具有胶原特异结合能力的神经再生抑制分子的拮抗蛋白CBD-PlexinB1LBD及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有胶原特异结合能力的神经再生抑制分子的拮抗蛋白CBD-PlexinB1LBD及应用。

背景技术：

脊髓是中枢神经的重要组成部分，主要功能是传送脑与外周之间的神经信息同时也是许多简单反射活动的低级中枢。脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)多见于一些自然灾难之中，如地震和矿难等，另外，在交通事故和一些运动性损伤中也常有发生。脊髓损伤后通常在受损的节位以下表现出躯体自主运动功能及感觉的缺失。在脊髓受损后，损伤的以及残存的正常脊髓神经元很难自发再生进入或跨越损伤区。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有胶原特异结合能力的神经再生抑制分子的拮抗蛋白CBD-PlexinB1LBD及应用。

本发明首先提供了一种融合蛋白，命名为融合蛋白CBD-PlexinB1LBD，包括CBD区段和PlexinB1LBD区段；所述CBD区段由序列表中序列2自氨基末端第22至28位氨基酸残基组成；所述PlexinB1LBD区段由序列表中序列2自氨基末端第40至181位氨基酸残基组成。

所述融合蛋白中，所述CBD区段位于所述PlexinB1LBD区段的上游。

所述融合蛋白具体可为如下(a)或(b)：(a)序列表中序列2自氨基末端第22至181位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表中序列2所示的蛋白质。

编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因中，编码所述CBD区段的DNA分子可如序列表的序列1自5’末端第64至84位核苷酸所示，编码所述PlexinB1LBD区段的DNA分子可如序列表的序列1自5’末端第118至543位核苷酸所示。

所述基因具体可为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列1自5’末端第64至543位核苷酸所示的DNA分子；(d)序列表的序列1所示的DNA分子。

含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为在pET28a(+)载体多克隆位点插入序列表的序列1自5’末端第64-546位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为将pET28a(+)载体Nde I和XhoI酶切识别序列之间的小片段替换为序列表的序列1自5’末端第64-546位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒pET28a-6his-CBD-PlexinB1LBD。

所述重组菌可为将以上任一所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

以上任一所述融合蛋白或以上任一所述基因在制备促进脊髓损伤修复的药物中的应用也属于本发明的保护范围。所述促进脊髓损伤修复可为促进神经元细胞神经丝伸长和/或促进脊髓损伤处神经纤维增长和/或促进脊髓损伤处5-HT型运动神经元增长。

本发明还保护一种促进脊髓损伤修复的药物，其活性成分为如下(e)或(f)：(e)以上任一所述的融合蛋白；(f)结合有以上任一所述的融合蛋白的胶原支架。所述促进脊髓损伤修复可为促进神经元细胞神经丝伸长和/或促进脊髓损伤处神经纤维增长和/或促进脊髓损伤处5-HT型运动神经元增长。

结合有所述融合蛋白的胶原支架具体可采用如下方法制备：将胶原支架用含有所述融合蛋白的溶液室温孵育。所述室温孵育的时间具体可为半小时。“含有所述融合蛋白的溶液”具体可为用PBS缓冲液溶解所述融合蛋白得到的溶液。每20微升“含有所述融合蛋白的溶液”中可含有5微克所述融合蛋白。

所述胶原支架的制备方法可包括如下步骤：取剥离真皮后的牛皮肤，在1-4g/100ml的SDS水溶液中浸泡处理24-72h，然后用1-8％(体积分数)的Triton X-100水溶液浸泡处理24-72h，然后用含0.5-1.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液(25-100mmol/L、pH7.6-8.5)浸泡处理24-72h，用水清洗后冻干，即为胶原支架。所述胶原支架的制备方法具体可包括如下步骤：取剥离真皮后的牛皮肤，在3g/100ml的SDS水溶液中浸泡处理48h，然后用5％(体积分数)的Triton X-100水溶液浸泡处理48h，然后用含1mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L、pH8.0)浸泡处理48h，用去离子水清洗后冻干，即为胶原支架。所述胶原支架的制备方法中还包括将制备得到的胶原支架进行灭菌的步骤。所述灭菌的具体方法为：Co⁶⁰照射灭菌。

融合蛋白CBD-PlexinB1LBD具有很好的胶原特异结合能力，在有抑制剂存在时能促进神经元细胞神经丝伸长。移植结合有CBD-PlexinB1LBD的胶原支架的大鼠在手术后三个月能相对空白对照组和单纯胶原支架组表现出更好的神经纤维和5-HT型神经元的再生。结果表明，融合蛋白CBD-PlexinB1LBD具有很好的修复脊髓损伤的潜力和临床应用前景。本发明有利于解决脊髓再生抑制分子的拮抗蛋白在体内扩散造成的低活性和高风险，为脊髓损伤的修复提供了新方法。

附图说明

图1为实施例2的结果。

图2为实施例3的结果。

图3为实施例4中手术及给药的示意图。

图4为实施例4中近头侧、近尾侧和损伤区神经丝蛋白特异标志物NF的免疫荧光染色结果；标尺为50μm，“Hoechst/GFAP/NF”为“细胞核荧光染料Hoechst/胶质纤 维酸性蛋白/神经丝蛋白。

图5为实施例4中损伤区运动神经元特异标志物5-HT的免疫荧光染色结果；标尺表示50μm，“Hoechst/GFAP/5-HT”为“细胞核荧光染料Hoechst/胶质纤维酸性蛋白/酪氨酸羟化酶”。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

MCF－7细胞(乳腺癌肿瘤细胞系)：上海拜力生物科技有限公司(货号BL12-H)。pET28a(+)载体:Novagen公司。大肠杆菌BL21(DE3)：北京全式金生物技术有限公司(货号CD601-01)。anti-his：sigma(货号H1029)。anti-mouse IgG(具有碱性磷酸酶标记)：sigma(货号A1418)。Sema4D(髓鞘来源的抑制分子)：ProSpec公司。实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4-7.6、0.01M的PBS缓冲液。来源于小鼠的anti-NF抗体：中杉金桥(货号ZM-0198)。来源于小鼠的anti-5-HT抗体：Immunostar(货号20080)。

实施例1、融合蛋白CBD-PlexinB1LBD的制备

一、重组质粒pET28a-6his-CBD-PlexinB1LBD的构建

1、提取MCF－7细胞的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用S1和X1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

S1：5′－GATAAGCTTGCGTGCTAGACAGCAG-3′；

X1：5′-TATCTCGAGTCAGTACTCGG-3′。

3、用限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、将pET28a(+)载体Nde I和BamH I酶切识别序列间的DNA片段替换为序列表的序列1自5’末端第64-84位核苷酸所示的DNA片段，得到的重组质粒pET28a-6his-CBD。

5、用限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切重组质粒pET28a-6his-CBD，回收约5kb的载体骨架。

6、将步骤3的酶切产物步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-6his-CBD-PlexinB1LBD。根据测序结果，对重组质粒pET28a-6his-CBD-PlexinB1LBD进行结构描述如下：将pET28a(+)载体Nde I和XhoI酶切识别序列之间的小片段替换为了序列表的序列1自5’末端第64-546位核苷酸所示的DNA分子。

重组质粒pET28a-6his-CBD-PlexinB1LBD中，外源DNA片段与出发质粒中的DNA融合，形成序列表的序列1自5’末端第1-546位核苷酸所示的融合基因CBD-PlexinB1LBD，表达序列表的序列2所示的融合蛋白CBD-PlexinB1LBD。

序列表的序列2中，自N末端第5至10位氨基酸残基组成HIS₆标签，第22至28位氨基酸残基组成胶原结合结构域(CBD区段)，第40至181位氨基酸残基组成Sema4D受体PlexinB1的受体结合结构域(PlexinB1LBD区段)。

序列表的序列1中，自5’末端第1至3位核苷酸为起始密码子，第13至30位核苷酸编码HIS₆标签，第64至84位核苷酸编码CBD区段，第118至543位核苷酸编码PlexinB1LBD区段，第544至546位核苷酸为终止密码子。

二、重组质粒pET28a-6His-PlexinB1LBD的构建

1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。

2、以步骤1得到的双链DNA分子为模板，采用S2和X1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

S2：5′－TATGGATCCGTGCTAGACAGCA－3′；

X1：5′-TATCTCGAGTCAGTACTCGG-3′。

3、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切pET28a(+)载体，回收约5kb的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-6His-PlexinB1LBD。根据测序结果，对重组质粒pET28a-6His-PlexinB1LBD进行结构描述如下：将pET28a(+)载体BamHI和XhoI酶切识别序列之间的小片段替换为了序列表的序列3自5’末端第103至531位核苷酸所示的DNA分子。

重组质粒pET28a-6His-PlexinB1LBD中，外源DNA片段与出发质粒中的DNA融合，形成序列表的序列3自5’末端第1-531位核苷酸所示的融合基因PlexinB1LBD，表达序列表的序列4所示的融合蛋白PlexinB1LBD。

三、重组菌的获得

将重组质粒pET28a-6his-CBD-PlexinB1LBD导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌甲。

将得到重组质粒pET28a-6His-PlexinB1LBD导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙。

四、融合蛋白CBD-PlexinB1LBD和融合蛋白PlexinB1LBD的制备

1、将重组菌(重组菌甲或重组菌乙)单克隆接种于10ml LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12小时。

2、完成步骤1后，取培养体系，按照1:50的体积比接种至LB液体培养基，37℃、 200rpm振荡培养至OD600nm＝0.8-1，然后加入IPTG(使IPTG在培养体系中的浓度为1mM)并诱导培养5小时(诱导培养的条件：37℃、200rpm振荡)。

3、完成步骤2后，取培养体系，4℃、8000g离心10min，收集菌体。

4、超声破碎(100W超声处理15min)菌体，然后4℃、12000g离心30min，收集上清液。

5、取步骤4得到的上清液，进行亲和层析，收集目标液。

亲和层析的具体步骤：将500μL His填料(GE,货号17-5268-01)装入小柱子中，用5ml binding buffer(25mM Tris-HCl,pH8.0,250mM氯化钾,5mM咪唑，2mMβ-巯基乙醇)冲洗；然后将步骤4得到的上清液上样，弃流出液；然后用5ml washing buffer(25mM Tris-HCl,pH 8.0,250mM氯化钾,20mM咪唑,2mMβ-巯基乙醇)冲洗柱子，弃流出液；然后用2.5ml elution buffer(25mM Tris-HCl,pH8.0,250mM氯化钾,600mM咪唑,2mMβ-巯基乙醇)冲洗，收集流出液(即为目标液)。

6、取步骤5得到的目标液，用脱盐柱(GE公司；货号17-0851-01)按说明书进行脱盐处理，获得蛋白溶液。

采用重组菌甲进行上述步骤，得到的蛋白溶液为融合蛋白CBD-PlexinB1LBD溶液，冷冻干燥后得到融合蛋白CBD-PlexinB1LBD干粉。

采用重组菌乙进行上述步骤，得到的蛋白溶液为融合蛋白PlexinB1LBD溶液，冷冻干燥后得到融合蛋白PlexinB1LBD干粉。

实施例2、融合蛋白与胶原结合特性的分析

一、制备胶原干粉

1、取SD大鼠的鼠尾胶原，置于中性盐溶液(含0.1M Tris、0.2M NaCl和0.1M EDTA的水溶液，pH7.6)中，室温、50rpm振荡孵育3小时，然后4℃、12000g离心30分钟，取沉淀。

2、取步骤1得到的沉淀，溶于0.5M醋酸水溶液中，室温静置12小时，然后4℃、13000g离心1小时，收集上清液。

3、取步骤2得到的上清液，与4M的NaCl水溶液等体积混合，室温静置20分钟，然后4℃、13000g离心30分钟，收集沉淀。

4、取步骤3得到的沉淀，用0.2M乙酸水溶液溶解，在水中透析以除去NaCl，得到胶原溶液。

5、将步骤4得到的胶原溶液冷冻干燥，得到胶原干粉。

二、融合蛋白与胶原结合特性的分析

1、取步骤一得到的胶原干粉，用PBS缓冲液溶解，得到100μg/ml的胶原溶液。

2、取96孔酶标板，加入步骤1得到的胶原溶液(100μl/孔)，4℃静置12小时，弃上清，用PBS缓冲液洗涤3次。

3、完成步骤2后，取所述酶标板，加入含3％(质量百分比)BSA的PBS缓冲液(100μl/孔)，37℃、60rpm振荡孵育1.5小时，弃上清，用PBS缓冲液洗涤4次。

4、完成步骤3后，取所述酶标板，加入待测蛋白溶液(100μl/孔)，37℃、60rpm振荡孵育2.5小时，弃上清，用PBS缓冲液洗涤4次。待测蛋白溶液为融合蛋白CBD-PlexinB1LBD溶液或融合蛋白PlexinB1LBD溶液(采用PBS缓冲液溶解并稀释CBD-PlexinB1LBD蛋白干粉或PlexinB1LBD蛋白干粉)，蛋白浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0或10.0μM。将PBS缓冲液作为待测蛋白溶液的阴性对照。

5、完成步骤4后，取所述酶标板，加入一抗(anti-his,用PBS缓冲液稀释至2000倍体积；100μl/孔)，37℃、60rpm振荡孵育1.5小时，弃上清，用PBS缓冲液洗涤4次。

6、完成步骤5后，取所述酶标板，加入二抗(anti-mouse IgG,用PBS缓冲液稀释至10000倍体积；100μl/孔)，37℃、60rpm振荡孵育1小时，弃上清，用PBS缓冲液洗涤4次。

7、完成步骤6后，取所述酶标板，加入AP显色液(即2mg/ml P-NPP溶液；80μl/孔)，避光静置8.5分钟，然后加入等体积0.2M NaOH水溶液以终止反应。

8、完成步骤7后，每孔取100μl上清液，用酶标仪测定405nm下的OD值。

进行五次重复试验，结果取平均值。

结果见图1。融合蛋白CBD-PlexinB1LBD与胶原的结合能力显著高于融合蛋白PlexinB1LBD。

实施例3、融合蛋白的体外生物活性检测

一、制备神经元细胞

1、取新生7天的SD大鼠，在75％(体积比)乙醇水溶液中浸泡2-5分钟。

2、完成步骤1后，将大鼠置于超净台上，断头，取小脑，放入预冷的PBS缓冲液中，剔除血管和脑膜。

3、完成步骤2后，取小脑，剪碎后置于DMEM高糖培养液中，用滴管轻轻吹打直至组织团块消失，然后用灭菌的400目尼龙膜过滤，然后4℃、1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，即为小脑颗粒神经元细胞(简称神经元细胞)。

二、制备髓鞘蛋白

1、取4只成年SD大鼠的大脑，在0.32M蔗糖水溶液中匀浆破碎，得到2-3ml组织液。

2、取12ml超速离心管，先加入6ml 0.85M蔗糖水溶液，然后加入步骤1得到的组织液(2-3ml)，然后加入0.32M蔗糖水溶液至离心管满，然后4℃、75000g离心45min，离 心管内分成三层，取中间层，即为粗提物。

3、取步骤2得到的粗提物，用4℃预冷的水洗涤两次(每次洗涤方法如下：加水后静置半小时，然后4℃、12000g离心30分钟，弃上清)。

4、取12ml超速离心管，先加入6ml 0.85M蔗糖水溶液，然后加入步骤3得到的粗提物，然后加入0.32M蔗糖水溶液至离心管满，然后4℃、75000g离心45min，离心管内分成三层，取中间层体系。

5、将步骤4得到的中间层体系与3ml水混匀，用0.2微米滤膜过滤除菌，收集滤液并进行冷冻干燥，即为髓鞘蛋白干粉，置于-80℃备用。

三、融合蛋白的体外生物活性检测

1、取髓鞘蛋白干粉，溶于PBS缓冲液，得到髓鞘蛋白溶液(每10微升髓鞘蛋白溶液中含有200ng髓鞘蛋白干粉)。

2、取Sema4D，溶于PBS缓冲液，得到Sema4D溶液(每10微升Sema4D溶液中含有20ng Sema4D)。

3、取48孔板，第1至15孔每孔加入10微升步骤1得到的髓鞘蛋白溶液，第16-30孔每孔加入10微升步骤2得到的Sema4D溶液，第31-45孔每孔加入10微升PBS缓冲液(对照甲)，吹干。

4、完成步骤3后，取所述48孔板，接种步骤一制备的神经元细胞(20000-30000个细胞/孔)，然后加入含10％(体积比)胎牛血清的DMEM高糖培养基。

5、完成步骤4后，取所述48孔板，第1-5孔、16-20孔、31-35孔每孔加入5微升融合蛋白CBD-PlexinB1LBD溶液(融合蛋白CBD-PlexinB1LBD在体系中的浓度为20nM)，第6-10孔、21-25孔、36-40孔每孔加入5微升融合蛋白PlexinB1LBD溶液(融合蛋白PlexinB1LBD在体系中的浓度为20nM)，第11-15孔、26-30孔、41-45孔每孔加入5微升PBS缓冲液(对照乙)，37℃静置24小时。融合蛋白CBD-PlexinB1LBD溶液是将融合蛋白CBD-PlexinB1LBD干粉溶于PBS缓冲液得到的。融合蛋白PlexinB1LBD溶液是将融合蛋白PlexinB1LBD干粉溶于PBS缓冲液得到的。

6、完成步骤5后，检测神经丝的伸长情况。

神经丝免疫荧光染色步骤如下：(1)吸净孔内的培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次；(2)加入4％多聚甲醛溶液，室温静置20min，然后用PBS缓冲液洗涤3次；(3)加入胎牛血清，室温静置1小时，然后用PBS缓冲液洗涤1次；(4)加入一抗(一抗为抗βⅢTubulin，购自Millipore公司，货号05-559，使用时1:500稀释)，4℃静置孵育12小时，然后用PBS缓冲液洗涤3次；(5)加入荧光二抗(荧光二抗购自invitrogen公司；Alexa488Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)，CA21202s)，37℃静置孵育40min，然后用PBS缓冲液洗涤3次；(6)加入浓度50μg/ml Hoechst 33342(购自sigma公司)进行 核衬染10min,然后用PBS缓冲液洗涤3次；(7)显微镜下观察，照相。

结果见图2。髓鞘蛋白和Sema4D两种抑制因子均可以抑制神经元细胞的神经丝伸长。在存在上述抑制因子的情况下，融合蛋白CBD-PlexinB1LBD与融合蛋白PlexinB1LBD均可以促进神经元细胞神经丝伸长，且融合蛋白CBD-PlexinB1LBD的活性高于融合蛋白PlexinB1LBD。

实施例4、移植结合有融合蛋白CBD-PlexinB1LBD的胶原支架治疗大鼠脊髓T8全横断损伤

一、制备胶原支架

1、取剥离真皮后的牛皮肤，在3g/100ml的SDS水溶液中浸泡处理48h，然后用5％(体积分数)的Triton X-100水溶液浸泡处理48h，然后用含1mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L、pH8.0)浸泡处理48h，用去离子水清洗后冻干，即为胶原支架。

2、将胶原支架切成脊髓断面相当大小(长度为2-3mm，直径为1.5-2.5mm)后Co⁶⁰照射灭菌。

二、制作急性大鼠脊髓T8损伤模型

1、准备体重为250±25g的雄性成年SD大鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠(30-40mg/kg)进行麻醉。

2、完成步骤1后，取俯卧位，腰背部脱毛，消毒，切开T9-T11脊柱外的皮肤和皮下，分离双侧棘突旁肌肉，用拉钩拉开棘突旁肌肉，暴露出T10棘突和椎板。

3、完成步骤2后，用小号持针器咬除棘突，再切除椎板，用显微镊轻柔地提起暴露的脊髓组织，然后用显微剪剪断T10节段的脊髓组织，离断后的脊髓间距约为2-3mm，术中可用显微剪作多次横旋切，以确认完全离断。

三、分组处理

完成步骤二后，将SD大鼠分成三组(每组15只)，分别处理如下：

第一组：将肌肉和皮肤分别进行缝合，即完成手术；

第二组：在脊髓缺损处移植用PBS缓冲液室温孵育半小时后的胶原支架，然后将肌肉和皮肤分别进行缝合，即完成手术；

第三组：在脊髓缺损处移植用融合蛋白CBD-PlexinB1LBD溶液(用PBS缓冲液溶解并稀释融合蛋白CBD-PlexinB1LBD干粉，每20微升溶液中含有5微克融合蛋白CBD-PlexinB1LBD)室温孵育半小时后的胶原支架，然后将肌肉和皮肤分别进行缝合，即完成手术；

手术及给药的示意图见图3。

手术3个月后将大鼠处死，迅速将脊髓取出，先在4％多聚甲醛溶液中4℃静置固 定48小时，然后在30％蔗糖水溶液中4℃静置脱水12小时，然后采用OCT包埋剂包埋组织后进行冰冻切片，切片厚度为10μm。

切片染色：(1)取切片，用PBS缓冲液洗涤一遍，然后用山羊血清封闭30min，吸弃山羊血清，用PBS缓冲液洗涤两遍；(2)加入200μL一抗(来源于小鼠的anti-NF抗体或来源于小鼠的anti-5-HT抗体，稀释比例均为1:500)，使液体完全覆盖脊髓组织，4℃静置孵育12小时，用PBS缓冲液洗涤三遍；(3)加入荧光二抗(invitrogen公司，Alexa488Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)，CA21202s；按照二抗说明书稀释)，室温静置孵育1小时，用PBS缓冲液洗涤两遍；(4)用Hoechst(1:800)染核10min，用PBS缓冲液洗涤两遍，避光自然晾干；(5)滴加封片剂，封上盖玻片，显微镜下观察，照相。

定量结果取该组大鼠的平均值。

近头侧、近尾侧和损伤区神经丝蛋白特异标志物NF的免疫荧光染色结果见图4。

损伤区运动神经元特异标志物5-HT的免疫荧光染色结果见图5。

结果表明，移植了结合有融合蛋白CBD-PlexinB1LBD的胶原支架的大鼠长入损伤区内的神经纤维及5-HT型运动神经元的数量均显著高于移植单纯胶原支架的大鼠。