本发明是涉及一种可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
实时聚合酶链式反应(real-timepcr，简称实时pcr)是指扩增与检测同步进行，通过检测扩增循环中荧光信号的变化以指示核酸扩增过程。实时pcr核酸检测技术早期使用荧光染料，例如sybrgreen，evegreen，指示pcr反应产物。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特扩增，虽然增加熔解曲线检测一步，但在实际应用中还是受到了很大限制。随后，实时pcr核酸检测技术中开始应用标记荧光基团的核酸片段作为指示探针，例如5’-核酸外切酶技术中使用的taqman探针、分子信标、荧光能量转移探针(相邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。实时pcr中加入探针对pcr扩增产物具有第二识别作用，从而避免了非特异扩增，结果更加可靠，也无需熔解曲线检测一步。但目前的荧光探针检测技术仍然存在一些缺陷，例如：探针结合的效率不高，造成检测灵敏度低，荧光信号强度低；探针的荧光激发和淬灭基团量不成比例，或因结构问题而不能足够靠近，造成检测系统荧光本底背景高；探针的结构和检测原理复杂，不易设计，且对目标核酸序列的gc含量、二级结构等较为挑剔，普适性差等。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、荧光信号强度高、荧光本底背景低、设计简单、普适性好的可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针及其应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针，所述荧光探针为一条寡核苷酸链，其5’端标记有荧光激发基团，3’端标记有荧光淬灭基团，其特征在于：在5’端与3’端之间包含两段分别与目标核酸序列正向链和反向链反向互补的寡核苷酸序列，且在靠近5’末端有2～5个碱基与目标核酸序列特异性结合但在所述荧光探针上无反向互补碱基，同时在两端反向互补的序列交界区域也有2～5个碱基与目标核酸序列特异性结合但在所述荧光探针上无反向互补碱基。
作为优选方案，所述寡核苷酸链的总长为40～60碱基。
作为优选方案，所述的荧光激发基团为fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5，所述的荧光淬灭基团为tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。
作为优选方案，每段寡核苷酸序列的长度为19～25碱基。
由于本发明所述的荧光探针在pcr扩增反应混合液中，在一定条件下可形成自互补结合的、上下各有2～5碱基凸出的分子内的双链发卡结构，该结构形成后，荧光激发基团和荧光淬灭基团非常接近，会发生荧光能量转移效应，从而不会有荧光信号释放；当有目标核酸序列存在时，该荧光探针变性展开，其自身的两段寡核苷酸序列分别与目标核酸序列反向互补结合，使荧光激发基团远离荧光淬灭基团，从而释放荧光信号，并且信号的强度与模版浓度成正比。因此，本发明所述的荧光探针可用于实时荧光定量pcr中的目标核酸序列(如：微生物特异序列、融合基因序列、mrna序列等)的检测。
另外，由于常规的pcr扩增反应包括三个主要步骤：变性、退火和延伸，而在变性阶段，本发明所述的荧光探针由于高温解链，荧光激发基团和荧光淬灭基团会相互分离释放荧光，而在退火阶段，如果反应混合液中不存在目标核酸序列，则本发明所述的荧光探针会恢复发卡状的二级结构，释放的荧光会被淬灭，如果存在目标核酸序列，则本发明所述的荧光探针会处于解链状态下，会与其退火结合形成更为稳定的二级结构，从而释放出荧光；而在延伸阶段，本发明所述的荧光探针会从目标核酸链上被置换下来。因此，随着pcr扩增反应的进行，循环数的增加，产物量逐渐增多，可通过在每个循环退火阶段收集相应荧光通道的荧光信号，根据强度间接判断扩增产物量的多少，以及可用于检测实时荧光定量pcr中的单碱基变异(如：snp分型、基因点突变、碱基缺失、碱基插入等)情况。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
由于本发明提供的荧光探针只有一条寡核苷酸链，荧光激发基团和荧光淬灭基团一一对应，更易于形成基团靠近的二级结构；另外，由于存在较长反向互补结合序列，形成的基团靠近的二级结构更为稳定；这些特点使得本发明提供的荧光探针的检测系统的荧光本底背景非常低；另外，由于本发明提供的荧光探针形变后，有两段序列可与目标核酸序列的正反向链分别互补结合，因而也大大提高了检测的灵敏度和荧光信号强度；而且本发明的荧光探针还具有结构简单，设计比较简便、容易，对目标核酸序列不挑剔，普适性好。
附图说明
图1为本发明所提供的荧光探针及其反应原理示意图；
图2为本发明所提供的荧光探针用于目标核酸序列实时检测的荧光曲线；
图3为本发明所提供的荧光探针用于单碱基变异实时检测的荧光曲线。
图中：
1-荧光激发基团；2-荧光淬灭基团；3-寡核苷酸序列；4-无反向互补碱基的特异性结合碱基。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明技术方案做进一步详细、完整地说明。
实施例1
如图1所示：本发明提供的一种可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针，所述荧光探针为一条长为40～60碱基的寡核苷酸链，其5’端标记有荧光激发基团1，3’端标记有荧光淬灭基团2，在5’端与3’端之间包含两段分别与目标核酸序列正向链和反向链反向互补的寡核苷酸序列3，且在靠近5’末端有2～5个与目标核酸序列特异性结合但在所述荧光探针上无反向互补碱基的碱基4，同时在两端反向互补的序列交界区域也有2～5个与目标核酸序列特异性结合但在所述荧光探针上无反向互补碱基的碱基4。
在一定条件下，该荧光探针形成分子内的双链发卡状的二级结构，荧光激发基团1与荧光淬灭基团2靠近，发生荧光能量转移效应，从而不会有荧光信号释放；当有目标核酸序列存在时，所述荧光探针变性展开，其自身的两段寡核苷酸序列3分别与目标核酸序列反向互补结合，使荧光激发基团1远离荧光淬灭基团2，从而释放荧光信号。
所述荧光探针的总长优选为40～60碱基(总长太长会提高合成制备难度，太低会降低检测特异性)；将5’端和3’端分别包含的两段寡核苷酸序列3的长度均优选为19～25碱基，这样反向互补结合序列长度较长，所述荧光探针在一定条件下形成的二级结构更为稳定，进而可使所述荧光探针的检测系统的荧光背景非常低。
另外，在所述荧光探针的两段寡核苷酸序列3交界处根据目标核酸序列的gc含量设计2～5个与目标核酸序列匹配但在探针上无反向互补的碱基4，同时在所述荧光探针的5’端末端也设计2～5个与目标核酸序列匹配但在探针上无反向互补的碱基4，这样使得所述荧光探针在一定条件下形成自互补结合的、上下各有2～5个碱基凸出的不严格双链发卡状的二级结构，使得所述荧光探针的检测差异性高，同时当存在目标核酸序列时，使得展开后的探针与目标核酸序列结合形成的二级结构更为稳定，可明显降低检测系统的荧光背景。
实施例2
采用本发明所述的荧光探针实时检测荧光定量pcr中的目标核酸序列：
以人内源性肌动蛋白(actb)基因作为目标核酸序列为例，反应体系总体积为25μl，包含扩增引物0.3μm，本发明所述的荧光探针0.1μm，1单位的dna聚合酶，dntp200μm，40mmkcl，1.5mmmgcl2和10mmtris-hcl(ph8.3)，模版cdna2μl，共4个；2倍梯度稀释，水作为空白对照，封板后，放置于荧光定量pcr仪(strategene3005p)上，按照下述条件进行扩增：95℃10分，40个循环(95℃20秒，60℃60秒，72℃30秒)。
收集在退火阶段的fam通道荧光信号。
扩增使用的正向引物为：5’-cgtcttcccctccatcgtg-3’；
反向引物为：gcctcgtcgcccacatag；
所述的荧光探针为：
5’fam-aggcaccagggcgtgatggtgggcacccatgcccaccatcacgccctgg-3’bhq1。
图2为本实施例中荧光探针对目标核酸序列实时检测的荧光曲线，图中：星号所示的曲线为空白对照，无荧光信号产生；实心圆形所示的曲线为2μlcdna原液产生，实心正方形所示的曲线为2μlcdna原液2倍稀释液产生，实心三角形所示的曲线为2μlcdna原液4倍稀释液产生，实心菱形为cdna原液8倍稀释液产生。由图2可见：没有目标核酸序列存在(空白对照)，本发明的荧光探针形成自结合的二级结构，荧光激发基团和荧光淬灭基团靠近，不释放荧光信号；而在目标核酸序列存在的情况下，荧光探针与目标核酸序列结合，荧光激发基团和荧光淬灭基团分离，释放荧光信号；而且信号的强度与模版浓度成正比。说明本发明的荧光探针可用于实时荧光定量pcr中的目标核酸序列(比如：微生物特异序列、融合基因序列、mrna序列等)的检测。
实施例3
采用本发明所述的荧光探针实时检测荧光定量pcr中的单碱基变异(snp分型或基因突变)检测：
以人乙醛脱氢酶rs671位点(a>g)作为基因分型的实例。
反应体系总体积为25μl，包含扩增引物0.3μm，两种荧光探针各0.1μm，0.8单位的dna聚合酶，dntp200μm，40mmkcl，1.0mmmgcl2和30mmtris-hcl(ph8.3)，模版dna2μl；水作为空白对照，封板后，放置于荧光定量pcr仪(strategene3005p)上，按照下述条件进行扩增：95℃10分，40个循环(95℃20秒，60℃60秒，72℃30秒)。
分别收集在退火阶段的fam通道和vic通道的荧光信号。
扩增使用的正向引物为：5’-caccctttggtggctacaag-3’；
反向引物为：5’-cccagcaggtcccacact-3’；
对应g等位基因的荧光探针为：
5’fam-tgcaggcatacactgaagtgaacagttttcacttcagtgtatgc-3’bhq1；
对应a等位基因的荧光探针为：
5’vic-ctgcaggcatacactaaagtgaacagttttcactttagtgtatgcc-3’bhq1；
图3为本实施例中荧光探针对单碱基变异情况的实时检测曲线，图3a所示的曲线为空白对照，无荧光信号产生；图3b所示的曲线为携带g等位基因的纯合模版扩增后产生；图3c所示的曲线为携带a等位基因的纯合模版扩增后产生；图3d所示的曲线为携带a和g等位基因的杂合模版扩增后产生，其中实心三角标记的曲线为对应g等位基因的荧光探针释放的信号形成，空心三角标记的曲线为对应a等位基因的荧光探针释放的信号形成。结合图3b至3d的结果说明，在只存在携带g等位基因纯合模版的情况下，只有对应g等位基因荧光探针释放出荧光信号，对应a等位基因荧光探针不会释放出非特异性信号；在只存在携带a等位基因纯合模版的情况下，只有对应a等位基因荧光探针释放出荧光信号，对应g等位基因荧光探针不会释放出非特异性信号；而当存在携带g和a等位基因杂合模版时，对应g和a等位基因的两条荧光探针均释放出荧光信号。说明本发明的荧光探针可用于实时荧光定量pcr中的单碱基变异(比如：snp分型、基因点突变、碱基缺失和碱基插入等)的检测。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。