BANCR长链非编码RNA及其小分子抑制剂在抑制卵巢癌肝转移中的应用的制作方法

本发明属于基因治疗领域，涉及基因靶标及其抑制剂的应用，具体涉及lncrnabancr及其小分子抑制剂在抑制卵巢癌肝转移中的应用。
背景技术：
：肝脏为常发生恶性肿瘤转移的器官之一。手术切除是肝转移癌的有效治疗手段。然而，约80-90％的肝转移癌患者由于肝功能不能代偿、转移癌大和数目多、原发病进展等原因不能行手术切除。对于不能手术切除的肝转移癌，多采用全身化疗、经肝动脉介入治疗或姑息性治疗，效果不能令人满意。采用基因治疗手段，在分子水平上对恶性肿瘤的肝转移潜能进行抑制，是降低恶性肿瘤肝转移发生率，改善预后的希望(exploringgeneexpressionsignaturesforpredictingdiseasefreesurvivalafterresectionofcolorectalcancerlivermetastases,plosone,2012；inhibitionofchemokinereceptorexpressiononuvealmelanomasbycxcr4sirnaanditseffectonuvealmelanomalivermetastases,investophthalmolvissci,2009)。非编码rna是指不编码蛋白质的rna，其中包括rrna、trna、snrna、snorna、mirna及长链非编码rna(lncrna)。lncrna是一类长度大于200碱基的rna分子，由于缺少有效的开放式阅读框不编码蛋白，但具备复杂的生物学功能并在各种生物过程中发挥重要的作用，如染色质修饰、x染色体的失活、参与基因转录、翻译以及到蛋白活动调控等，其变异和调节能够导致包括肿瘤在内的多重疾病。异常表达的lncrna可通过不同途径和不同作用机制参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移的各个阶段，是肿瘤进展的关键因素。近年来研究表明异常表达的lncrna通过多重途径参与了肿瘤细胞的凋亡、増殖、侵袭与转移等调控，与肝癌等肿瘤的发生与转移具有密切的关系。braf激活的非编码rna(bancr)为693bp的长链非编码rna，首先在黑色素瘤细胞中被发现，随后，甲状腺乳头状癌、视网膜母细胞癌、肺癌、胃癌、结直肠癌和肝癌中均发现lncrnabancr表达异常。目前，尚未有研究证明lncrnabancr及其小分子抑制剂与抑制卵巢癌肝转移有关。技术实现要素：本发明目的在于提供lncrnabancr及其小分子抑制剂在抑制卵巢癌肝转移中的应用。实现本发明上述目的技术方案如下：lncrnabancr作为药物靶标在制备抑制卵巢癌肝转移的药物中的应用。lncrnabancr的抑制剂在制备抑制卵巢癌肝转移的药物中的应用。优选地，所述抑制剂为具有如下结构通式的吡咯并嘧啶酮类小分子化合物，其中，r为烷基。优选地，所述抑制剂选自如下结构的化合物：一种用于抑制卵巢癌肝转移药物组合物，含有上述任一抑制剂。本发明的突出优点：本发明发现吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ可显著抑制ho-8910pm细胞中lncrnabancr的表达，从而抑制ho-8910pm细胞的运动侵袭，抑制ho-8910pm细胞在裸鼠体内侵袭肝脏形成肝转移癌的能力。吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ及其他lncrnabancr的抑制剂可以用于开发制备成抑制卵巢癌肝转移的药物。附图说明图1为各组ho-8910pm细胞bancrmrna相对表达水平；图2为各组ho-8910pm细胞e-cadherin和vimentin相对表达水平；图3为各组ho-8910pm细胞运动抑制率(％)和侵袭抑制率(％)；图4为各组肝转移癌发生率(％)。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料人卵巢癌高转移细胞ho-8910pm购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。4周龄健康雌性balb/c裸鼠，体重为19-21g，购自南京大学动物中心。吡咯并嘧啶酮ⅰ、ⅱ、ⅲ由本公司合成部按照文献方法合成，结构经核磁确证。用dmso溶解制成1mg/ml的母液，根据需要稀释至不同浓度。rpmi-1640培养基购自gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程和材料研究所；transwell小室购自corning公司。二、实验方法1、细胞培养和分组复苏培养人卵巢癌细胞ho-8910pm。以含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(含双抗)常规培养于37℃、5％co2和相对湿度95％的恒温培养箱中。细胞经过消化传代，取对数生长期的细胞进行培养及实验。实验前用台盼蓝拒染法确保所用细胞拒染率在95％以上。给药组分组和给药浓度如下：吡咯并嘧啶酮ⅰ组：培养液中含终浓度为5μm、20μm的吡咯并嘧啶酮ⅰ；吡咯并嘧啶酮ⅱ组：培养液中含终浓度为5μm、20μm的吡咯并嘧啶酮ⅱ；吡咯并嘧啶酮ⅲ组：培养液中含终浓度为5μm、20μm的吡咯并嘧啶酮ⅲ。2、rna提取和rt-pcr检测bancrmrna相对表达水平将ho-8910pm细胞消化计数后加入6孔板，细胞密度为2×105/ml，细胞贴壁后，加入吡咯并嘧啶酮5μm、20μm培养24h，收集细胞，测定bancr相对表达水平。另设置对照组，对照组不添加吡咯并嘧啶酮。使用trizol试剂(invitrogen公司)提取总rna。使用primescriptrt试剂盒(takara公司)在标准条件下的随机引物，将总rna(500ng)反转录为10μl的最终体积。bancr表达水平的检测按照stbrpremixextaq(takara公司)的使用说明进行。通过2-δδct方法，根据内参gapdh含量计算bancrmrna的相对表达水平。lncrnabancr和gapdh的rt-pcr引物如下：bancr上游引物：5’-acaggactccatggcaaacg-3’；bancr下游引物：5’-atgaagaaagcctggtgcagt-3’；gapdh上游引物：5’-accacagtccatgccatcac-3’；gapdh下游引物：5’-tccaccaccctgttgctgta-3’。3、westernblot检测蛋白表达通过检测e-cadherin和vimentin蛋白的浓度可以间接得出bancr的表达水平。将ho-8910pm细胞消化计数后加入6孔板，细胞密度为2×105/ml，细胞贴壁后，加入吡咯并嘧啶酮5μm、20μm培养24h，收集细胞，测定e-cadherin和vimentin蛋白相对表达水平。另设置对照组，对照组不添加吡咯并嘧啶酮。使用哺乳动物蛋白提取试剂ripa，并补充部分蛋白酶抑制剂混合物和苯甲基磺酰氟化物来溶解细胞。用bio-rad蛋白分析盒确定蛋白浓度。取50μg蛋白提取物进行10％的sds-page实验，将蛋白质转到硝酸纤维素膜(sigma公司)，并用1：1000稀释的e-cadherin抗体(bd公司)、vimentin抗体(cellsignalingtechnology公司)孵育。通过凝胶图像处理系统(quantityone软件，bio-rad公司)对放射自显影图片进行量化，以gapdh作为对照，测定e-cadherin和vimentin蛋白相对表达水平。4、transwell法检测ho-8910pm细胞运动侵袭能力在24孔培养板中每孔加入含有10μg/ml纤维黏连蛋白的rpmi-1640培养基600μl。收集对数生长期的ho-8910pm细胞，分别用加吡咯并嘧啶酮(5μm、20μm)和未加吡咯并嘧啶酮的rpmi-1640培养基重悬，并调整浓度为1×106/ml。将transwell小室浸于24孔板的条件培养基中，每个小室加细胞悬液100μl，置37℃、5％co2培养箱内培养6h。将transwell小室取出，滤膜用甲醇固定1min，结晶紫染色15min，水洗，棉签小心擦去未穿膜的细胞，中性树胶封片，于400倍显微镜下计数穿过滤膜的细胞数。每膜计数上下左右中5个随机不同视野，每组平行设3个滤膜。按下面的公式计算运动抑制率(％)。侵袭试验时在transwell小室膜的内表面涂基底膜成分matrigel5μg(10μl)，超净台通风过夜使之干燥，形成人工重组基底膜，其余步骤同细胞运动实验。按下面的公式计算计算侵袭抑制率(％)：运动抑制率(％)＝(对照组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数×100％；侵袭抑制率(％)＝(对照组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数×100％。5、裸鼠卵巢癌肝转移模型观察癌细胞转移能力40只裸鼠饲养于spf环境下，随机分为吡咯并嘧啶酮ⅰ组、吡咯并嘧啶酮ⅱ组、吡咯并嘧啶酮ⅲ组和正常对照组，每组10只，进行卵巢癌细胞成瘤实验。裸鼠称重、麻醉后开腹，暴露脾脏。收集对数生长期ho-8910pm细胞1×106个，重悬于0.1ml生理盐水后，于裸鼠脾脏缓慢注射约5min。压迫注射针孔止血3min，防止肿瘤经腹腔转移后关腹，操作过程遵循无瘤原则。裸鼠种植癌细胞当日开始，各组每日尾静脉分别注射吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ、吡咯并嘧啶酮ⅲ5mg/kg，对照组注射等量生理盐水，连续注射28天。最后一次注射8小时后取裸鼠肝脏，行2mm厚度连续切片，观察有否肝转移癌形成，统计发生肝转移癌裸鼠数目和平均成瘤数量，并按如下公式计算肝转移癌发生率(％)：肝转移癌发生率(％)＝发生肝转移裸鼠数/本组裸鼠总数×100％。实验过程中，各组均没有裸鼠死亡，每组最终裸鼠总数均为10只。6、统计学方法采用spss16.0统计软件进行数据分析，以p<0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1、吡咯并嘧啶酮对ho-8910pm细胞bancrmrna相对表达水平的影响与对照组相比，吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ给药组ho-8910pm细胞bancrmrna相对表达水平均显著降低(p＜0.05)，且高浓度组(20μm)比低浓度组(5μm)ho-8910pm细胞bancrmrna相对表达水平降低更为显著。表1和图1为各组ho-8910pm细胞bancrmrna相对表达水平比较。表1各组ho-8910pm细胞bancrmrna相对表达水平2、吡咯并嘧啶酮对ho-8910pm细胞bancr表达水平的影响已知lncrnabancr参与了内皮细胞间质化途径的调节，lncrnabancr表达下调会导致vimentin下调和e-cadherin上调，通过检测e-cadherin和vimentin蛋白的浓度可以间接得出bancr的表达水平。与对照组相比，吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ给药组ho-8910pm细胞vimentin的表达水平均显著降低(p＜0.05)，e-cadherin的表达水平均显著升高(p＜0.05)，且高浓度组(20μm)比低浓度组(5μm)降低或升高更为显著。表2和图2为各组ho-8910pm细胞e-cadherin和vimentin相对表达水平比较。表2各组ho-8910pm细胞e-cadherin和vimentin相对表达水平3、吡咯并嘧啶酮对ho-8910pm细胞运动侵袭能力的影响与对照组相比，吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ给药组ho-8910pm细胞的运动和侵袭能力均显著降低(p＜0.05)，且高浓度组(20μm)比低浓度组(5μm)受抑制作用更为显著。表3和图3为各组ho-8910pm细胞运动抑制率(％)和侵袭抑制率(％)。表3各组ho-8910pm细胞运动抑制率(％)和侵袭抑制率(％)4、吡咯并嘧啶酮对裸鼠卵巢癌肝转移发生率的影响观察期内，各组均没有裸鼠死亡，每组最终裸鼠总数均为10只。与对照组相比，吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ给药组肝转移癌发生率(％)显著降低(p＜0.05)。各组发生肝转移裸鼠数及肝转移癌发生率(％)见表4和图4。表4各组发生肝转移裸鼠数及肝转移癌发生率(％)发生肝转移裸鼠数(只)肝转移癌发生率(％)吡咯并嘧啶酮ⅰ组110吡咯并嘧啶酮ⅱ组110吡咯并嘧啶酮ⅲ组110对照组10100上述实验可以发现，吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ可以显著抑制ho-8910pm细胞中lncrnabancr的表达，从而显著抑制ho-8910pm细胞的运动侵袭能力，抑制ho-8910pm细胞在裸鼠体内侵袭肝脏形成肝转移癌的能力。吡咯并嘧啶酮ⅰ、吡咯并嘧啶酮ⅱ和吡咯并嘧啶酮ⅲ及其他lncrnabancr的抑制剂可以用于开发制备成抑制卵巢癌肝转移的药物。上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。当前第1页12