一种用于胞内癌症标志物双重检测的卫星状纳米组装体的制备方法及应用与流程

文档序号:17924073发布日期:2019-06-15 00:18阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于胞内癌症标志物双重检测的卫星状纳米组装体的制备方法,其特征在于步骤如下:

(1)金纳米棒的合成:采用晶种生长法合成横向等离子吸收峰控制在800nm的金纳米棒GNR;

(2)金棒二聚体的组装:将步骤(1)得到的金纳米棒GNR修饰巯基聚乙二醇SH-PEG-1000,离心重悬后再分别修饰含有microRNA21反义核苷酸序列的巯基DNA1及与DNA1部分互补的巯基DNA2序列,分别得到GNR-DNA1及GNR-DNA2复合体,再将两种复合物混匀,得到金棒二聚体;

(3)金棒二聚体上偶联拉曼信标分子DTTC:将步骤(2)制备的金棒二聚体与拉曼信标分子3.3’-二乙基硫醛三碳菁化碘DTTC混匀,8h后得到表面修饰有DTTC的金棒二聚体-DTTC复合体;

(4)金棒二聚体核-上转换卫星状结构的组装:将步骤(3)得到的金棒二聚体-DTTC离心重悬后,修饰端粒酶的引物TE primer序列;20nm上转换纳米颗粒上修饰与linker DNA部分互补的巯基mismatch DNA;通过linker DNA组装成金棒二聚体核-上转换卫星状结构组装体,再将组装体通过梯度离心纯化;

(5)金棒二聚体核-上转换卫星状纳米组装体修饰穿膜肽:将步骤(4)得到的金棒二聚体核-上转换卫星状结构组装体与SH-PEG-5000和穿膜肽TAT混匀,得到表面修饰有穿膜肽的金棒二聚体核-上转换卫星状结构组装体;

所述DNA1序列如SEQ ID NO.1所示,DNA2序列如SEQ ID NO.2所示,TE primer序列如SEQ ID NO.3所示,mismatch DNA序列如SEQ ID NO.4所示,linker DNA序列如SEQ ID NO.5所示,TAT 多肽序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述用于胞内癌症标志物双重检测的卫星状纳米组装体的制备方法,其特征在于具体步骤如下:

(1)金纳米棒的合成:

a、晶种合成:室温下,将0.05mL浓度为10mM的三水合四氯金酸,加入到1mL的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中,溶液颜色由无色变成黄褐色,然后加入0.12mL新配制的0.01M硼氢化钠溶液,快速搅拌2min,溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色;

b、金纳米棒生长:5mL的1mM的三水合四氯金酸加入到5mL、0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液中,加入4mL的超纯水,混匀;再将0.125mL的0.01M硝酸银溶液加入到上述混合体系中,混匀;随后将70µL、0.1M抗坏血酸溶液加入,剧烈搅拌,溶液变为无色,2min后,加入12μL步骤a制备的晶种,搅拌20s,放入30℃水浴,2h;

(2)金棒二聚体的组装:采用晶种生长法合成的金纳米棒,将其离心浓缩,重悬于5mM 十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液中,使金纳米棒的浓度为5nM;将金纳米棒与巯基聚乙二醇PEG-1000以摩尔浓度1︰100的比例混匀,静置12h,之后取100μL修饰PEG的金纳米棒将其与含有microRNA21反义核苷酸序列的巯基DNA1以摩尔浓度1︰40的比例混匀;另取100μL修饰PEG的金纳米棒与DNA1部分互补的巯基DNA2序列以摩尔浓度1︰40的比例混匀;分别加入终浓度为50mM的NaCl溶液,充分混合后,室温孵育过夜后,离心3次除去溶液中未反应的DNA,分别重悬于100μL的5mM CTAB溶液中,再将得到的GNR-DNA1及GNR-DNA2复合体等体积混合杂交,加入NaCl溶液至NaCl浓度为50mM进行老化,室温下孵育12h,得到金棒二聚体,待用;

(3)金棒二聚体上偶联拉曼信标分子DTTC:将1mM的拉曼信标分子3.3’-二乙基硫醛三碳菁化碘DTTC加入到上述步骤(2)制备的金棒二聚体溶液中,混合均匀,保持DTTC终浓度为10μM,室温孵育8h;

(4)金棒二聚体核-上转换卫星状结构的组装:将步骤(3)修饰拉曼信标分子的金棒二聚体离心重悬于5mM CTAB溶液中,以摩尔浓度1︰500的比例修饰端粒酶的引物TE primer序列,孵育过夜后,离心重悬于5mM CTAB溶液中;20 nm的马来酰亚胺修饰的水溶性上转换纳米颗粒用10mM pH 7.4的tris缓冲液将浓度稀释为5nM,以摩尔浓度1︰5修饰与linkerDNA 部分互补的巯基mismatch DNA,孵育过夜后超滤去除未结合的mismatch DNA,用10mM pH 7.4的tris缓冲液重悬待用;50μL TE primer修饰的金棒二聚体与200μL mismatch DNA修饰的上转换纳米颗粒混合,通过5μL 10μM linker DNA组装成金棒二聚体核-上转换卫星状结构组装体,再将组装体通过梯度离心纯化;

(5)金棒二聚体核-上转换卫星状结构修饰穿膜肽:将步骤(4)得到的金棒二聚体核-上转换卫星状结构组装体︰PEG5000︰穿膜肽TAT以摩尔浓度1︰1000︰100的比例混匀,室温孵育12h后,7500rpm离心10min,去除上清液,沉淀重悬于细胞培养液中。

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