Exendin-4类似物融合蛋白及其制备方法和用途与流程

本发明涉及Exendin-4类似物，更具体地，涉及一种重组Exendin-4类似物与人IgG2Fc变体组成的融合蛋白及其制备方法，还涉及其在治疗糖尿病、肥胖以及通过降低血浆葡萄糖、抑制胃和/或肠运动和抑制胃和/或肠排空、或抑制食物摄入而受益的其他疾病的应用。

背景技术：

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)又称促胰岛素激素，是一种主要由肠粘膜L细胞分泌的多肽类激素。GLP-1具有调节葡萄糖代谢和胃肠分泌功能，它能有效刺激胰岛β-细胞葡萄糖依赖的分泌胰岛素，促进胰岛素基因转录、胰岛细胞增殖及β-细胞增殖和再生，具有不依赖于胰岛素的独立降糖作用，从而延缓糖尿病进展。同时还可抑制胃排空、降低食欲，在不会引起显著临床低血糖反应的条件下减轻体重，从而保证了其用于糖尿病治疗的安全性和有效性。人体内具有生物活性的GLP-1主要是GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)两种。天然GLP-1可被二肽基肽酶IV(DPP-IV)迅速水解而失活，且分子量小，易被肾小球滤过而清除，使得它的体内循环半衰期不足5分钟，不具有临床使用价值。

Exendin-4是美国西南部大毒蜥唾液中分泌的一种含有39个氨基酸的多肽。Exendin-4是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，与哺乳动物的GLP-1氨基酸序列具有53％同源性，是有效的GLP-1受体激动剂。Exendin-4的这些生理活性与人GLP-1相似，但人GLP-1在体内迅速被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，半衰期只有1-2分钟，会很快被清除，而Exendin-4其N端第二位由Gly代替了GLP-1中的Ala，对DPP-IV清除具有相当抵抗作用，不易被DPP-IV降解，在体内循环半衰期较长，达到60-90分钟。此外，源于Exendin-4的COOH端由9个氨基酸(PSSGAPPPS)形成特殊Trp-cage结构，使其与GLP-1受体的结合亲和力显著高于人GLP-1(Neidigh JW等,Biochemistry,2001,40:13188–13200)。另外，Exendin-4与人GLP-1代谢途径也不尽相同，Exendin-4主要通过肾脏代谢，而人GLP-1通 过外周组织和肾脏进行代谢，且外周组织途径是主要方式(Simonsen L等,2013,Regulatory Peptides,181:17–21)，因而Exendin-4代谢速率更小，这也是其半衰期显著长于天然人GLP-1的重要原因。

Exendin-4化学合成品命名为Exenatide(商品名Byetta，中文名艾塞那肽)，于2005年4月获美国FDA批准。临床结果显示，艾塞那肽用于糖尿病治疗效果明显，能降低2型糖尿病患者糖化血红蛋白(HbA1c)水平和餐后血糖，并能减轻体重、且使用剂量小，临床每次给药剂量仅为5-10微克，副反应较小。但是该药平均半衰期只有2.4小时，每天需注射两次，给病人生活带来极大的痛苦和不便。此外，由于与人GLP-1的同源性只有53％，使得患者产生针对Exendin-4的抗体比率增加，研究证实，与另一种已应用于临床的GLP-1类似物药物利拉鲁肽(与人GLP-1同源性高达97％)相比，病人连续30周给予艾塞那肽，产生抗体的病人比率约43％，显著高于利拉鲁肽(仅有8.6％)。因而对Exendin-4进行结构修饰，形成具有同样药理活性的类似物，有效延长半衰期，从而降低注射频率，实现每周或更长时间注射一次，一方面可以减小患者的身心负担，提高患者治疗依从性，还大大降低治疗成本；更重要的是可以减小因频繁注射给药引起抗体产生风险。因而长效或者缓释GLP-1类似物开发已成为目前研究热点和难点课题，其中结构修饰是较为理想的且运用较为成功的策略。如添加脂肪酸侧链(Chae SY等,J Control Release,2010,144:10–16)或与亲水性聚合物如PEG连接，或直接与血清蛋白融合，如与免疫球蛋白Fc片段融合。Fc融合蛋白增加了蛋白制剂的分子量，从而降低肾脏清除重组蛋白分子的速率，达到延长重组蛋白血浆半衰期的目的；另一方面，还可通过Fc的再循环受体(recycling receptors,FcRn)，促进重组蛋白的再循环利用，进一步延长重组蛋白的血浆半衰期。

目前，由Eli Lilly公司开发的IgG4Fc融合的每周一次皮下注射的长效GLP-1类似物——杜拉鲁肽(Dulaglutide)已经在美国上市，从结构上看，杜拉鲁肽是将GLP-1(7-37)类似物通过15个氨基酸的肽接头融合到重组IgG4Fc片段的N端，平均生物半衰期长达90小时(中 国专利号：CN1802386B)。另外，中国专利CN101891823中公开了一种Exendin-4及其类似物与天然人IgG2Fc片段通过特定的连接肽偶联而成的融合蛋白。对应用于人的治疗而言，当GLP-1/Fc融合蛋白结合于靶细胞受体时，融合蛋白的Fc区域必须不会介导不良效应子功能而裂解或除去这些细胞。因此，GLP-1的Fc区域必须是非裂解性的，即在结合FcγRs和C1q而触发效应子功能方面，Fc必须是无活性的。在四种人IgG同种型中，只有IgG2与FcγRs的结合低得难以测定，所以人IgG2几乎没有ADCC效应。显然，专利CN101891823中所公开的融合蛋白Fc段所介导的细胞毒作用和补体激活作用可能会给机体造成一定伤害。为了得到非裂解性的Fc，本发明将GLP-1融合配体——天然人IgG2Fc区域中的一些氨基酸进行突变，以消除其效应子功能。

由法国Sanofi公司开发的利司那肽(Lixisenatide)是将Exendin-4的第38位Pro去除，并在39位的Ser后接6个Lys。经过结构修饰，利司那肽的半衰期相对Exenatide有所延长，可每日一次皮下注射。而本发明公开的融合蛋白，其Exendin-4是在第39位Ser后接GlySerGlyGlyGlySer，缀合6个氨基酸有利于延长融合蛋白的半衰期及改善其稳定性。

综上，基于Exendin-4具有半衰期短、免疫原性强等不足，但同时其特殊的分子结构又赋予它其他天然GLP-1或GLP-1类似物所无法企及的优点，如与GLP-1受体结合的亲和力强、生物活性高、临床用药剂量极低，结构稳定不易被DPP-IV酶解以及代谢速率低等优势，本发明人构建了一种重组Exendin-4类似物与人IgG2Fc变体的融合蛋白，与杜拉鲁肽相比，具有更长的体内功能半衰期且更高的生物学活性，更高的生物利用度，因而可以进一步降低患者的注射频率，同时减小注射剂量。另一方面，本发明的IgG Fc配体源自人IgG2而不是IgG4，从安全性角度考虑，其相对于杜拉鲁肽具有更小的不良效应子功能。

技术实现要素：

本发明目的为了解决Exendin-4半衰期短、免疫原性强等缺陷，设计并制备了一种新型 Exendin-4类似物融合蛋白，所述融合蛋白具有延长的体内半衰期、更高的生物利用度、生物活性提高、免疫原性降低，同时其对DPP-IV酶的抵抗能力增强，具有更强的稳定性。

本发明一方面，提供了一种Exendin-4类似物融合蛋白(以下简称融合蛋白)，所述融合蛋白从N端到C端依次含有Exendin-4类似物(表示为Ex(1-45))，肽接头(Linker，表示为L)和人IgG2Fc变体(表示为vFc)，融合蛋白可表示为Ex(1-45)-L-vFc；

其中，所述Exendin-4类似物Ex(1-45)为COOH末端修饰的Exendin-4，即在第39位Ser上连接GlySerGlyGlyGlySer；更具体地，所述Exendin-4类似物Ex(1-45)的氨基酸序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGSGGG(如SEQ ID NO：2所示)。本发明发现Ex(1-45)，即在Exendin-4的COOH末端缀合6个氨基酸，抵抗DPP-IV酶水解作用的能力增强，即稳定性增强，从而延长其半衰期。

其中，所述肽接头为具有(GGGGS)n结构的柔性肽，其中6≥n≥1且为整数。进一步地，所述肽接头的氨基酸序列优选为GGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：4所示)。

本发明发现，在Ex(1-45)和人IgG2Fc变体间添加肽接头以两种方式提高Ex(1-45)-L-vFc的体外生物活性：(1)保持Fc区域与Ex(1-45)上COOH端Trp-cage结构功能区的距离，Exendin-4的COOH端Trp-cage结构对形成可被GLP-1受体识别的构象至关重要，影响与受体的结合亲和力大小，和(2)保持两个Ex(1-45)活性肽的距离，从而使Ex(1-45)功能域能分别与其受体作用。此外，连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。对本发明而言，优选长度为30个或更少氨基酸的柔性肽接头。更优选的长度至少为5个氨基酸的肽接头。

其中，所述人IgG2Fc变体vFc具有降低的效应子功能且与新生儿受体FcRn结合亲和力增强；进一步地，所述人IgG2Fc变体vFc优选为含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；更具体地，所述人IgG2Fc变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

人IgG2不结合FcγR，但显示出极弱的补体活性。本发明所述人IgG2Fc变体的331位 (由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，目的是为了降低与C1q的结合，以降低依赖于补体的细胞毒性(CDC)；而250和428位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，使得Fc段与新生儿受体FcRn的结合亲和力增加，从而进一步延长半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述两类功能的变体相互组合或叠加，获得新组合变体，具有降低的效应子功能同时获得了更长的半衰期。

根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述Ex(1-45)-L-vFc融合蛋白的DNA序列。

根据本发明的再一个方面，提供一种载体。该载体包含上述DNA序列。

根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体。

进一步地，宿主细胞是CHO的衍生细胞株DXB11。

根据本发明的再一个方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述Ex(1-45)-L-vFc融合蛋白。

根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)将编码Ex(1-45)-L-vFc融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；

(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过100μg/10⁶(百万)个细胞的高产量细胞株；

(c)培养步骤(b)筛选获得的细胞株；

(d)收获步骤(c)得到的发酵液，纯化融合蛋白；

与现有产品相比，该融合蛋白具有如下的突出优点：

1、具有延长的体内循环半衰期，在大鼠体内的循环半衰期长达14.03±1.13小时，一方面可减小血清中药物浓度的波动，降低注射频率，从而提高患者的生活质量；另一 方面减小因频繁注射给药引发潜在抗体生成的风险。

2、具有延长的体内功能半衰期，小鼠腹腔注射葡萄糖耐受试验显示，在给予融合蛋白144小时后，仍具有较高的生物学活性，能有效、平稳的控制小鼠血糖水平。

3、良好的耐受性，糖尿病db/db小鼠连续给药4周后，未出现因受体的快速抗药性反应引起的降糖效果降低的现象。

4、更高的生物利用度，单次给药药代动力学研究数据显示，在给药剂量相同的情况下，Ex(1-45)-L-vFc药物暴露量(AUC_0～48h)明显高于杜拉鲁肽，由此推测Ex(1-45)-L-vFc在大鼠体内的生物利用度更高，可以预期其临床用药剂量也将降低。

附图说明

图1、显示了根据本发明实施例的在PCDNA3.1表达载体内SpeI/EcoRI片段的Ex(1-45)-L-vFc的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，由α1微球蛋白前导肽(1-19)、Ex(1-45)(20-64)、柔性肽接头(65-74)和vFc(75-297)构成。

图2、以体外GLP-1受体激动剂细胞筛选模型测定不同GLP-1类似物激活受体反应的特异性。

图3、KM小鼠皮下注射Ex(1-45)-L-vFc 1h后IPGTT糖耐量试验0-120min血糖变化曲线图。

图4、KM小鼠皮下注射Ex(1-45)-L-vFc 1h后OGTT糖耐量试验0-120min血糖变化曲线图。

图5、单次皮下注射Ex(1-45)-L-vFc对db/db糖尿病小鼠0-168h血糖值的影响。统计学差异标注：*Ex(1-45)-L-vFc组与阴性组比较(P<0.01)；^#杜拉鲁肽组与阴性组比较(P<0.01)。

图6、SD大鼠单次皮下注射Ex(1-45)-L-vFc和杜拉鲁肽后不同采血时间点的AUC值比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的―操作性相连‖或―可操作地连于‖指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR，pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。

根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。

本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合蛋白。

本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：

1)提供编码融合蛋白的核酸序列；

2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；

3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；

4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；

5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。

将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。

有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996；86：338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。

可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。

可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯 化。

实施例1、构建编码Ex(1-45)-L-vFc融合蛋白的表达质粒

编码α1微球蛋白(α1microglobulin)前导肽和成熟Ex(1-45)多肽的基因序列、10个氨基酸的柔性肽接头(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)和人IgG2Fc变体(Pro331Ser/Thr250Gln/Met428Leu突变)的融合基因都是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，全长序列经化学合成方法获得(融合蛋白核苷酸及氨基酸序列见图1)。为了便于将目的片段插入表达载体的特定位点，在所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为SpeI和EcoRI。验证后GLP-1基因用SpeI和EcoRI酶切，然后插入到改造后的质粒PCDNA3.1相应酶切位点间，得到了融合基因表达质粒pCDNA3.1-Ex(1-45)-L-vFc。该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。该质粒还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有卡那霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PCDNA3.1表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增Ex(1-45)-L-vFc融合基因和DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。

实施例2、融合蛋白在转染细胞系中的表达

将重组的表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达Ex(1-45)-L-vFc融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)，本实施例中宿主细胞选取CHO衍生细胞株DXB11。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为240V电场和1050μFd电容的Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，在比色杯内的3×10⁷个细胞中加入40μg用PvuI线性化的质粒。在转染两 天后，将培养基改成含0.6mg/mL G418的生长培养基。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。也可用抗Exendin-4的ELISA进行融合蛋白表达量的定量。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平Fc融合蛋白的孔。

为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。用极限稀释的亚克隆能在高达5μg/mL MTX培养基中生长的转染子。测定分泌率对亚克隆的细胞系进行进一步的分析。选取分泌率水平超过约60(较佳地约100)μg/10⁶(即百万)个细胞/24小时的细胞系适应使用无血清生长培养基的悬浮培养，然后再用条件培养基纯化融合蛋白。

实施例3、融合蛋白的纯化与定性

用1N NaOH将含有融合蛋白的条件培养基滴定到pH 7～8，然后用0.45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的Protein A柱上。待融合蛋白结合于Protein A柱后，弃去流出的组分。用PBS洗涤该柱，直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH为3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的融合蛋白。用0.4体积的1M K₂HPO₄中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在4℃。在非还原条件下，由SDS-PAGE测得纯化的Ex(1-45)-L-vFc蛋白质的分子量范围在40到45kDa。在还原条件下，纯化的蛋白迁移至约90kDa。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。

本发明同时构建了一系列GLP-1类似物的Fc融合蛋白，与上述Ex(1-45)-L-vFc的载体构建以及表达、纯化方法相同。这一系列融合蛋白的连接肽与人IgG2Fc片段的氨基酸组成完全相同，区别在于GLP-1类似物的修饰方法不同(表中下划线处含有氨基酸替换或添加：FP2和FP3的第8位A突变为G；FP2、FP3和FP6的COOH端都缀合了6个氨基酸 “GSGGGS”)，这几种融合蛋白的命名、构成及氨基酸序列如表1所示：

表1、其他GLP-1类似物Fc融合蛋白的构成及氨基酸序列

实施例4、以GLP-1受体为靶点的体外生物学活性测定试验

建立以GLP-1信号通路为靶点的糖尿病药物筛选细胞模型，用于筛选GLP-1受体激动剂类的新型长效GLP-1类似物。根据文献(Zlokarnik G等,Science,1998,279(5347):84-88)，将带有人GLP-1R质粒和CRE-Luc报告基因的质粒PGL-4.29(Luc2P/CRE/Hygro)(购自长沙赢润生物技术有限公司)共转染CHO细胞，以16000个细胞/孔/200μl接种到96孔全白细胞培养板中，用含10％FBS的DMEM培养基培养16～24小时，待细胞生长至覆盖板底90％以上时，将用含10％FBS的DMEM培养基梯度稀释的融合蛋白Ex(1-45)-L-vFc、FP2、FP3和FP6按每孔10μl加入，浓度梯度设置为0.010、0.020、0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.25和2.5nM，同时设置等浓度的杜拉鲁肽阳性对照组(Eli Lilly Company生产，货号：9301897)。在37℃，5％CO₂条件孵育5-6小时后，吸去上清，缓慢加入300μl PBS/孔洗涤细胞，随后吸去PBS，加入40μl裂解液，震荡15min，随后每孔加入40μl荧光素酶底物(FireflyLuciferase Assay Reagent)，反应2分钟，在多功能酶标仪(SpectraMaxM5system，Molecular Device公司)上波长560nm下测定荧光值，并根据荧光值描绘剂量反应曲线，确定EC₅₀值，结果见图2。Ex(1-45)-L-vFc的EC₅₀值约为0.03586nM，而杜拉鲁肽的EC₅₀值约为0.02987nM，说明二者的生物学活性相当；FP3和FP6的EC₅₀值分别约为3.694nM和1.086nM，显著高于Ex(1-45)-L-vFc和杜拉鲁肽的EC₅₀值；在0.01-2.5nM浓度范围内，FP2由于活性太低，无法计算得出EC₅₀值。因此，表明本发明的Ex(1- 45)-L-vFc和杜拉鲁肽与GLP-1受体的结合能力相当且都呈剂量依赖性，体外生物学活性并未因融合蛋白的配偶体Fc与Ex(1-45)的COOH端连接造成的空间位阻效应而明显降低。同时表明，FP2、FP3和FP6与受体的结合能力显著弱于杜拉鲁肽和Ex(1-45)-L-vFc，体外生物学活性较差。

实施例5、小鼠葡萄糖耐受试验

(一)小鼠腹腔注射葡萄糖耐受试验(IPGTT)初步评价候选长效GLP-1类似物融合蛋白体内降糖效果

30只KM小鼠(购自上海斯莱克实验动物中心)，雄性，8周龄，体重约30g，将血糖在正常值范围内的小鼠预饲一周，实验随机分成6组，每组5只。KM小鼠过夜禁食不禁水16小时，分别于皮下注射Ex(1-45)-L-vFc(5mg/kg)、FP2(5mg/kg)、FP3(5mg/kg)和FP6(5mg/kg)，阳性对照组皮下注射3×10^-3mg/kg的艾塞那肽(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC，注册证号H20090382)，阴性对照组给予等体积剂量的PBS(10ml/kg)。给药后1h，进行腹腔注射葡萄糖耐受试验(IPGTT)：腹腔注射1.5g/kg葡萄糖(10％葡萄糖，无菌滤膜过滤)，分别于注射葡萄糖前(t＝0min)及注射后10、30、60、90和120min后断尾取血，再用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定血液中葡萄糖含量并绘制IPGTT曲线，计算血糖曲线下面积(AUCG)，计算方法为：糖负荷后曲线下面积(AUCG)为IPGTT曲线下各梯形面积之和，计算公式为(按梯形面积公式计算)＝l/2×(0h血糖+10min血糖值)×10+l/2×(10min血糖+30min血糖值)×20+1/2×(30min血糖值+60min血糖值)×30+1/2×(60min血糖值+90min血糖值)×30+1/2×(90min血糖值+120min血糖值)×30。

结果显示，给药1小时后IPGTT糖耐量曲线(图3)表明，Ex(1-45)-L-vFc和艾塞那肽组血糖曲线变化一致，10min时均达到最大值，且60min后Ex(1-45)-L-vFc血糖值低于艾塞那肽组；经Student’s T-test检验，艾塞那肽阳性组与Ex(1-45)-L-vFc血糖曲线峰下面积 (AUCG_0-120min)相似，组间无显著性差异(P>0.05)，但与PBS阴性组相比，两组的AUCG_0-120min均显著降低；FP2、FP3和FP6组在给药1h后的AUCG_0-120min值均低于阴性对照组，且具有显著性差异(P<0.05)，结果见表2-1。结果表明，各组间的AUCG_0-120min数据表明在2h内，对腹腔注射一定量葡萄糖溶液的KM小鼠，Ex(1-45)-L-vFc组与艾塞那肽阳性药组对小鼠的葡萄糖吸收和利用的影响几乎一致，AUCG_0-120min值约为743mmol/L*min，两组均明显低于阴性组1080mmol/L*min；以上实验说明受试药Ex(1-45)-L-vFc和艾塞那肽与PBS阴性组比较，对KM小鼠均有降血糖作用，而且能够显著提高正常KM小鼠的糖耐受程度。

在给药72小时后进行IPGTT时，Ex(1-45)-L-vFc的AUCG_0-120min显著低于艾塞那肽组(P<0.05)，而艾塞那肽组的AUCG_0-120min与PBS组相比，已不具有显著性差异，结果见表2-2。当给药144小时后进行IPGTT时，Ex(1-45)-L-vFc的AUCG_0-120min仍显著低于PBS组和艾塞那肽组(P<0.05)，结果见表2-3。但在给药216小时后进行IPGTT时，各组间AUCG_0-120min与PBS相比，均已无显著性差异，结果见表2-4。结果表明，Ex(1-45)-L-vFc能有效、持久地降低小鼠空腹血糖，在给药144小时后仍具有生物学活性，半衰期显著长于艾塞那肽；而GLP-1类似物FP2、FP3和FP6与PBS阴性组相比，仅在给药1小时后的IPGTT试验中呈现显著降低的AUCG_0-120min，表明其生物学活性低于艾塞那肽和Ex(1-45)-L-vFc，且半衰期较短，给药72小时后已显示不出降糖效果。

表2-1、KM小鼠单次药后1h IPGTT血糖峰下面积AUCG_0-120min(单位：mmol/L*min)

表2-2、KM小鼠单次药后72h IPGTT血糖峰下面积AUCG_0-120min(单位：mmol/L*min)

表2-3、KM小鼠单次药后144h IPGTT血糖峰下面积AUCG_0-120min(单位：mmol/L*min)

表2-4、KM小鼠单次药后216h IPGTT血糖峰下面积AUCG_0-120min(单位：mmol/L*min)

综上可知，本发明人所构建的一系列GLP-1类似物融合蛋白FP2、FP3、FP6以及 Ex(1-45)-L-vFc，其中仅Ex(1-45)-L-vFc保留了较佳的体内、体外生物学活性，与GLP-1阳性对照药艾塞那肽和杜拉鲁肽相类似，且体内功能半衰期显著延长；而FP2、FP3和FP6不仅生物活性较低且体内功能半衰期较短。这是由于GLP-1类似物与分子量约为25kDa的IgG Fc段融合时，融合配偶体Fc的空间位阻效应往往会导致GLP-1/Fc融合蛋白生物学活性降低甚至丧失。生物学活性的下降将直接导致临床剂量的大幅增加。因而，GLP-1类似物Fc融合蛋白构建和制备技术方案对本领域技术人员而言并非是显而易见的，融合配体Fc片段并不必然赋予融合蛋白显著延长的半衰期、较佳的生物学活性和更强的稳定性。

(二)口服葡萄糖耐受试验(OGTT)进一步验证Ex(1-45)-L-vFc体内降糖效果

经IPGTT葡萄糖耐受试验筛选到候选长效GLP-1类似物融合蛋白——Ex(1-45)-L-vFc，降低其作用剂量，以探索其最低有效剂量，并对其体内降糖效果做进一步验证。

24只KM小鼠(购自上海斯莱克实验动物中心)，雄性，6周龄，体重约28g，试验开始前将小鼠适应性饲养一周，一周后小鼠体重增长为30g左右，动物按照随机分组原则分为3组，每组8只。KM小鼠过夜禁食不禁水16小时，皮下注射3mg/kg的Ex(1-45)-L-vFc，阳性对照组皮下注射3mg/kg的杜拉鲁肽(Eli Lilly Company生产，货号：9301897)，阴性对照组注射等体积剂量(10ml/kg)的PBS。给药后1h，进行口服葡萄糖耐受试验(OGTT)：经口给予2g/kg葡萄糖(20％葡萄糖，无菌滤膜过滤)，分别于注射葡萄糖前(t＝0min)及注射后30、60、90和120min后断尾取血，再用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定血液中葡萄糖含量并绘制OGTT曲线，计算血糖曲线下面积(AUCG)，计算方法为：糖负荷后曲线下面积(AUCG)为OGTT曲线下各梯形面积之和，计算公式为(按梯形面积公式计算)＝l/2×(0min血糖+30min血糖值)×30+1/2×(30min血糖值+60min血糖值)×30+1/2×(60min血糖值+90min血糖值)×30+1/2×(90min血糖值+120min血糖值)×30。血糖数据表示：Means±SD。数据分析用Student’s T-test或one-way ANOVA，统计假设检验采用双侧检验，检验水准为0.05。显著意义标识为P≤0.05，P≤0.01或P≤0.001，P为获得的概率值。

结果如图4所示，2h-OGTT糖耐量曲线表明，Ex(1-45)-L-vFc和杜拉鲁肽组血糖曲线变化一致，30min时均达到最大值；计算并比较各组AUCG_0-120min，Ex(1-45)-L-vFc和杜拉鲁肽组较PBS阴性组AUCG_0-120min均显著降低(P≤0.001)，而两组间AUCG_0-120min无统计学显著差异(P>0.05)。以上数据显示，对经口给予一定量葡萄糖溶液的KM小鼠，Ex(1-45)-L-vFc组与杜拉鲁肽组在同等剂量下，对正常KM小鼠葡萄糖吸收和利用的影响具有等效性。

实施例6、糖尿病db/db小鼠单次注射Ex(1-45)-L-vFc的血糖变化情况

20只雄性糖尿病db/db小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，12周龄，血糖平均值约25mmol/L，按体重随机分组(n＝3)，每组5只。受试药物组按1.2mg/kg剂量皮下注射Ex(1-45)-L-vFc，阳性对照组注射1.2mg/kg的杜拉鲁肽(Eli Lilly Company生产，货号：9301897)，阴性对照组注射等体积剂量的PBS缓冲液。各组动物分别于给药前(0h)、给药后6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h进行尾静脉采血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定随机血糖值，并记录数据。血糖数据用Mean±SD差表示。利用T-test检验或单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著意义标识为P≤0.05，P≤0.01或P≤0.001，P为获得的概率值。

在相同剂量下，Ex(1-45)-L-vFc和阳性对照药杜拉鲁肽均有降血糖作用，如图5所示。经t-test检验，在24h～144h下，Ex(1-45)-L-vFc与阳相对照药杜拉鲁肽比较具有显著统计学差异，P<0.05，说明Ex(1-45)-L-vFc降血糖作用明显强于阳性对照药杜拉鲁肽；另外从给药后一周小鼠血糖变化曲线图中可以看出，杜拉鲁肽降血糖作用仅能维持72小时，而Ex(1-45)-L-vFc能维持至给药后168小时，即第7天小鼠的血糖水平与阴性对照组相比，仍具有统计学差异(P<0.01)，因而有望开发成每周或更长周期给药一次的长效GLP-1受体激动剂。

实施例7、连续注射Ex(1-45)-L-vFc对db/db糖尿病小鼠的持续降糖作用

15只雄性糖尿病db/db小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，12周龄，血糖平均值约26.5mmol/L，按体重随机分组(n＝5只/组)。本试验以1.2mg/kg杜拉鲁肽为阳性对照组，皮下注射给药，每周1次，连续给药4周，Ex(1-45)-L-vFc组的给药剂量和给药周期同对照组。除第一周于给药前一天(第0天)尾静脉取血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定基础血糖值，随后分别在第4、11、18和25天尾静脉取血测定各组动物的随机血糖值。

从表3中各组小鼠血糖值的变化趋势可知，在连续给药4周后，Ex(1-45)-L-vFc和杜拉鲁肽组的小鼠血糖值平稳下降，都能有效、持续地控制db/db糖尿病小鼠的血糖水平。相反地，PBS阴性对照组小鼠的血糖值呈明显上升趋势。而且，首次给药和末次给药，Ex(1-45)-L-vFc的降糖效果相似，说明未出现由于受体的快速抗药性反应，引发对Ex(1-45)-L-vFc的耐受作用。

表3、连续注射Ex(1-45)-L-vFc对db/db小鼠血糖的影响，均值±S.D.(单位：mmol/L)

实施例8、链脲佐菌素(STZ)诱导KM小鼠糖尿病模型药效学研究

选取5周龄SPF级雄性昆明小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，36只，体重均值为25±2g，空腹血糖平均值范围为9.2mmol/L左右。适应饲养1周的昆明小鼠，禁食18h，称重，按150mg/kg腹腔注射给予1％STZ溶液，PH＝4.4(购自Sigma公司，货号S0130)，正常组小鼠腹腔注射给予等注射体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(购自国药集团化学试剂有限公司)。注射后5天检测糖尿病组小鼠随机血糖值(Random blood glucose， RBG)，RBG≥16.7mmol/L视为糖尿病小鼠。为观察受试药物对STZ诱导的糖尿病小鼠的降血糖效果，选取造模成功小鼠20只，随机分为4组，每组5只，分别于皮下注射给予3mg/kg的Ex(1-45)-L-vFc和3mg/kg的杜拉鲁肽(Eli Lilly Company制造，货号：9301897)，正常组和模型组动物分别给予等体积剂量的PBS缓冲液。分别于给药前(0h)、给药后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h尾静脉采血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定各组动物的随机血糖值RBG，并记录数据。数据以均数±标差形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据，P<0.05表示具有显著性统计学差异。数据及分析结果如表4所示：

表4、Ex(1-45)-L-vFc对STZ诱导的DM小鼠随机血糖的影响(n＝4)

注：与正常组相比，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01；与模型组相比，³⁾P＜0.05，⁴⁾P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，⁵⁾P＜0.05，⁶⁾P＜0.01。

续表4、Ex(1-45)-L-vFc对STZ诱导的DM小鼠随机血糖的影响(n＝4))

注：与正常组相比，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01；与模型组相比，³⁾P＜0.05，⁴⁾P＜0.01；与杜拉鲁肽相比，⁵⁾P＜0.05，⁶⁾P＜0.01。

以上数据表明，Ex(1-45)-L-vFc受试药组在STZ诱导的糖尿病模型上，在给药第96小时，其随机血糖值与模型组(P＜0.01)和杜拉鲁肽组(P＜0.05)相比，均具有显著性差异。 在给药后168小时的血糖值与模型组比较，仍有明显的统计学差异，P＜0.01；而杜拉鲁肽组在给药后第96小时，其RBG值与模型组相比，已不具有统计学差异。揭示Ex(1-45)-L-vFc受试药相对于阳性药杜拉鲁肽，对STZ诱导的糖尿病小鼠的降血糖效果更显著，且具有更长的功能半衰期。

实施例9、大鼠体内单次给药药代动力学测定

雄性SPF级SD大鼠(上海必凯实验动物有限公司)，预饲一周后单次皮下注射(sc)0.5mg/kg的Ex(1-45)-L-vFc，每组3只，分别于给药前0h，给药后2h、5h、8h、24h、28h、32h、48h、56h和72h采集各时间点下眼眶取血，每次约0.3ml左右，分别记作：T₀、T₂、T₅、T₈、T₂₄、T₂₈、T₃₂、T₄₈、T₅₆和T₇₂；同时，另一组动物(雄性，n＝3)作为阳性对照组，注射0.5mg/kg的杜拉鲁肽(Eli Lilly Company制造，货号：9301897)，采血时间和方法同上。取血后静置，再以5000rpm离心10min分离血清，于-70℃冷冻保存后合并检验。用双抗夹心ELISA测定时，以自制或市售的(如Santa Cruz公司生产，货号SC-65389)抗Exendin-4或GLP-1的NH2末端单克隆抗体包被、以自制或市售的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG Fc单抗(如北京义翘神州生物技术有限公司，货号：10702-MM01E-50)进行检测。后将数据输入分析软件PKSOLVER，得出待测药物在血液中T_1/2，C_max和AUC_0～48h～∞等药代动力学参数。

如表5中结果显示，0.5mg/kg的Ex(1-45)-L-vFc在大鼠体内的循环半衰期T_1/2为14.03±1.13小时，而0.5mg/kg的杜拉鲁肽在大鼠体内的T_1/2为10.80±2.45小时。另外，杜拉鲁肽的达峰时间早于Ex(1-45)-L-vFc，说明前者在体内起效更快。另外，通过比较图6中不同采血时间点测得的AUC_0～t(t＝2h、5h、8h、24h、28h、32h或48h)可得知，在给药剂量相同的情况下，Ex(1-45)-L-vFc药物暴露量高于杜拉鲁肽，由此推测Ex(1-45)-L-vFc在大 鼠体内的生物利用度更高，可以预期其临床给药剂量也将降低。

表5、雄性SD大鼠单次皮下注射0.5mg/kg的Ex(1-45)-L-vFc和杜拉鲁肽的药代动力学参数

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。