一种HPV‑16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法与流程

本发明属于宫颈癌技术领域，尤其涉及一种HPV-16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法。

背景技术：

目前，宫颈癌是全球女性第二大常见生殖系统恶性肿瘤。研究已证实高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染是发生宫颈癌的必要病因。然而，约80％的女性在50岁之前都曾感染过HPV，其中绝大多数可在一年内自限清除，仅10％左右发生持续感染，最终约1％逐步进展为宫颈癌。

因此，仅依靠检测HPV感染阳性作为宫颈癌高危人群判断标准，不符合人群筛查的成本-效益原则，势必增加社会卫生经济负担，以及个人和家庭的精神负担；HPV感染者中真正成癌的比例较低，有大批HPV感染者的分流、分诊存在不确定性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种HPV-16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法，旨在解决依靠检测HPV感染阳性作为宫颈癌高危人群判断存在大批HPV感染者的分流、分诊存在不确定性的问题。

本发明是这样实现的，一种HPV-16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法，包括以下步骤：

步骤一，收集子宫颈口内外的脱落细胞，将沾有细胞物的小刷子放入装有保存液的标本储存瓶里；采用DNA提取试剂盒提取宫颈脱落细胞中HPV病毒和人类基因组的总DNA，用于HPV的PCR检测和人类基因遗传变异位点的分型检测；

步骤二，PCR反应体系为：总体积20μl，含有约50ng模板DNA,12.5pmol每种引物，0.1mM每种单核苷酸，10×PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂和1.0单位Taq酶；10×PCR缓冲液为50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1％Triton X-100；取5ul PCR产物与1ul溴酚蓝混匀后上样，于3％琼脂糖凝胶80V电泳40分钟，紫外凝胶成像分析系统观察条带位置可明确HPV型别；

步骤三，选取的人类免疫相关通路的核心基因，包括了IL17A、IL23R、IL12R、TLR1、TLR3、TLR9。使用ABI 7900HT实时荧光定量PCR仪进行基因分型；

步骤四，实时荧光定量PCR反应条件：50℃2min，95℃15s，60℃1min，循环次数为45次。扩增循环结束后，读取扩增后荧光信号，运用SDS2.0软件进行基因型判读。

进一步，所述PCR反应条件：

第一步，95℃预变性5min；

第二步，95℃变性30s；

第三步，采用各型别引物退火温度复性40s；

第四步，72℃引物延伸45s，第二步至第四步重复35个循环；

第五步72℃延伸10min。

进一步，所述核心基因的潜在功能性多态位点筛选方法如下：使用NCBI dbSNPs数据库进行多态性位点的筛选，选点原则包括：(1)位于潜在功能性区域，即基因编码区、5’侧翼区即转录起始位点上游2kb以内的区域、5’非翻译区、3’UTR；(2)在中国人群中的最小等位基因频率≥0.05；(3)如果多个位点间存在高连锁不平衡，仅选择其中一个位点作为代表。

进一步，所述ABI 7900HT实时荧光定量PCR仪每块384孔反应平板中5ul反应体系，含有MasterMix 2ul，正、反向引物各0.25ul，TaqMan探针各0.125ul，DNA样本0.5ul，双蒸水1.25ul。

进一步，所述基因分型的引物和探针序列如下：

IL17A rs2275913引物F:GGGGTGACACCATTTTGGTTA

R:ATGAATTTCTGCCCTTCCCA

探针FAM-AGAATCTCTCCTTCTGAA-MGB

HEX-AGAATCTCTTCTTCTGAAG-MGB

IL23R rs1884444引物F:CCTAATCAAAGGTTCCCATCA

R:ACCATACCTCCATGACACCAG

探针FAM-CATGAATCAGGTCACTA-MGB

HEX-CATGAATCATGTCACTAT-MGB

IL23R rs6682925引物F:AATGAAATCAGCACCATGAGAG

R:TTATGGCTGCATAATATTCCTGTA

探针FAM-TATTCCACTAATAGGCACTT-MGB

HEX-ATTCCACTGATAGGCA-MGB

IL12R rs11209046引物F:TGCGGCCCAGAGCAC

F:CCCCGACCCCGAGTCA

探针FAM-CACTCACCGCGTGTCG-MGB

HEX-CACTCACCACGTGTCG-MGB

IL12R rs1874396引物F:TGAGACCAGTCATGACCACCTT

R:AAAACAAATCAACCTAGTTCTATAGATGAAGACA

探针FAM-CTTTTACCTTGGTGTTTAC-MGB

HEX-CCTTTTACATTGGTGTTTAC-MGB

TLR1rs5743551引物F:AGTAGTGGGGATGAGTCTGTGGG

R:TTGTGAATCCAGGCTGAGGG

探针FAM-TGCTGAGAAGCTTC-MGB

HEX-TGCTGAGGAGCTTC-MGB

TLR3rs3775291引物F:ATTTGTATCACTTGCTCATTCTCCC

R:CCCAACCAAGAGAAAGCATCA

探针FAM-TACACATACTCAACCTAAC-MGB

HEX-TACACATATTCAACCTAAC-MGB

TLR9rs187084引物F:GGGTGTACATAATTCAGCAGATATCAA

R:TCATGGTTTATTGTATATCGTCTTATTCC

探针FAM-CTGCCCTTAAGAAG-MGB

HEX-TGCCCTCAAGAAG-MGB

HLA-DP rs3077引物F:TCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTG

R:GAGCTTGAAGGGTCAGCAATTC

探针FAM-AAACTACCCCAGTGGC-MGB

HEX-AAACTACTCCAGTGGCT-MGB

HLA-DP rs9277535引物F:AATGGTGAGCAGACTGCAAATCT

R:TGGTAATGATAAAACATGCTCTCAGTAA

探针FAM-ATAGGACCCGTATTC-MGB

HEX-ATAGGACCCATATTC-MGB

HLA-DQ rs2856718引物F:GAGCTCCCTCTGGCAGGTT

R:TATGCTTTCACCAACTTCCTTCAC

探针FAM-AGAGCTGTTTAATCC-MGB

HEX-AGAGCTGTCTAATCC-MGB

HLA-DQ rs7453920引物F:TTTAGGGAGGTAAGAGGGAAAGC

R:CGAGAACGCCCTGATCTAAGA

探针FAM-ACCGATTCGACATTG-MGB

HEX-ACCGATTCAACATTG-MGB。

本发明提供的HPV-16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法，综合HPV和宿主双方因素，能够有效提高对宫颈癌发病的预警能力，有利于开展符合成本-效益的宫颈癌筛查，为宫颈癌预防关口前移，从而采取合理诊治提供了可靠的生物标志物和检测手段。本发明首次发现HPV-16与宿主遗传因素的联合效应显著增加了宫颈癌的发病风险，与携带rs3077GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，携带GA/AA基因型且感染HPV-16的女性发生宫颈癌的风险增加了3.11倍(OR＝4.11,95％CI＝2.62-6.49)；与携带rs3775291GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，携带GA/AA基因型且感染HPV-16的女性发生宫颈癌的风险增加了2.64倍(OR＝3.64,95％CI＝2.30-5.75)；因此，联合HPV型别和宿主遗传因素可有效预测宫颈癌发病风险，综合指标的灵敏度和特异度优于单独检测HPV。

附图说明

图1是本发明实施例提供的HPV-16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法流程图。

图2是本发明实施例提供的与感染者的对比示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例的HPV-16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法包括以下步骤：

S101：收集子宫颈口内外的脱落细胞，将沾有细胞物的小刷子放入装有保存液的标本储存瓶里；采用DNA提取试剂盒提取宫颈脱落细胞中HPV病毒和人类基因组的总DNA，用于HPV的PCR检测和人类基因遗传变异位点的分型检测；

S102：PCR反应体系为：总体积20μl，含有约50ng模板DNA,12.5pmol每种引物，0.1mM每种单核苷酸，10×PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1％Triton X-100)，1.5mM MgCl₂和1.0单位Taq酶；取5ul PCR产物与1ul溴酚蓝混匀后上样，于3％琼脂糖凝胶80V电泳40分钟，紫外凝胶成像分析系统观察条带位置可明确HPV型别；

S103：选取的人类免疫相关通路的核心基因，包括了IL17A、IL23R、IL12R、TLR1、TLR3、TLR9。使用ABI 7900HT实时荧光定量PCR仪进行基因分型；

S104：每块384孔反应平板中5ul反应体系，含有MasterMix 2ul，正、反向引物各0.25ul，TaqMan探针各0.125ul，DNA样本0.5ul，双蒸水1.25ul。实时荧光定量PCR反应条件：50℃2min，95℃15s，60℃1min，循环次数为45次。扩增循环结束后，读取扩增后荧光信号，运用SDS2.0软件进行基因型判读。

所述HPV-16与宿主遗传因素的联合效应的测试方法采用流行病学的病例-对照研究设计，病例为中国医学科学院肿瘤医院(CIHCAMS)确诊的新发宫颈癌患者，对照来源于同期参加CIHCAMS宫颈癌筛查项目进行妇科检查的健康人群。由医务人员使用专门的HPV采样刷与研究对象的子宫颈口外部分充分接触并逆时针旋转5次(2.5个整圈)，以收集子宫颈口内外的脱落细胞。将沾有细胞物的小刷子放入装有保存液的标本储存瓶里。采用QIAGEN公司生产的DNA提取试剂盒提取宫颈脱落细胞中HPV病毒和人类基因组的总DNA，用于后续HPV的PCR检测和人类基因遗传变异位点的分型检测。中国人群中最常见的4种HPV的分型检测引物见表1，PCR反应体系为：总体积20μl，含有约50ng模板DNA,12.5pmol每种引物，0.1mM每种单核苷酸，10×PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1％Triton X-100)，1.5mM MgCl₂和1.0单位Taq酶。反应条件：第一步95℃预变性5min，第二步95℃变性30s，第三步采用各型别引物退火温度复性40s，第四步72℃引物延伸45s，第二步至第四步重复35个循环，第五步72℃延伸10min。取5ul PCR产物与1ul溴酚蓝混匀后上样，于3％琼脂糖凝胶80V电泳40分钟，紫外凝胶成像分析系统观察条带位置可明确HPV型别。选取的人类免疫相关通路的核心基因，包括了IL17A、IL23R、IL12R、TLR1、TLR3、TLR9。这些基因的潜在功能性多态位点筛选方法如下：使用NCBI dbSNPs数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp,build 127)进行多态性位点的筛选，选点原则包括：(1)位于潜在功能性区域，即基因编码区、5’侧翼区(即转录起始位点上游2kb以内的区域)、5’非翻译区(Untranslated Regions,UTRs)、3’UTR；(2)在中国人群中的最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)≥0.05；(3)如果多个位点间存在高连锁不平衡(Linkage disequil ibrium，LD)(r2≥0.80)，仅选择其中一个位点作为代表。最终8个位点符合筛选条件，结合文献报道的HLA-DP/DQ上4个重要位点，共纳入并检测12个位点，基本信息见表2。使用Primer Express引物设计软件(http://www.appl iedbiosystems.com)定制设计的引物和探针，详细序列见表3。使用ABI 7900HT实时荧光定量PCR仪进行基因分型。每块384孔反应平板中5ul反应体系，含有MasterMix 2ul，正、反向引物各0.25ul，TaqMan探针各0.125ul，DNA样本0.5ul，双蒸水1.25ul。实时荧光定量PCR反应条件：50℃2min，95℃15s，60℃1min，循环次数为45次。扩增循环结束后，读取扩增后荧光信号，运用SDS2.0软件进行基因型判读。

表1四种高危型别HPV(HPV-16、18、52和58型)检测扩增引物序列

表2候选基因及其多态性位点的基本信息

*最小等位基因频率(中国汉族人群)，来源于NCBI SNP数据库

表3 Taqman基因分型引物与探针序列

所述基因分型的引物和探针序列如下：

IL17A rs2275913

SEQ ID NO：1

引物F:GGGGTGACACCATTTTGGTTA

R:ATGAATTTCTGCCCTTCCCA

SEQ ID NO：2

探针FAM-AGAATCTCTCCTTCTGAA-MGB

HEX-AGAATCTCTTCTTCTGAAG-MGB

IL23R rs1884444

SEQ ID NO：3

引物F:CCTAATCAAAGGTTCCCATCA

R:ACCATACCTCCATGACACCAG

SEQ ID NO：4

探针FAM-CATGAATCAGGTCACTA-MGB

HEX-CATGAATCATGTCACTAT-MGB

IL23R rs6682925

SEQ ID NO：5

引物F:AATGAAATCAGCACCATGAGAG

R:TTATGGCTGCATAATATTCCTGTA

SEQ ID NO：6

探针FAM-TATTCCACTAATAGGCACTT-MGB

HEX-ATTCCACTGATAGGCA-MGB

IL12R rs11209046

SEQ ID NO：7

引物F:TGCGGCCCAGAGCAC

F:CCCCGACCCCGAGTCA

SEQ ID NO：8

探针FAM-CACTCACCGCGTGTCG-MGB

HEX-CACTCACCACGTGTCG-MGB

IL12R rs1874396

SEQ ID NO：9

引物F:TGAGACCAGTCATGACCACCTT

R:AAAACAAATCAACCTAGTTCTATAGATGAAGACA

SEQ ID NO：10

探针FAM-CTTTTACCTTGGTGTTTAC-MGB

HEX-CCTTTTACATTGGTGTTTAC-MGB

TLR1rs5743551

SEQ ID NO：11

引物F:AGTAGTGGGGATGAGTCTGTGGG

R:TTGTGAATCCAGGCTGAGGG

SEQ ID NO：12

探针FAM-TGCTGAGAAGCTTC-MGB

HEX-TGCTGAGGAGCTTC-MGB

TLR3rs3775291

SEQ ID NO：13

引物F:ATTTGTATCACTTGCTCATTCTCCC

R:CCCAACCAAGAGAAAGCATCA

SEQ ID NO：14

探针FAM-TACACATACTCAACCTAAC-MGB

HEX-TACACATATTCAACCTAAC-MGB

TLR9rs187084

SEQ ID NO：15

引物F:GGGTGTACATAATTCAGCAGATATCAA

R:TCATGGTTTATTGTATATCGTCTTATTCC

SEQ ID NO：16

探针FAM-CTGCCCTTAAGAAG-MGB

HEX-TGCCCTCAAGAAG-MGB

HLA-DP rs3077

SEQ ID NO：17

引物F:TCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTG

R:GAGCTTGAAGGGTCAGCAATTC

SEQ ID NO：18

探针FAM-AAACTACCCCAGTGGC-MGB

HEX-AAACTACTCCAGTGGCT-MGB

HLA-DP rs9277535

SEQ ID NO：19

引物F:AATGGTGAGCAGACTGCAAATCT

R:TGGTAATGATAAAACATGCTCTCAGTAA

SEQ ID NO：20

探针FAM-ATAGGACCCGTATTC-MGB

HEX-ATAGGACCCATATTC-MGB

HLA-DQ rs2856718

SEQ ID NO：21

引物F:GAGCTCCCTCTGGCAGGTT

R:TATGCTTTCACCAACTTCCTTCAC

SEQ ID NO：22

探针FAM-AGAGCTGTTTAATCC-MGB

HEX-AGAGCTGTCTAATCC-MGB

HLA-DQ rs7453920

SEQ ID NO：23

引物F:TTTAGGGAGGTAAGAGGGAAAGC

R:CGAGAACGCCCTGATCTAAGA

SEQ ID NO：24

探针FAM-ACCGATTCGACATTG-MGB

HEX-ACCGATTCAACATTG-MGB。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

本发明采用流行病学的病例-对照研究设计，病例为中国医学科学院肿瘤医院(CIHCAMS)确诊的新发宫颈癌患者，对照来源于同期参加CIHCAMS宫颈癌筛查项目进行妇科检查的人群，收集研究对象的宫颈脱落细胞标本，应用HPV型别特异性引物检测中国人群中最常见的4种HPV亚型的感染情况，选取宿主免疫炎症基因的12个潜在功能性位点，应用TaqMan基因分型技术进行基因型检测。如图2所示，曲线下面积越大，表明诊断价值越高；首次发现HPV-16与宿主遗传因素的联合效应显著增加了宫颈癌的发病风险，与携带rs3077GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，携带GA/AA基因型且感染HPV-16的女性发生宫颈癌的风险增加了3.11倍(OR＝4.11,95％CI＝2.62-6.49)；与携带rs3775291GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，携带GA/AA基因型且感染HPV-16的女性发生宫颈癌的风险增加了2.64倍(OR＝3.64,95％CI＝2.30-5.75)。因此，联合HPV型别和宿主遗传因素可有效预测宫颈癌发病风险，综合指标的灵敏度和特异度优于单独检测HPV。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。