专利名称：一种脂肽类化合物a21978c的产生菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株 及其应用。
背景技术：
二十世纪80年代初美国礼莱公司的科学家从玫瑰孢链霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)提取出一组具有强烈抑制革兰阳性菌的脂肽类化合物，命名为A21978C，其 结构如图1所示。A21978C化合物主要包括6个组分，依次为:C0、C1、C2、C3、C4和C5，其中，C1、C2、 C3的含量通常较高，C0、C4、C5的含量相对较低。A21978C化合物具有共同的母核。A21978C 化合物的基本结构由13个氨基酸组成，其中的十个氨基酸组成一个环肽，另有3个氨基酸 排列成线状，这三个氨基酸末端的L-色氨酸接着一个长度不等的脂肪酸链。
发明内容
本申请的发明人利用氯化锂作为助变剂，对玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus) ATCC 31568进行紫外诱变，获得了玫瑰孢链霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)突变株。对该突变株进行发酵培养，获得的发酵液中，A21978C化合物的产量 较出发菌株玫瑰孢链霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)ATCC 31568有明显提高。因此，本发明的目的在于，提供一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株，以用于生 产A21978C化合物。本发明的另一个目的在于，提供所述菌株的应用，即用于发酵生产A21978C化合 物。本发明提供的脂肽类化合物A21978C的产生菌株，其保藏号为CGMCCNo. 2346。本发明提供的菌株发酵生产脂肽类化合物A21978C，其生产能力较玫瑰孢链霉菌 (Streptomyces roseosporus) ATCC 31568 提高了 185%，且遗传稳定性也较好。
图1是A21978C化合物母核及三个主要组份的结构式。本发明的脂肽类化合物A21978C的产生菌株已于2008年1月16日提交位于 北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No. 2346.
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。发明人利用氯化锂作为助变剂，对玫瑰孢链霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)ATCC 31568进行紫外诱变，获得了玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)突变株。对 该突变株进行发酵培养，获得的发酵液中，A21978C化合物的产量较出发菌株玫瑰孢链霉菌 (Streptomyces roseosporus) ATCC 31568 有显著提高。在本发明的下述实施例中，使用的培养基配方如下斜面培养基硝酸钾0. 1 %，可溶性淀粉2. O %，磷酸氢二钾0. 05 %，七水硫酸镁 0. 05%，氯化钠 0. 05%，硫酸铁 0. 001%，琼脂 2. 0%, pH7. 2-7. 4。固体平板培养基配方同斜面培养基。种子培养基葡萄糖2.0%，甘油2.0%，淀粉6.0%，黄豆粉5.0%，磷酸二氢钾 0. 02%,硫酸镁 0. 02%, pH7. 5。发酵培养基黄豆饼粉2.2%，糊精3.6%，葡萄糖0. 825 %，硫酸亚铁铵0. 066 %， ρΗ7· 5。在本发明的下述实施例中，HPLC检测条件如下分析系统=AgilentllOO型液相色谱仪，自动进样器，VffD检测器；色谱柱十八烷基硅烷键和反相柱；检测波长2IOnm;流动相乙腈和水混合液为洗脱液，其中加有0. 5%磷酸二氢铵。采用梯度洗脱，洗脱方式如表1所示。表1、HPLC洗脱方案
Omin15min17min乙腈水=10 9025%0%0%乙腈水=45 5575%100%100%流速1·5ml/min ；柱温35°C；进样量20μ 1。实施例1、菌株诱变在菌株ATCC 31568斜面上加入灭菌的4%的LiCl溶液，然后，用无菌接种铲刮取 培养物表面的孢子，制成粗制的孢子悬液；再将此悬液倒入装有玻璃珠的三角摇瓶中振荡， 以打散孢子，然后用装有脱脂棉的漏斗过滤悬液，振荡摇勻，获得单孢子悬液。将单孢子悬液放在28°C摇床间震荡培养4h后，用灭菌的4%的LiCl溶液调整孢 子数量至IO8个/ml，加5ml于直径为6cm的无菌平皿中，于15W紫外灯下30cm处照射，其 中，辐射波长260nm，恒速搅拌下照射30s，避光修复Ih后，经适当稀释后，涂布于装有固体 平板培养基的平皿上，于28°C避光培养5 7d，获得单菌落生长平皿。用灭菌后的接种铲从单菌落生长的平皿上挑取孢子，涂布到装有斜面培养基的试 管中，28°C恒温培养5 7d，获得孢子固体斜面。实施例2、菌株筛诛2. 1、菌株培养
取实施例1获得的孢子固体斜面，铲取Icm2左右的培养物，接种至灭菌后的种子 培养基中进行培养，其中，摇床转速为220rpm，培养温度为28°C，培养时间为48h。然后，以4%的比例吸取生长良好的种子培养液至灭菌后的发酵培养基中，于 220rpm、28°C，培养时间 6d。2. 2、菌株筛选将步骤2. 1中获得的发酵液离心，离心上清与甲醇以适当的比例混合，振荡摇勻 并静置30min后，于12000rpm离心10分钟，取上清液，HPLC检测A21978C化合物产量(以 Cl、C2、C3三个主要产物峰的积分面积计)，同时，以ATCC 31568为对照。根据HPLC检测结果，选取发酵液中A21978C化合物产量最高的菌株，重复实施例 1和实施例2的步骤，经过多次菌株诱变和菌株筛选，得到了一株A21978C化合物的高产菌 株HCCB10108，经发酵培养获得发酵液，并使用HPLC对发酵液进行了检测，其中，C1、C2、C3 组分含量及三个组分的总含量分别如表2所示。表2、HCCB10108 与 ATCC 31568 发酵检测结果 表2的结果显示，HCCB10108较原始菌株ATCC 31568产量提高了 185%。菌株HCCB10108已于2008年1月16日提交位于北京的中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No. 2346。实施例3、稳定性检测为考察CGMCC No. 2346的遗传稳定性，将CGMCC No. 2346在斜面上连续传五代。 并取每一代斜面培养获得的菌株进行摇瓶二级发酵和效价测定，并计算每代菌株的平均效 价，结果如表3所示，其中，以CGMCC No. 2346 FO代的平均效价为100%。表3、菌株CGMCC No. 2346的传代稳定性检测结果 表3结果显示，菌株CGMCC No. 2346经过连续五代斜面传接后，F1-F5代的相对生 产能力为F0代的相对生产能力的97% -108%，波动很小。根据表3结果，菌株CGMCC No. 2346基本没有出现退化现象，在提高产能的同时其 遗传稳定性也较好。综上所述，本发明提供的菌株发酵生产脂肽类化合物A21978C，其生产能力较玫瑰 孢链霉菌(Str印tomyces roseosporus)ATCC 31568提高了 185%，且其遗传稳定性也较好。
权利要求
一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株，其特征在于所述菌株保藏号为CGMCC No.2346。
2.权利要求1所述的菌株的应用，其特征在于用于生产脂肽类化合物A21978C。
全文摘要
本发明提供了一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株。本发明提供的脂肽类化合物A21978C的产生菌株的保藏号为CGMCC No.2346。本发明提供的菌株发酵生产脂肽类化合物A21978C，其生产能力较出发菌株提高了185％，且其遗传稳定性较好。
文档编号C12R1/465GK101928677SQ20091005390
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者夏兴, 孟根水, 张定丰, 戈梅, 朱丽, 殷瑜, 罗敏玉, 阮丽军, 陈代杰, 齐晓丹 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司;浙江医药股份有限公司新昌制药厂