活化的人凝血因子VII融合蛋白及其制备方法与用途与流程

文档序号:12342466阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种活化的人凝血因子VII的融合蛋白,所述融合蛋白从N端至C端依次包含活化的人凝血因子VII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(如,免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG,优选人IgG Fc变体)。

2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白是糖基化的,优选是通过在哺乳动物细胞(如,中国仓鼠卵巢细胞)中表达而糖基化的。

3.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述人凝血因子VII包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或者所述人凝血因子VII的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少90%的同一性。

4.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述柔性肽接头含有2个或多个选自G、S、A和T残基的氨基酸,

优选地,所述柔性肽接头具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式,其中a,b,c和d是大于或等于0的整数,且a+b+c+d≥1,更优选地,所述柔性肽接头优选自下组:

(i)GSGGGSGGGGSGGGGS;

(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;

(iii)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;

(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;

(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。

5.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其截短的序列,其中所述截短的序列包含至少2个糖基化位点,

优选地,所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含以下氨基酸序列:

(i)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ;

(ii)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ;

(iii)SSSSKAPPPS;

(iv)SRLPGPSDTPILPQ。

6.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元与权利要求5所述融合蛋白中的CTP氨基酸序列至少具有70%,80%,90%或95%的同一性。

7.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包含1、2、3、4或5个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元。

8.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述人IgG Fc变体具有降低的ADCC效应和/或CDC效应,和/或与FcRn受体的结合亲和力增强,

优选地,所述Fc变体选自:

(i)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域;

(ii)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域;

(iii)含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域;

(iv)含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域;

(v)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。

9.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

10.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白的活性>15000IU/mg,和/或,所述融合蛋白在动物体内循环半衰期至少延长1倍。

11.编码如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的DNA,优选所述DNA的序列如SEQ ID NO:17所示。

12.一种载体,其特征在于,包含如权利要求11所述的DNA。

13.一种宿主细胞,其特征在于,包含如权利要求12所述的载体,或者转染了权利要求12所述的载体。

14.一种药物组合物,其特征在于,包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂,以及有效剂量的如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白。

15.一种制备如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的方法,所述方法包括:

(a)将根据权利要求11所述编码融合蛋白的DNA引入CHO细胞,生成CHO衍生的细胞系;

(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内,表达超过3μg/106(百万)个细胞的高产细胞株;

(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株,表达融合蛋白;

(d)收获步骤(c)中得到的发酵液,纯化融合蛋白;

(e)激活步骤(d)中纯化的融合蛋白。

16.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述步骤(d)中融合蛋白纯化过程包含Protein A亲和层析(优选包括使用Mabselect层析介质)、多维模式层析(优选包括使用CHT陶瓷羟磷灰石II型层析介质)、阴离子交换层析(优选包括使用Q Sepharose High Performance层析介质)和分子筛层析(优选包括使用Superdex 200层析介质)。

17.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述方法步骤(e)中激活步骤采用凝血因子XII激活、柱上自激活或溶液自激活。

18.一种如权利要求1-10中任一项所述融合蛋白在制备预防或治疗血性疾病的药物(例如,用于产生FVIII抗体的A型血友病患者或产生FIX抗体的B型血友病患者的自发性出血、手术中或手术后出血的治疗或预防、先天性或后天获得性FVII缺乏症患者的出血性疾病的预防或治疗、和/或血小板机能不全患者的治疗的药物)中应用。

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