或24R一乙基胆甾一5，22一二烯一3 B一醇,是一种植物甾醇，广泛存在于多种植物中。豆甾醇具有显著的抗氧化、抗肿瘤、抗心血管病等多种药理活性，也是合成甾类药物的起始原料，在医药、食品和化工等行业均有应用。近年来，随着新甾体药物的发现、生产的发展、生产规模的扩大、原料需要量也逐渐增加；另一方面由于不合理的采掘，造成资源短缺，植物中皂甙含量下降，使国际市场供需出现矛盾，如何获得更多更高纯度的豆甾醇是豆甾醇研究的一个重要方向。
薏苡(Coix lachryma－jobi L．)为禾本科(Gramineae)薏苡属，味甘淡，性微寒，具有健脾、补肺、清热、利湿的功效，素有“滋补保健之王”的美誉。目前对薏苡的化学成分研究比较少，且较多集中在薏苡仁，其药理活性研究方面的文献报道也不多，生物活性作用物质基础不明确，导致其在临床上的应用受到局限。研究证明薏苡茎含有甾体、多糖、黄酮、有机酸、鞘质、三萜等化学成分，因此研究如何从薏苡中提取豆甾醇能够更加充分利用薏苡资源。
公开号为CN1374319A的中国专利公开了一种从混合植物甾醇中提取豆甾醇的方法，该方法用溶剂法富集豆甾醇，主要工序包括水浴溶解、降温养晶、保温抽滤，其溶剂采用正庚烷与二氯乙烷混合溶剂，正庚烷：二氯乙烷=l﹕1～2，l﹕1．5～1．8最佳。其中混合植物甾醇与溶剂的质量体积比(m／V)为l﹕3～5，1﹕3．5～4．5最佳。水浴溶解温度为70～75℃。水浴降温降至20～25℃，保持恒温养晶12～24小时。每次结束后，将上一次的提取物按同样工艺进行下一次重结晶，重复2—6次，重复次数决定提取豆甾醇的含量。滤液经低温处理，温度为-10℃，回收甾醇和溶剂。该方法溶剂耗量大，生产废料多，能量消耗大，甾醇得率低。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法，本发明的方法能够保持产品的天然特性，工艺步骤少，操作条件温和，溶剂毒性低，生产工艺安全，提取效率高，产品纯度高达99%。
本发明通过以下技术方案实现：
一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：将薏苡茎放入粉碎机中粉碎得薏苡茎粗粉，在薏苡茎粗粉中加入纤维素酶和果胶酶，然后溶于粗粉重量1～3倍的水，在30～50℃下酶解5～8h，过滤，干燥，得到酶解薏苡茎粉；
（2）超声波提取：将酶解薏苡茎粉和无水乙醇加入超声波设备中进行超声波提取，过滤，得提取液，将提取液放入旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得浸膏A；
（3）皂化：将浸膏A溶于10～50wt％的氢氧化钠的乙醇溶液中，充分搅拌，在40～70℃下皂化1～3h，反应液用盐酸中和至中性，然后用饱和食盐水和石油醚萃取，弃去水相，石油醚相用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得浸膏B；
（4）尿素柱层析：将尿素溶于负载溶剂中，然后加入硅胶，使尿素负载在硅胶上，除去负载溶剂，制得固定相；将固定相装柱，然后将浸膏B上柱，用洗脱剂注入层析柱进行洗脱至无豆甾醇流出，收集洗脱液，通过薄层层析跟踪检测，合并与豆甾醇标准品Rf值相同的洗脱液，浓缩得豆甾醇粗品；
（5）结晶：将豆甾醇粗品溶于甲醇中，结晶，过滤，得到豆甾醇纯品。
优选地，以上所述纤维素酶和果胶酶加入的重量为薏苡茎粗粉重量的0.1～1%，纤维素酶和果胶酶以任意比例混合。
优选地，以上所述酶解薏苡茎粉和无水乙醇的料液比1:10～15。
优选地，以上所述多频超声波提取为双频或三频超声波提取，采用双频超声波提取时，两种超声波的频率为20～40kHz和20～60kHz，功率为50～200W、100～500W，提取时间为20～40min；采用三频超声波提取时，三种超声波的频率为20～40kHz、20～60kHz、500～1000kHz，功率为50～200W、100～500W、500～2000W，提取时间为10～25min。
优选地，以上所述10～50wt％的氢氧化钠的乙醇溶液与浸膏A的料液比为3～10:1。
优选地，以上所述负载溶剂为无水乙醇或75～95%的乙醇-水溶液。
优选地，以上所述尿素和硅胶的质量比为1～10:3。
优选地，以上所述洗脱剂为体积比为10:1～2:1的苯-乙酸乙酯溶液。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
1、本发明在薏苡茎粗粉中加入果胶酶和纤维素酶进行酶解，能够破坏薏苡茎的细胞壁，使豆甾醇更容易被提出出来，过滤后，还能除去部分多糖等水溶性杂质，提高了豆甾醇的提取率。
2、本发明采用多频超声波提取，能显著缩短提取时间，减少溶剂用量，提高提取得率，且得到的提取液质量好，易精制。
3、本发明采用尿素柱层析进行分离纯化，操作简单，成本低，尿素层析柱可以重复利用。
4、本发明的方法能够保持产品的天然特性，工艺步骤少，操作条件温和，溶剂毒性低，生产工艺安全，提取效率高，产品纯度高达99%。
5、本发明利用农业废弃物薏苡茎作为原料提取豆甾醇，能够减少农业废弃物的排放，增加薏苡植物的利用率，提高农民收入，保护生态环境。
具体实施方式
实施例1
一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：将薏苡茎放入粉碎机中粉碎得薏苡茎粗粉，在薏苡茎粗粉中加入纤维素酶和果胶酶，然后溶于粗粉重量1倍的水，在50℃下酶解8h，过滤，干燥，得到酶解薏苡茎粉；其中纤维素酶和果胶酶加入的重量为薏苡茎粗粉重量的0.1%，纤维素酶和果胶酶的重量比为2:1；
（2）超声波提取：将酶解薏苡茎粉和无水乙醇加入超声波设备中进行双超声波提取，酶解薏苡茎粉和无水乙醇的料液比1:10，两种超声波的频率为20kHz和40kHz，功率为50W、100W，提取时间为20min；过滤，得提取液，将提取液放入旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得浸膏A；
（3）皂化：将浸膏A溶于10wt％的氢氧化钠的乙醇溶液中，10wt％的氢氧化钠的乙醇溶液与浸膏A的料液比为3:1，充分搅拌，在40～50℃下皂化1h，反应液用盐酸中和至中性，然后用饱和食盐水和石油醚萃取，弃去水相，石油醚相用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得浸膏B；
（4）尿素柱层析：将尿素溶于无水乙醇中，然后加入硅胶，使尿素负载在硅胶上，尿素和硅胶的质量比为1:3，除去无水乙醇，制得固定相；将固定相装柱，然后将浸膏B上柱，用体积比为10:1的苯-乙酸乙酯溶液注入层析柱进行洗脱至无豆甾醇流出，收集洗脱液，通过薄层层析跟踪检测，合并与豆甾醇标准品Rf值相同的洗脱液，浓缩得豆甾醇粗品；
（5）结晶：将豆甾醇粗品溶于甲醇中，结晶，过滤，得到豆甾醇纯品。
本实施例得到的豆甾醇纯品采用HPLC检测，纯度为99.0%。
实施例2
一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：将薏苡茎放入粉碎机中粉碎得薏苡茎粗粉，在薏苡茎粗粉中加入纤维素酶和果胶酶，然后溶于粗粉重量3倍的水，在30℃下酶解5h，过滤，干燥，得到酶解薏苡茎粉；其中纤维素酶和果胶酶加入的重量为薏苡茎粗粉重量的1%，纤维素酶和果胶酶的重量比为2:1；
（2）超声波提取：将酶解薏苡茎粉和无水乙醇加入超声波设备中进行三频超声波提取，酶解薏苡茎粉和无水乙醇的料液比1:15，三种超声波的频率为40kHz、60kHz、1000kHz，功率为200W、500W、2000W，提取时间为10min；过滤，得提取液，将提取液放入旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得浸膏A；
（3）皂化：将浸膏A溶于50wt％的氢氧化钠的乙醇溶液中，50wt％的氢氧化钠的乙醇溶液与浸膏A的料液比为10:1，充分搅拌，在50～70℃下皂化3h，反应液用盐酸中和至中性，然后用饱和食盐水和石油醚萃取，弃去水相，石油醚相用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得浸膏B；
（4）尿素柱层析：将尿素溶于75%的乙醇-水溶液中，然后加入硅胶，使尿素负载在硅胶上，尿素和硅胶的质量比为10:3，除去75%的乙醇-水溶液，制得固定相；将固定相装柱，然后将浸膏B上柱，用体积比为2:1的苯-乙酸乙酯溶液注入层析柱进行洗脱至无豆甾醇流出，收集洗脱液，通过薄层层析跟踪检测，合并与豆甾醇标准品Rf值相同的洗脱液，浓缩得豆甾醇粗品；
（5）结晶：将豆甾醇粗品溶于甲醇中，结晶，过滤，得到豆甾醇纯品。
本实施例得到的豆甾醇纯品采用HPLC检测，纯度为99.2%。
实施例3
一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：将薏苡茎放入粉碎机中粉碎得薏苡茎粗粉，在薏苡茎粗粉中加入纤维素酶和果胶酶，然后溶于粗粉重量2倍的水，在40℃下酶解6h，过滤，干燥，得到酶解薏苡茎粉；其中纤维素酶和果胶酶加入的重量为薏苡茎粗粉重量的0.5%，纤维素酶和果胶酶的重量比为1:1；
（2）超声波提取：将酶解薏苡茎粉和无水乙醇加入超声波设备中进行双频超声波提取，酶解薏苡茎粉和无水乙醇的料液比1:12，两种超声波的频率为35kHz和55kHz，功率为100W、200W，提取时间为30min；过滤，得提取液，将提取液放入旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得浸膏A；
（3）皂化：将浸膏A溶于30wt％的氢氧化钠的乙醇溶液中，30wt％的氢氧化钠的乙醇溶液与浸膏A的料液比为6:1，充分搅拌，在50～60℃下皂化2h，反应液用盐酸中和至中性，然后用饱和食盐水和石油醚萃取，弃去水相，石油醚相用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得浸膏B；
（4）尿素柱层析：将尿素溶于95%的乙醇-水溶液中，然后加入硅胶，使尿素负载在硅胶上，尿素和硅胶的质量比为5:3，除去95%的乙醇-水溶液，制得固定相；将固定相装柱，然后将浸膏B上柱，用体积比为5:1的苯-乙酸乙酯溶液注入层析柱进行洗脱至无豆甾醇流出，收集洗脱液，通过薄层层析跟踪检测，合并与豆甾醇标准品Rf值相同的洗脱液，浓缩得豆甾醇粗品；
（5）结晶：将豆甾醇粗品溶于甲醇中，结晶，过滤，得到豆甾醇纯品。
本实施例得到的豆甾醇纯品采用HPLC检测，纯度为99.1%。
实施例4
一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：将薏苡茎放入粉碎机中粉碎得薏苡茎粗粉，在薏苡茎粗粉中加入纤维素酶和果胶酶，然后溶于粗粉重量2倍的水，在50℃下酶解6h，过滤，干燥，得到酶解薏苡茎粉；其中纤维素酶和果胶酶加入的重量为薏苡茎粗粉重量的0.8%，纤维素酶和果胶酶的重量比为1:3；
（2）超声波提取：将酶解薏苡茎粉和无水乙醇加入超声波设备中进行三频超声波提取，酶解薏苡茎粉和无水乙醇的料液比1:12，三种超声波的频率为20kHz、40kHz、500kHz，功率为50、100W、500W，提取时间为25min。过滤，得提取液，将提取液放入旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得浸膏A；
（3）皂化：将浸膏A溶于20wt％的氢氧化钠的乙醇溶液中，20wt％的氢氧化钠的乙醇溶液与浸膏A的料液比为6:1，充分搅拌，在50～60℃下皂化1h，反应液用盐酸中和至中性，然后用饱和食盐水和石油醚萃取，弃去水相，石油醚相用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得浸膏B；
（4）尿素柱层析：将尿素溶于80%的乙醇-水溶液，然后加入硅胶，使尿素负载在硅胶上，尿素和硅胶的质量比为6:3，除去80%的乙醇-水溶液，制得固定相；将固定相装柱，然后将浸膏B上柱，用体积比为3:1的苯-乙酸乙酯溶液注入层析柱进行洗脱至无豆甾醇流出，收集洗脱液，通过薄层层析跟踪检测，合并与豆甾醇标准品Rf值相同的洗脱液，浓缩得豆甾醇粗品；
（5）结晶：将豆甾醇粗品溶于甲醇中，结晶，过滤，得到豆甾醇纯品。
本实施例得到的豆甾醇纯品采用HPLC检测，纯度为99.2%。
实施例5
一种从薏苡茎中提取豆甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：将薏苡茎放入粉碎机中粉碎得薏苡茎粗粉，在薏苡茎粗粉中加入纤维素酶和果胶酶，然后溶于粗粉重量3倍的水，在40℃下酶解8h，过滤，干燥，得到酶解薏苡茎粉；其中纤维素酶和果胶酶加入的重量为薏苡茎粗粉重量的0.6%，纤维素酶和果胶酶的重量比为1:1；
（2）超声波提取：将酶解薏苡茎粉和无水乙醇加入超声波设备中进行双频超声波提取，酶解薏苡茎粉和无水乙醇的料液比1:12，两种超声波的频率为40kHz和20kHz，功率为200W、500W，提取时间为25min；过滤，得提取液，将提取液放入旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得浸膏A；
（3）皂化：将浸膏A溶于20wt％的氢氧化钠的乙醇溶液中，20wt％的氢氧化钠的乙醇溶液与浸膏A的料液比为8:1，充分搅拌，在50～60℃下皂化2h，反应液用盐酸中和至中性，然后用饱和食盐水和石油醚萃取，弃去水相，石油醚相用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得浸膏B；
（4）尿素柱层析：将尿素溶于无水乙醇中，然后加入硅胶，使尿素负载在硅胶上，尿素和硅胶的质量比为5:3，除去无水乙醇，制得固定相；将固定相装柱，然后将浸膏B上柱，用体积比为5:1的苯-乙酸乙酯溶液注入层析柱进行洗脱至无豆甾醇流出，收集洗脱液，通过薄层层析跟踪检测，合并与豆甾醇标准品Rf值相同的洗脱液，浓缩得豆甾醇粗品；
（5）结晶：将豆甾醇粗品溶于甲醇中，结晶，过滤，得到豆甾醇纯品。
本实施例得到的豆甾醇纯品采用HPLC检测，纯度为99.3%。