专利名称：一种抑制Survivin表达的siRNA分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可抑制Survivin表达的siRNA分子、及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
Survivin(存活素)是凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族的新成 员，是目前发现最强的凋亡抑制因子。Survivin功能复杂，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转 化并且参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用。Survivin基因 是Ambrosini等(Nature Med, 1997, 3 (8) :917_921)在人类基因组文库中筛选克隆到的， 该基因全长15KB，定位于17q25，含4个外显子和3个内含子，Survivin基因编码产物是由 142个氨基酸组成的蛋白，分子量16. 2KD。研究显示，Survivin的高表达能抑制多种因子如 p53,caspases等诱导的细胞凋亡。经转基因技术证实Survivin抑制凋亡的机制与IAP家 族其它成员一样，可直接作用于细胞色素C从线粒体向胞质释放的过程的末期。现已发现， Survivin基因在胚胎组织及恶性肿瘤中普遍表达，如乳腺癌、胃癌、肾癌、黑色素癌、肠癌、 神经母细胞癌和卵巢癌等；但在分化成熟的组织(除胎盘、增殖期子宫内膜、分泌期子宫内 膜有微量表达外)及癌旁正常组织中无表达。它的这一特性，使得靶向Survivin的免疫治 疗和基因治疗能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其增殖，正常组织却能不受损伤和影响。RNA干扰技术是近几年来兴起的生物技术，该项技术的发现为疾病治疗尤其是癌 症的治疗开辟了全新的途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗理念。用siRNA干 扰特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由 双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。其原理是RNase III 核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21_23nt及3 ‘端突出的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)，随后 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结 合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基 因沉默机制。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研 究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。目前针对Survivin的RNA干扰研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果。有 很多文献报道，用RNA干扰的技术来抑制Survivin基因的表达，Carvalho等用小分子干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)转染HeLa细胞，60h后蛋白印迹结果显示治疗组中 已检测不到Survivin的表达，细胞增殖明显受抑，部分细胞有丝分裂受到阻滞，出现凋亡 (J Cell Sci,2003,116(14) =2987-2998) 应用 RNA 干扰技术，用靶向至 Survivin 基因的 siRNA作为靶向药物，在基因的转录后进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的 有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，对肿瘤进行抑制， 在不久的将来可能成为一种新的肿瘤治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过SiRNA分子库技术筛选出的可抑制Survivin表 达的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成正义链5，-GAGCUGGAAGGCUGGGAGCCAGANn-3，(SEQID NO 2)反义链5，-UCUGGCUCCCAGCCUUCCAGCUCNn-3，(SEQID NO 3)其中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤 A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ;n是0 2的整数。换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为正义链5，-GAGCUGGAAGGCUGGGAGCCAGA-3，(SEQID NO 4)反义链5，-UCUGGCUCCCAGCCUUCCAGCUC-3，(SEQID NO 5)在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本发明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与Survivin基因的mRNA 结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿 瘤血管的生成，达到治疗肿瘤的目的。
图1是合成的Survivin基因开放阅读框琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA 片段大小为429bp。右侧条带是Marker (标准参照)。图2是siRNA分子库构建流程示意图。图3是TO-siRNA转录模板-Hl表达框结构示意图。图4是PCR制备的TO-siRNA转录模板-Hl表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图。 图中，最左侧条带是Marker(标准参照)；siRNA3是本发明的23bp的siRNA ；而siRNAl、 siRNA2分别是从siRNA分子库中筛选得到长度为19bp和22bp的另外两个siRNA。图5是表达框转染细胞后实时定量PCR检测Survivin mRNA表达量柱形图， 纵坐标表示Survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平；横坐标表示各处理实验组，其中 siRNAl-siRNA8为siRNA转染的8个实验组，“未转染”为正常细胞未转染组。图6是化学合成的siRNA转染细胞后实时定量PCR检测Survivin mRNA表达量柱 形图，纵坐标表示Survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平，横坐标表示各处理实验组，其 中siRNA2为本发明的siRNA转染实验组，“未转染”为正常细胞未转染组。
具体实施例方式为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它 们表示的意思和范围相同。其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。本发明的siRNA分子来源于针对Survivin基因开放阅读框的功能保守区而制备 的siRNA分子库，本发明所用siRNA分子库技术是百奥迈科生物技术有限公司的专利技术 (中国发明专利申请号为=200710024217. 6，专利名称PCR高通量构建siRNA全位点分子
4库制备方法)，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于Survivin开放阅读框区段，长度 可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶位点的命中率。siRNA的制备可采用多种方法，比如化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载 体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间， 可以更好地获得基因沉默效率。本发明的siRNA分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分。肿瘤疾病包括肝癌、肺癌、 白血病、胃癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤。本发明 的药物对肝癌的抑制作用尤其明显。作为该siRNA分子的一种表达形式，可将其制备成DNA表达框形式，比如启动 子-siRNA转录模板-Hl启动子。为简要起见，在下文中将“TO启动子-siRNA转录模板-Hl启动子”简写为 "U6-siRNA转录模板-Hl，，或“U6-siRNA_Hl，，，它们表示的意思和范围相同。出于应用目的，可将siRNA分子、表达siRNA分子的DNA表达框、或者包含siRNA 分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地 保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应 的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的siRNA的抗肿瘤效果，设计了如下 实验方案(1)构建凋亡抑制因子Survivin基因开放阅读框的siRNA分子库，该分子库中包 含靶向至Survivin基因的siRNA效应分子，长度分布于19_23bp。(2)制备具有相应效应的siRNA表达框，其结构为U6启动子-siRNA转录模板-Hl 启动子，使其更易于体外筛选。(3)运用实时定量PCR技术，检测上述siRNA表达框在细胞中转录出的效应siRNA 分子对Survivin基因的抑制作用。(4)化学合成上述方法筛选得到的最优靶点siRNA，在体外细胞实验中进一步运 用实时定量PCR技术检测Survivin基因的mRNA表达水平。下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。需要说明的是，如无特别注明，下述实施例中的百分比含量皆为重量百分含量
Wt %。实施例1siRNA分子库的制备1.主要仪器、试剂和材料1. 1 仪器=PCR 仪(ABI 公司)；电转仪(BIO-RAD，MicroPulser)；离心机 (Eppendorf)，长波长紫外灯等。1.2 材料和试剂lkb plus DNA Ladder (invitrogen) ；DNase I (Roche)； MnCl2(BBI)；磷酸接头(Sigma-aldrich) ；ATP (BBI) ；BSA (NEB) ；BmsbI (NEB) ；T4DNA 连接酶 (NEB) ；Tag DNA聚合酶(百奥迈科生物技术有限公司)；琼脂糖(BBI) ；dNTP(上海生工生物
5工程技术服务有限公司)；酚氯仿抽提试剂(上海生工生物工程技术服务有限公司)；低分 子量DNA Ladder (NEB) ；EcoPl5I (NEB) ；T4 DNA聚合酶(NEB) ；FokI 酶(NEB) ；SfiI 酶(NEB)； 感受态细胞(invitrogen) ；pTOHl-GFP表达载体(NT Oimcs，USA)。凝胶抽提试剂盒QIAEX II Gel Extration Kit(QIAGEN)；质粒抽提试剂盒(百奥迈科生物技术有限公司)。其他 生化试剂均购于Sigma-aldrich。2. siRNA分子库的构建2. lSurvivin基因开放阅读框的获得由百奥迈科生物技术有限公司全基因合 成 Survivin (GenBankAccessionnumber :NM_001168)开放阅读框(ORF)，基因长度为
429bp (图 1),3
122atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctc
181tacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccga
241ggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctg
301cttcaaggag ctggaaggct gggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagca
361ttcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtga
421atttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaC C 3.3. C 3.3. 3.3.
481gaagaaagaatttgaggaaactgcggagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgc
541catggattga(SEQ ID NO 1)
2. 2siRNA分子库构建用百奥迈科生物技术有限公司的专利技术构建siRNA分子
库(专利申请号为200710024217.6，专利名称PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备 方法)，构建流程见图2。成功构建Survivin开放阅读框的siRNA分子库，随机挑取克隆进行测序，其序列 长度可控性分布在19-23bp之间，显示出位点及长度的多样性。实施例2siRNA表达框的制备与靶位点筛选1.主要仪器、试剂和材料1. 1仪器PCR仪(ABI)；实时定量PCR仪(Bio-Rad)；凝胶电泳设备(北京六一仪 器厂)；长波长紫外灯；细胞培养箱(Thermo)等。I·2 材料和试剂Ikb plus DNA Ladder (invitrogen) ； Pfu DNA 聚合酶(百奥迈 科生物技术有限公司)；Agar0se(BBI) ；dNTP(上海生工生物工程技术服务有限公司)；琼 脂糖凝胶纯化试剂盒(百奥迈科生物技术有限公司)，Lipofectamin 2000 (invitrogen), DMEM J^ # S (Gibco), TurboCapture mRNA kit (QIAGEN), SensiMix One-Step Kit(Quantace)等。其他生化试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。1. 3PCR引物(百奥迈科生物技术有限公司合成)5，U6 启动子引物5，-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3，3，Hl 启动子引物5，-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3，Survivin 正向引物5，-CGACGTTGCCCCCTGCCTG-3，Survivin 反向引物5，-AAGGAAAGCGCAACCGGACGA-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，
2. siRNA表达框的制备2. IPCR扩增制备U6-siRNA转录模板-Hl表达框选取8例Survivin siRNA阳性 克隆质粒为模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通过PCR的方法扩增制备TO-siRNA转录模 板-Hl表达框(图3为表达框示意图)。各PCR反应体系为50 μ 1的反应体系0. 5 μ 1模板DNA(10_50ng)，1 μ 15，U6启动 子引物(ΙΟμΜ),Ιμ 13，Hl 启动子引物(ΙΟμΜ),Ιμ IdNTP (IOmM)，0. 5 μ IPfuDNA 聚合酶， 用ddH20补足到50μ 1。反应条件为:95°C Imin预变性，95°C 15sec变性，58°C 30sec退火， 72°C 30sec延伸，20个循环。1 %琼脂凝胶电泳检测，PCR产物条带单一，片段大小符合实验 要求。2. 2表达框PCR产物纯化1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增得到的表达框，并 用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化凝胶产物。纯化后的DNA再次进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检 测，纯化后的TO-siRNA转录模板-Hl表达框纯度和浓度符合要求，如图4所示。同时用紫 外分光光度计测得制备后的表达框浓度为200-420ng/y 1。3.靶位点筛选3. 1细胞培养肝癌细胞S匪C-7721在含10% 85的01^] 培养基中，371、5%0)2 培养才直培养。3. 2细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按照LipofectaminTM2000的说明书转染，U6_siRNA转录模板-Hl表达框DNA 量按0.2 μ g/孔加入。3. 3实时定量PCR检测Survivin基因mRNA水平用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，按80 μ 1无RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ IRNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中Survivin mRNA表达水平，同时扩增看家基因 GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下25 μ 1反应体系4 μ 1模板 RNA, 12. 5 μ 12 X SensiMix One-Step, 1 μ 15，正向引物(6 μ Μ)，1 μ 13，反向引物(6 μ Μ)， 0. 5 μ 150 X SYBR GreenI，用无RNase水补足体系至25 μ 1。反应条件40°C反转录30min， 95°C预变性 7min，95°C变性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。3. 4结果分析用实时定量PCR 2_Δ ^t法分析实验结果，并作出柱状图，如图5所 示，结果显示对应于Survivin多个位点的siRNA均呈现较好的沉默效果，尤其是siRNA3，相 对于未转染组，其对Survivin基因的沉默效果达到81 %。尤其须需要说明的是，siRNA3正义链序列与Survivin基因开放阅读框中的第 308-330 ^ ( T^'J^rP^ gagctggaaggctgggagccaga) XilSo实施例3化学合成siRNA验证沉默效果1.主要仪器、试剂和材料1. 1仪器核酸合成仪(GE公司)、PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad)； 细胞培养箱(Thermo)等。1. 2 材料和试剂:Lipofectamin 2000 (invitrogen)，DMEM 培养基(Gibco)，TurboCapture mRNA kit (QIAGEN)，SensiMix One-Step Kit(Quantace)等。其他生化试 剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。1. 3PCR引物(百奥迈科生物技术有限公司合成)Survivin 正向引物5，-CGACGTTGCCCCCTGCCTG-3，Survivin 反向引物5，-AAGGAAAGCGCAACCGGACGA-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，2.化学合成制备siRNA利用百奥迈科生物技术有限公司拥有的核酸合成仪(美国GE公司)分别合成 siRNA3的正义链(sense strand)和反义链(antisense strand)的RNA。并进行纯化，将 正义链和对应的反义链退火成siRNA双链(duplex)，分装IOD/管，最后冷冻干燥，转染前用 无RNase水溶解至20 μ Μ。3.沉默效率验证3. 1细胞培养肝癌细胞S匪C-7721在含10% 85的01^] 培养基中，371、5%0)2 培养才直培养。3. 2细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按照LipOfeetaminTM2000的说明书转染，RNA按IOnM/孔加入。3. 3实时定量PCR检测Survivin基因mRNA水平用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μ 1无RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ 1 RNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中Survivin mRNA表达水平，同时扩增看家基 因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ 1反应体系4 μ 1模板 RNA, 12. 5 μ 12 X SensiMixOne-St印，1 μ 15，正向引物(6 μ Μ)，1 μ 13，反向引物(6uM)， 0. 5 μ 150 X SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μ 1。反应条件40°C反转录30min， 95°C预变性 7min，95°C变性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。3. 4结果分析用实时定量PCR2_AAet法分析实验结果，并作出柱状图，如图6所 示，结果显示，靶向至survivin基因的siRNA3的沉默效果达到82%。序列表<110>百奥迈科生物技术有限公司<120> 一种抑制Survivin表达的siRNA分子及其应用<130>PCNBB0901067S<141>2009-07-03<160>5<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>429<212>DNA<213>GenBank Accession number :NM_001168
8
(220)
(221)Survivin基因开放阅读框
(400)l
atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60
acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 1 20
gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180
ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240
tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300
tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360
aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420
atggattga429
<211)24
<212)RNA
<213)人工序列
(220)
(22l>正义链
(222)(1)．．(24)
<223>Nn
(220)
(22 1)mi SC feature
(222)(24)．．(24)
(223)N是C、G、A、T、dC、dG、dA或d／；n是0—2的整数。
(400)2
gagcuggaag gcugggagcc agaNn24
<210)3
<211)24
<212)RNA
<213)人工序列
(220)
(22l>反义链
<223>Nn
(220)
(22 1)mi SC feature
(222)(24)．．(24)
(223)N是C、G、A、T、dC、dG、dA或d／；n是0—2的整数。
(400)3
ucuggcuccc agccuuccag cucNn 24<210>4<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><221> 正义链<222>(1). . (23)<400>4gagcuggaag gcugggagcc aga 23<210>5<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><221> 反义链<222>(1). . (23)<400>5ucuggcuccc agccuuccag cuc 2权利要求
一种双链siRNA分子，其具有如下序列结构正义链5’ GAGCUGGAAGGCUGGGAGCCAGANn 3’(SEQ ID NO2)反义链5’ UCUGGCUCCCAGCCUUCCAGCUCNn 3’(SEQ ID NO3)，其中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n是0～2的整数。
2.如权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述N为dT，且n为2。
3.如权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述n为0。
4.如权利要求1 3中任一项所述的siRNA分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、肺癌、白血病、胃癌、宫颈 癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种可抑制Survivin表达的双链siRNA分子、及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该siRNA分子的正义链为SEQ ID NO2，反义链为SEQ ID NO3，其中，反义链可特异性地与Survivin基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，达到治疗肿瘤的目的。
文档编号C12N15/11GK101935649SQ20091005437
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者孙云成, 朱远源, 李铁军, 王晋康, 陆毅祥 申请人:百奥迈科生物技术有限公司