本发明涉及生物细胞研究领域，具体是一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法。
背景技术：
最近研究发现PPARγ的表达参与HSC静态表型的维持，在肝星状细胞的活化调控中发挥重要作用，与肝纤维化的形成有非常密切的关系。采用慢病毒载体介导转染法研究PPARγ对鼠肝纤维化模型的作用机制发现，在体外实验中PPARγ能够抑制活化的HSC表达α-SMA、Ⅰ型胶原，抑制HSC的增殖；在体内实验中也发现PPARγ基因转染组羟脯氨酸、PPARγ及α-SMA、I型胶原蛋白水平与肝纤维化组对比有显著差异。Lee等在研究从狭叶柴胡中提取的一种木酚素(Kaerophyllin)对硫代乙酰胺引起的大鼠肝损伤和纤维化形成的阻断作用机制中发现，其抗炎、抑制HSC活化的作用与上调PPAR-γ表达有关。噻唑烷二酮类药物(thiazolidinediones，TZDs)是临床上抗糖尿病药，常用包括罗格列酮、环格列酮、吡格列酮，该类药物是体内PPARγ高选择性、强效激动剂，能够激活PPARγ从而改善机体糖脂代谢。近期有研究提示PPARγ配体罗格列酮能够通过抑制HSC增殖，使细胞周期静止,促进HSC凋亡从而逆转甲硫氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠纤维性脂肪肝。Lee等报道PPARγ配体环格列酮对HSC增殖的抑制效应与逆转ERK活性有关，并且能够抑制由瘦素或血小板衍生因子引起的HSC增殖。赵彩彦等研究提示环格列酮的抗肝纤维化的活性可能与它对TGFβ1-TGFβR1信号抑制和阻断Smad3依赖性的PAI-1和胶原表达有关。Nan等通过研究罗格列酮对缓解营养性纤维性脂肪肝的形态学和分子生物学依据中发现罗格列酮减轻肝纤维化通过激活PPAR-γ，而PPAR-γ能抑制HSC活化，抑制TGFβ、CTGF表达。Ramani K等在研究肝星状细胞蛋氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)转录调控的分子机制中发现罗格列酮处理的HSC引起的MAT2A表达能降低PPARγ表达，PPARγ是静止的HSCMAT2A的负调控因子。
肝纤维化是肝脏对各种急慢性损伤的修复反应，而肝星状细胞的活化是肝纤维化过程的核心环节，罗格列酮作为核转录因子PPARγ的激动剂，对于肝星状细胞的抑制已得到证实。HSC细胞的激活和表型变化并非单独孤立由某个细胞因子引起，而是涉及到众多细胞因子、不同信号通路的协同作用，其中研究热点的是MAPK途径，而研究表明其中ERK1/2在HSC增殖和胶原蛋白的异常表达中发挥着重要作用。
本发明选取研究最广泛的PDGF作为肝星状细胞的刺激因素，选取最经典的ERK1/2通路为研究对象，用Westemblot检测罗格列酮处理后肝星状细胞ERK1/2蛋白磷酸化的表达情况，进一步揭示其抑制肝星状细胞I、Ⅲ型胶原mRNA表达的信号通路调节机制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，步骤如下：
(1)采用RT-PCR法检测PDGF mRNA的表达
11)样品处理：收获HSC-T6细胞，移入离心管中，加入Trizol，混匀，室温静置4～6min；加入氯仿，振荡12～18s，静置23min，4℃下离心，12000g×15min，取上清，加入异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置8～12min；4℃下离心，12000g×10min，弃上清；加入体积分数为75％的乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃下离心，7500g×5min，弃上清；晾干，加入55℃的DEPC水溶解10～15min；
12)扩增PCR：反应体系为50μL，5×buffer10μL，0.5μL的20μmol/L的α-SMA引物，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水补至40μL加入第一步反应后液体10μL；用PCR仪扩增，PCR反应条件：PPARγ及β-actin为：94℃5min，94℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；Adiponectin为：94℃5min，94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min；
13)PDGF表达半定量分析：将PCR反应产物分别在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，得到PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的扩增产物，用凝胶成像系统对条带进行光密度扫描，以PDGF/β-actin的比值为PDGFmRNA的相对表达水平，实验重复5次；
其中，设置β-actin为参照；
(2)采用Western blot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况
21)细胞中总蛋白的提取
a)溶解Western及IP细胞裂解液，混匀，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为0.9～1.1mM；
b)对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍，按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例加入裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，裂解液接触细胞1～2s后，细胞就会被裂解；
c)充分裂解后，以10000～14000转/min的转速离心3～5min，取上清；
22)Western blot方法操作
a)聚丙烯酰胺凝胶的配制，根据MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相应浓度的分离胶和积层胶；
b)样品处理：将样品加入等量的4×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，离心12000g×1min，每组取等量的总蛋白上样，10％SDS-PAGE分离蛋白质；
c)加样：依次加入待分析样品，每孔15～25μL；
d)电泳：加样完毕，选择50～70V的电压进行电泳3.5～4.5h，直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳；
e)转膜：蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上PVDF膜，电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，4℃，100V，200mA，2h；
f)膜的封闭：漂洗转印膜，室温，3次×15min，以尽量洗去转印膜上的SDS，放入质量分数为5％脱脂奶封闭液内，摇床震动，室温封闭1h；
g)抗体杂交：(1)封闭后pvdf膜放入杂交袋中，加入适当稀释的一抗，4℃孵育过夜1xTBS-T，pH7.6洗液洗膜3次×10min；(2)过氧化物酶标记山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS-T洗膜3次×15min；
h)显色、显影、定影：ECM显色剂后曝光，将曝光后的X感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，再放入定影液中定影，胶片长期保存；用Umax2100XL扫描仪以及凝胶分析软件Bandscan5.0分析目标带的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2与对应的内参β-actin蛋白灰度值相比，计算二者灰度比值。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中，HSC-T6细胞的培养，
(a)细胞复苏：从液氮中取出冻存管，迅速放入36-37℃水中，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成，冻存管用70％酒精擦拭消毒，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，缓慢滴加等量培养液，以500～1000r/min的转速离心4～6min，去上清后再用培养液洗一次，用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃，5％CO2浓度的培养箱内培养，待细胞贴壁后换液；
(b)细胞培养：采取含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37℃，5％CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，待细胞生长至80～90％密度时，开始传代；
(c)细胞传代：倒去长满细胞的培养瓶中原来的培养液，加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10培养液终止消化，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按1：3传代，置37℃，5％CO2及饱和湿度下培养；
(d)细胞冻存：用0.25％胰酶溶液消化细胞，培养液重悬细胞，1000r/min，离心4～6min，弃去上清，冻存液重悬沉淀，加入冻存管中，标明细胞系的名称和冻存日期，4℃1h，-20℃30min，-80℃过夜，次日将冻存管转移至液氮中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
通过本发明证实脂联素具有抑制肝纤维化的作用，其机制与PPARγ的转录与调控有关，通过提高PPARγ与脂联素的表达，从而减少I型胶原、MMP2的表达，提高TIMP2的表达，减少细胞外基质的生成及正常内皮下基质的降解，达到阻断肝纤维化进展的目的。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
研究方案如下
1、细胞培养
1.1细胞复苏：从液氮中取出冻存管，迅速放入36-37℃水中，不时摇动，使其急速融化，30s至1min内完成。冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，缓慢滴加等量培养液，低速离心(500-1000r/min)5min，去上清后再用培养液洗一次。用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃，5％CO2浓度的培养箱内培养，待细胞贴壁后换液。
1.2细胞培养：采取含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37℃，5％CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，待细胞生长至80％-90％密度时，开始传代。
1.3细胞传代：倒去长满细胞的培养瓶中原来的培养液，加入1ML0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ML培养液终止消化，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按1：3传代，置37℃，5％CO2及饱和湿度下培养。
1.4细胞冻存：用0.25％胰酶溶液消化细胞，5ml培养液重悬细胞，1000r/min，离心5min，弃去上清，1ml冻存液重悬沉淀，加入冻存管中，标明细胞系的名称和冻存日期，4℃1h，-20℃30min，-80℃过夜，次日将冻存管转移至液氮中。
1.5细胞计数：取细胞悬液0.1ml，加入PBS 0.9ml，混合后滴入细胞计数板内。低倍镜下计数四个大方格内的细胞总数，按照下列公式计算细胞密度：细胞密度(细胞数/ml)＝(细胞计数总和/4)×104×稀释倍数。计数原则：压线细胞应数上不数下，数左不数右，计数时两次重复算误差率不应超过10％。
2、细胞分组及处理
采用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37℃，5％CO2饱和湿度培养，每日定时于倒置显微镜下观察细胞生长状态，隔天换液，待细胞生长至80％-90％密度时开始传代。将对数生长期HSC-T6细胞，以0.25％胰蛋白酶消化，并接种至无菌6孔板内，调整细胞接种密度为1×105/ml，待细胞生长至80％左右用低糖培养基使细胞同步化24h，细胞分4组：空白对照组，PDGF刺激组，罗格列酮干预组及罗格列酮对照组。
HSC-T6复苏后以1×105/ml接种于96孔板培养，其中罗格列酮使用浓度为10μmol/L，PDGF使用浓度为30μmol/L，每组设立6个复孔。每组设5个复孔，干预24h后分别收集各组的细胞和细胞培养上清液进行下面实验。
3、四甲基偶氮唑盐比色实验(MTT比色法)
3.1.HSC-T6细胞生长融合成单层后，取对数生长期细胞，分别以0.25％胰蛋白酶消化，并接种至无菌96孔板内，调整细胞接种密度为5×104/ml，每孔均加入细胞悬液200μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
3.2.24h后，96孔板内细胞贴壁后，吸去原培养液，血清饥饿同步化处理24h后，吸弃培养液。板边缘四周孔加PBS防止边缘效应，按照实验分组依次加入浓度为10μmol/L罗格列酮、1μmol/L GW9662、10μmol/L罗格列酮和1μmol/L GW9662的培养液，每孔200μL；对照组为0.4％小牛血清的DMEM培养液培养，每组设5个复孔，培养24h。
3.3.到预定时间后，每孔加入无菌MTT溶液(5mg/ml)20μL，继续在原条件下孵育4h，然后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)，微型振荡器振荡10min。选择490nm波长，在酶标仪上检测各孔的吸光度(A值)，结果以均数±标准差表示，综合分析10μmol/L罗格列酮、1μmol/L GW9662、10μmol/L罗格列酮和1μmol/L GW9662对HSC-T6细胞增殖的影响。
4、采用RT-PCR法检测PDGFmRNA的表达
4.1.样品处理：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。4℃离心，12000g×15min，取上清。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。晾干，加入适量的DEPC H2O溶解(55℃促溶10-15min)。
4.2.引物见表一：
设置β-actin为参照；
4.3扩增PCR：反应体系为50μL，5×buffer10μL，α-SMA引物(20μmol/L)0.5μL，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水补至40μL加入第一步反应后液体10μL。用PCR仪扩增。PCR反应条件：PPARγ及β-actin为：94℃5min，94℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min。Adiponectin为：94℃5min，94℃预变性30s，，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
4.4.PDGF表达半定量分析：将PCR反应产物分别在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的扩增产物大小见表一。用凝胶成像系统(UVP公司)对条带进行光密度扫描，以PDGF/β-actin的比值为PDGFmRNA的相对表达水平。实验重复5次。
5、Western blot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况
5.1.细胞中总蛋白的提取
5.1.1.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数min内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
5.1.2.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2s后，细胞就会被裂解。
5.1.3.充分裂解后，10000-14000转/min离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western等操作。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100μL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150μL或200μL。
5.2.Western blot方法操作步骤
5.2.1.聚丙烯酰胺凝胶的配制，根据MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相应浓度的分离胶和积层胶
5.2.2.样品处理：将样品加入等量的4×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，每组取等量的总蛋白上样，10％SDS—PAGE分离蛋白质。
5.2.3加样：依次加入待分析样品，每孔20μL。
5.2.4.电泳：加样完毕，选择适当的电压进行电泳可。一般采用60V，4h，也可电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳
5.2.5.转膜：蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上PVDF膜。电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，4℃，100v，200mA，2h。
5.2.6.膜的封闭：漂洗转印膜，室温，3次x15min，以尽量洗去转印膜上的SDS(以免影响抗体的结合)，放入5％脱脂奶封闭液内，摇床震动，室温封闭1h
5.2.7.抗体杂交：(1)封闭后pvdf膜放入杂交袋中，加入适当稀释的一抗，4℃孵育过夜1xTBS-T，PH7.6洗液洗膜3次x10min。(2)过氧化物酶标记山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS-T洗膜3X15min。
5.2.8.显色(ECM)：ECM显色剂后曝光
5.2.9.显影、定影：将曝光后的X感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，再放入定影液中定影，胶片可长期保存。用Umax2100XL扫描仪以及凝胶分析软件Bandscan5.0分析目标带的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2与对应的内参β-actin蛋白灰度值相比，计算二者灰度比值
研究结果：
1.MTT法检测细胞增殖率：罗格列酮干预组细胞的增殖率较空白对照组，PDGF刺激组及罗格列酮对照组明显下降(t值分别为21.975、16.331、19.5，P<0.01，见表1)。
表1 各组HSC增殖情况
2.ELISA检测HSC-T6细胞脂联素、I型胶原、MMP2、TIMP2含量的变化
ELISA结果显示：①罗格列酮组脂联素的表达较GW9662组、GW9662+罗格列酮组及空白对照组明显升高，差异有统计学意义(t值分别为10.256、11.049、18.419，P<0.01)。②罗格列酮组I型胶原的表达较GW9662组、GW9662+罗格列酮组及空白对照组明显下降，差异有统计学意义(t值分别为11.823、9.657、14.240，P<0.01)。③罗格列酮组MMP2含量较GW9662组、GW9662+罗格列酮组、空白对照组明显下降，差异有统计学意义(t值分别为25.744、20.333、19.030，P<0.01)。④罗格列酮组TIMP2的表达量较GW9662组、GW9662+罗格列酮组、空白对照组明显升高，差异有统计学意义(t值分别为15.500、18.166、18.802，P<0.01)。⑤GW9662组、GW9662+罗格列酮组及空白对照组脂联素、I型胶原、MMP2、TIMP2的表达量无明显差异(P>0.05)。(见表2)
表2 ELISA检测HSC-T6细胞脂联素、Ⅰ型胶原、MMP2、TIMP2含量的变化(ng/ml)
3.RT-PCR检测HSC-T6细胞脂联素和PPARγ的mRNA表达的变化
RT-PCR结果显示：①罗格列酮组脂联素mRNA相对表达量为1.273±0.045，较GW9662组、GW9662加罗格列酮组、空白对照组(0.653±0.075、0.633±0.093、0.693±0.065)明显升高，差异有统计学意义(t值分别为12.264、10.733、12.690，P<0.01)。②罗格列酮组PPARγmRNA相对表达量为1.633±0.015，较GW9662组、GW9662加罗格列酮组、空白对照组(0.403±0.015、0.450±0.026、0.457±0.015)明显升高，差异有统计学意义(t值分别为8.619、7.089、4.343，P<0.01)。③其它各组脂联素、PPARγmRNA相对表达量无明显差异(P>0.05)。④GW9662阻断罗格列酮对PPARγmRNA表达同时，也阻断了罗格列酮对脂联素mRNA的表达。⑤脂联素和PPARγmRNA表达存在显著正相关关系(相关指数为0.970，P＝0.000，P<0.01)。(见表3)
表3 RT-PCR检测HSC-T6细胞脂联素、PPARγmRNA表达的变化
4.Western blot检测HSC-T6细胞脂联素和PPARγ蛋白表达的变化
Western印迹结果显示：①罗格列酮组脂联素蛋白相对表达量为1.124±0.007，较GW9662组、GW9662加罗格列酮组、空白对照组(0.744±0.082、0.744±0.064、0.734±0.043)明显升高，差异有统计学意义(t值分别为7.969、10.240、15.274，P<0.01)。②罗格列酮组PPARγ蛋白相对表达量为1.036±0.028，较GW9662组、GW9662加罗格列酮组、空白对照组(0.655±0.006、0.648±0.004、0.649±0.005)明显升高，差异有统计学意义(t值分别为23.450、24.208、23.990，P<0.01)。③其它各组脂联素、PPARγ蛋白相对表达量无明显差异(P>0.05)。④GW9662阻断罗格列酮对PPARγ蛋白表达同时，也阻断了罗格列酮对脂联素蛋白的表达。⑤脂联素和PPARγ蛋白表达存在显著正相关关系(相关指数为0.966，P＝0.001，P<0.01)。(见表4)
表4Western blot检测HSC-T6细胞脂联素、PPARγ蛋白表达的变化
本实验结果显示，罗格列酮组脂联素、PPARγmRNA及蛋白的表达量较其它组明显升高(P<0.01)，其它各组脂联素、PPARγmRNA及蛋白的表达量比较无统计学意义(P>0.05)，说明罗格列酮激动PPARγ的表达，同时也上调脂联素的表达，且这种激动作用可被特异性阻断剂GW9662阻断，说明罗格列酮的激动作用是通过PPARγ起作用的。通过相关性分析提示脂联素和PPARγmRNA表达存在显著相关关系(相关指数为0.970，P＝0.000，P<0.01)，脂联素和PPARγ蛋白表达同样存在显著相关关系(相关指数为0.966，P＝0.001，P<0.01)。说明在HSC中脂联素的表达调控与细胞核内转录因子PPARγ有一定相关，与以往报道脂联素是PPARγ的靶基因相符。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。