专利名称：一种抑制Bcl-2基因表达的siRNA分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制Bcl-2基因表达的siRNA分子及其应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是1998年首次报道的一种转录后的基因沉 默效应，是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA识别有同源序列的mRNA，对其特 异性切割，从而阻断其翻译的过程(Nature. 1998，391 :806_811)。RNAi发挥基因沉默作用 的机制是长dsRNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物通常是长度 为20-25bp，且在每个链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA(siRNA)。siRNA双链中 的一条，一般是反义链掺入到RNA-诱导的沉默复合物中(RISC)，与互补的序列配对。RISC 首先介导siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合， 之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制转录该mRNA 的基因的表达。与传统的抑制基因表达的反义寡核苷酸技术和核酶技术相比，siRNA沉默 基因表达的效果要强大数十倍至数百倍，现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗 中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。恶性肿瘤是危害人类生命和健康的主要疾病之一，但尚无有效的根治方法。近 年来的研究发现肿瘤的发生、发展及多药耐药现象与细胞凋亡障碍密切相关。Bcl-2基因 是广泛存在于恶性肿瘤细胞中的一种癌基因，定位于18q21上，因其具有抑制细胞凋亡和 延长细胞存活的功能而被称为“存活基因”。Bcl-2基因编码的蛋白主要分布于线粒体内 膜、核膜和内质网上，目前认为，Bcl-2蛋白能够稳定线粒体膜电压、阻止线粒体释放Cyt C、AIF等细胞因子，抑制或阻断多种因素诱发的细胞凋亡，在线粒体凋亡途径的调控中起 中心调控因子的作用(Nature. 1999，399 :483-487)。正常机体组织中，Bcl_2分布比较局 限，主要在胚胎早期组织、成熟淋巴细胞、增生活跃的上皮细胞和神经元等组织表达，但在 膀胱癌、鼻咽癌、结-直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等许多肿瘤中异常高表 达，且其表达水平常与肿瘤细胞对多种化疗药物及Y射线的耐受相关(J CellBiochem, 1996. 60 23-32)。因此，抑制肿瘤细胞中过度表达的Bcl_2，恢复其正常的凋亡通路及增加 其对化疗药物和放疗的敏感性是治疗肿瘤的新策略。此外，Bcl-2在正常细胞中分布局限， 因而这一治疗策略比传统的细胞毒药物具有选择性更好，毒性更低的优势(Cell，1993，75 229-240)，可能成为非常有效的单独治疗或增加放、化疗药物效果的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种特异性的靶向Bcl-2基因，抑制其表达，从而抑制肿瘤细胞 生长，具有抗癌作用的siRNA双链序列，并提供了该siRNA序列在肿瘤基因治疗中的应用。本发明所述的一组抑制Bcl-2基因表达的siRNA双链，其序列为si-B-3 正义链5，-GUACGAUAACCGGGAGAUAdTdT-3，(SEQID NO 1)
反义链5，-UAUCUCCCG⑶UAUCGUACdTdT-3，(SEQID NO 2)其中，dT是脱氧胸腺嘧啶。换言之，该双链SiRNA分子的主干序列为正义链5，-GUACGAUAACCGGGAGAUA-3，(SEQID NO 3)反义链5，-UAUCUCCCG⑶UAUCGUAC-3，(SEQID NO 4)在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本发明根据GenBank提供的人Bcl_2基因的cDNA序列，使用在线设计siRNA软 件设计了 5对针对Bcl-2的长度为21个核苷酸的siRNA序列，分别记为si_B_l，si-B-2, Si-B-3，si-B-4，si-B-5，每种siRNA的3’末端有两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)，呈单链悬挂 状态。所述siRNA序列由百奥迈科生物技术有限公司合成。本发明还涉及用实时定量PCR 法检测5种siRNA转染到人膀胱癌细胞系T24后，抑制Bcl_2基因的mRNA表达的情况，结果 表明，si-B-3抑制了 88%的Bcl-2mRNA的表达(图1)。本发明还涉及了蛋白印迹(Western Blot)法进一步检测si-B-3对Bcl-2蛋白表达的影响(图2，图3)，结果表明，si_B3在蛋 白水平也显著抑制了 Bcl-2的表达，抑制率为83. 2%。本发明还涉及用WST-8法检测所述 si-B-3抑制细胞增殖的作用，结果见图4和图5，结果表明转染了 si-B-3的T24细胞从转 染后48h生长即被抑制，在转染后第96h抑制效果最佳，此时，转染si-B-3的抑制率达到了 31%。综上所述，本发明提供了一种特异抑制Bcl-2基因表达的siRNA序列，这一种siRNA 在mRNA水平和蛋白质水平均有效的抑制了 Bcl-2这一抗凋亡基因的表达，最终显著抑制了 肿瘤细胞的生长和增殖，有望应用于抗肿瘤药物中。
图1是实时定量PCR法检测转染siRNA后Bcl_2基因mRNA的表达量柱形图。纵 坐标表示Bcl-2基因mRNA表达水平；横坐标表示处理实验组。图2是Western Blot法检测转染siRNA后Bcl_2蛋白表达条带图。图3是Bcl-2蛋白相对表达水平灰度分析结果柱形图，其中*表示与未处理组相 比P <0.01，有极显著差异。图4是转染了不同siRNA序列后T24细胞的生长曲线图。图5是与阴性对照相比各组siRNA抑制T24细胞生长的抑制率柱形图。
具体实施例方式本发明中诸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等术语可以互换，其表示的 意思和范围相同。其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。本发明的siRNA分子来源于针对Bcl-2基因开放阅读框设计的siRNA，长度为 21nt，3’末端有两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)，呈单链悬挂状态。siRNA的制备可采用多种方法，比如化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载 体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间， 可以更好地获得基因沉默效率。本发明的siRNA分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分。
出于应用目的，可将SiRNA分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如 病灶组织。本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地 保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应 的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的siRNA的抗肿瘤效果，设计了如下 实验方案(1)设计靶向于Bcl-2基因的siRNA分子，长度为21nt，3’末端悬挂有两个脱氧核 糖核苷酸(dTdT)。(2)化学合成制备siRNA分子，由百奥迈科生物技术有限公司合成，双链siRNA纯 度> 95%，用无核酸酶水溶解后可直接用于细胞转染。(3)运用实时定量PCR技术，检测上述siRNA在细胞中对Bcl-2基因的抑制作用。(4)运用Western Blot技术，检测上述siRNA抑制Bcl_2蛋白表达的情况。下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。实施例1siRNA的设计与合成根据GenBank数据库中人源性Bcl_2基因开放阅读框(ORF)的序列，用 Invitrogen和Thermo公司的设计软件设计siRNA序列，经si-search软件评分并在人类 EST数据库中比对，确定靶基因的唯一性，以人类基因无同源性的siRNA序列为阴性对照 SiRNA0上述siRNA由百奥迈科生物技术有限公司合成，双链siRNA纯度> 95%，用无核酸 酶水溶解后可直接用于细胞转染。实施例2siRNA的细胞转染人膀胱癌细胞系T24用含10%胎牛血清的1640培养基，37°C、5% CO2条件下培养。 取生长状态良好的T24细胞，转染前一天铺6孔细胞培养板，调整每孔的细胞数，使第二天 细胞汇合度达到30%左右。设置7个实验组，分别为
权利要求
一种抑制Bcl 2基因表达的siRNA分子，其特征在于，具有如下序列结构正义链5’ GUACGAUAACCGGGAGAUAdTdT 3’SEQ ID NO1反义链5’ UAUCUCCCGGUUAUCGUACdTdT 3’SEQ ID NO2其中，dTdT是脱氧胸腺嘧啶。
2.如权利要求1所述的抑制Bcl-2基因表达的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA 分子靶向于人源性Bcl2基因。
3.如权利要求1或2所述的siRNA分子在抗肿瘤的基因治疗中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为膀胱癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌、胃 癌、结直肠癌、前列腺癌和乳腺癌中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种靶向人源性Bcl-2基因的双链siRNA分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该siRNA分子正义链为SEQ ID NO1，反义链为SEQ ID NO2，其中，反义链可特异性地与Bcl-2基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，达到抗肿瘤的目的。
文档编号C12N15/113GK101974533SQ20101052193
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者彭薇, 朱远源, 李铁军, 王晋康, 秦银超 申请人:百奥迈科生物技术有限公司