本发明属于兽医微生物领域，具体涉及一种用于快速鉴别鸡白痢沙门氏菌不同亚型的培养基，以及利用该培养基鉴别鸡白痢沙门氏菌不同亚型的方法。
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：鸡白痢是由鸡白痢沙门氏杆菌引起的一种2-3周龄雏鸡常发的传染病。该病的特征为幼雏感染后常呈急性败血症，发病率和死亡率都很高。垂直传播是该病的主要途径，因而对种鸡及其所产的蛋有计划地进行检测，淘汰阳性鸡，培育无白痢种鸡群，切断垂直传播途径，是控制该病的关键所在，而研制特异性的检测试剂对于鸡白痢的净化工作至关重要。由于鸡白痢沙门氏菌包含三种不同亚型(标准型、中间型和变异型)，因而在开展鸡白痢诊断试剂研制或其它研究方面，首先要对鸡白痢沙门氏菌进行不同亚型的鉴别。目前鉴别鸡白痢沙门氏菌不同亚型的方法包括血清学分型和硫酸铵盐析分型。血清学分型方法结果准确，操作相对简易，但该方法需要消耗大量的沙门氏菌O:123和O:122两种单因子血清，而这2种血清的制备过程较为繁琐，导致其价格非常昂贵，限制了该方法的广泛应用。而硫酸铵盐析分型方法操作程序较为复杂，其结果判定采用肉眼观察浊度的方法，其结果容易在中间型菌株的判定方法出现误差，因而该方法主要在缺乏O:123和O:122单因子血清的情况下开展的备选实验方案。技术实现要素：本发明的目的旨在提供一种用于快速鉴别鸡白痢沙门氏菌不同亚型的培养基，以及利用该培养基鉴别鸡白痢沙门氏菌不同亚型的方法。其原理是将鸡白痢沙门氏菌接种于本发明提供的固体培养基，于37℃培养30-32h，在外加斜射光线条件下，通过显微镜观察菌落形态特征(标准型菌株的菌落圆整光滑，结构致密无条纹，显橙色或亮蓝色荧光；中间型菌株的菌落较为圆整，中心有细条纹，显灰色荧光；变异型菌株的菌落形状不规则，结构松散有粗条纹，显金色或黄色荧光)，进而开展鸡白痢沙门氏菌不同亚型的快速鉴别。本发明提供了一种用于快速鉴别鸡白痢沙门氏菌不同亚型的培养基，其组分为：酵母浸出粉1.6-2.0g/L、胰酪蛋白胨10-12g/L、甘油10ml/L、硫代硫酸钠4.0-5.0g/L、硫酸锰0.3-0.4g/L、硫酸镁0.15-0.2g/L、脱水小牛脑浸粉18-20g/L、磷酸氢二钠9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、甘露糖2.5-3.0g/L、鼠李糖0.8-1.0g/L、伯胶糖1.0-1.2g/L、氯化钠3.0-4.0g/L、L-谷氨酸钠0.4-0.5g/L、β-丙氨酸0.2-0.3g/L、L-赖氨酸0.2-0.3g/L、新生小牛血清40ml/L、纯化琼脂粉20g/L，其余为去离子水。制备以上所述的培养基时，需先将酵母浸出粉、胰酪蛋白胨、甘油、硫代硫酸钠、硫酸锰、硫酸镁、脱水小牛脑浸粉、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、甘露糖、鼠李糖、伯胶糖、氯化钠、L-谷氨酸钠、β-丙氨酸、L-赖氨酸和纯化琼脂粉等组分加入去离子水，加热溶解后经氢氧化钠溶液调节PH至7.2±0.4，121℃灭菌15min。待冷却至50℃后，加入新生小牛血清，充分混匀后注入平板制成固体培养基。本发明的有益效果在于：用本发明提供的鸡白痢沙门氏菌培养基可以直观的进行鸡白痢沙门氏菌菌种筛选，具有简易、方便、快速等优点。与其它培养基相比，本发明提供的培养基可以使鸡白痢沙门氏菌不同亚型菌落具有典型的鉴别特性。与传统鸡白痢沙门氏菌不同亚型的鉴别方法相比，本发明提供的方法节省了大量的人力物力资源，有效的简化可实验流程，缩短了实验周期。具体实施方式下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。实施例1取酵母浸出粉1.6g、胰酪蛋白胨12g、甘油10ml、硫代硫酸钠5.0g、硫酸锰0.3g、硫酸镁0.2g、脱水小牛脑浸粉20g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钾1.5g、甘露糖3.0g、鼠李糖0.8g、伯胶糖1.0g、氯化钠3.0g、L-谷氨酸钠0.5g、β-丙氨酸0.2g、L-赖氨酸0.3g和纯化琼脂粉20g加入950ml去离子水中，加热至沸腾，并不断搅拌直至混合液完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值至7.4，121℃灭菌15min。灭菌后待冷却至50℃，加入新生小牛血清40ml，充分混匀后注入灭菌平板，每副平板约15ml，凝固后得到鸡白痢沙门氏菌培养基。实施例2取酵母浸出粉2.0g、胰酪蛋白胨10g、甘油10ml、硫代硫酸钠4.0g、硫酸锰0.4g、硫酸镁0.15g、脱水小牛脑浸粉18g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钾1.5g、甘露糖2.5g、鼠李糖1.0g、伯胶糖1.2g、氯化钠4.0g、L-谷氨酸钠0.4g、β-丙氨酸0.3g、L-赖氨酸0.2g和纯化琼脂粉20g加入950ml去离子水中，加热至沸腾，并不断搅拌直至混合液完全溶解，用氢氧化钠溶液调节PH值至7.4，121℃灭菌15min。灭菌后待冷却至50℃，加入新生小牛血清40ml，充分混匀后注入灭菌平板，每副平板约15ml，凝固后得到鸡白痢沙门氏菌培养基。实施例3选取8株已鉴定分型的鸡白痢沙门氏菌国内标准株或国外标准株接种于按实施例1所述方法制成的鸡白痢沙门氏菌固体培养基，37℃培养30h后取出，在外加45°斜射光线条件下，通过解剖显微镜观察菌落特征，结果显示3株已知为标准型菌株的鸡白痢沙门氏菌(C79-1、C79-4和S11)均呈现圆整光滑、致密无条纹、橙色或亮蓝色荧光的菌落特征；2株已知为标准型菌株的鸡白痢沙门氏菌(AI-296和AI-4)均呈现较为圆整、中心有细条纹、灰色荧光的菌落特征；3株已知为变异型菌株的鸡白痢沙门氏菌(AV、AV-77和AV-79)均呈现不圆整，松散条纹粗，金色或黄色荧光的菌落特征(表1)。上述已鉴定分型的鸡白痢沙门氏菌标准菌株的菌落特征与本发明所述的鉴别标准相符。结果表明，使用本发明所述的培养基可以通过观察菌落特征的方法，快速鉴别不同亚型鸡白痢沙门氏菌菌株。表1鸡白痢沙门氏菌不同亚型标准菌株的菌落特征菌株编号来源血清学分型结果菌落特征C79-1中国标准株标准型圆整光滑，致密无条纹，显橙色荧光C79-4中国标准株标准型圆整光滑，致密无条纹，显亮蓝色荧光S11英国标准株标准型圆整光滑，致密无条纹，显亮蓝色荧光AI-296美国标准株中间型较为圆整，中心有细条纹，显灰色荧光AI-4美国标准株中间型较为圆整，中心有细条纹，显灰色荧光AV英国标准株变异型不圆整，松散条纹粗，显金色荧光AV-77美国标准株变异型不圆整，松散条纹粗，显黄色荧光AV-79美国标准株变异型不圆整，松散条纹粗，显亮黄色荧光实施例4使用本发明所述的方法对503株鸡白痢沙门氏菌分离株(所有鸡白痢沙门氏菌分离株均由江苏省家禽科学研究所保存提供)进行分型研究。将503株分离株接种实施例1所述方法制成的鸡白痢沙门氏菌固体培养基，37℃培养32h后取出，在外加45°斜射光线条件下，通过解剖显微镜观察分离株的菌落特征。同时，分别使用传统的血清学分型方法和硫酸铵盐析方法进行验证。由表2可见，采用血清学分型方法，503株鸡白痢沙门氏菌分离株中标准型菌株(仅与O:123单因子血清发生典型凝集反应的菌株)为362株，占总数的72.0％(362/503)；变异型菌株(仅与O:122单因子血清发生典型凝集反应的菌株)为22株，占总数的4.4％(22/503)；中间型菌株(同时与O:123和O:122两种单因子血清发生典型凝集反应的菌株)为119株，占总数的23.7％(119/503)。采用基于硫酸铵盐析的分型方法，503株鸡白痢沙门氏菌分离株中标准型菌株(高浊度)为359株，占总数的71.4％(359/503)；变异型菌株(低浊度)为22株，占总数的4.4％(22/503)；中间型菌株(中等浊度)为122株，占总数的24.3％(122/503)。使用本发明所述的基于菌落特征的分型方法，503株鸡白痢沙门氏菌分离株中标准型菌株(呈现圆整光滑、致密无条纹、橙色或亮蓝色荧光的菌落特征)为362株，占总数的72.0％(362/503)；变异型菌株(呈现不圆整，松散条纹粗，金色或黄色荧光的菌落特征)为22株，占总数的4.4％(22/503)；中间型菌株(呈现较为圆整、中心有细条纹、灰色荧光的菌落特征)为119株，占总数的23.7％(119/503)。根据上述实验结果发现，三种方法的分型结果，本发明所述的基于菌落特征的分型结果与经典的血清学分型结果完全一致，而硫酸铵盐析分型方法与血清学分型方法和本发明方法存在较小误差(主要在标准型菌株和中间型菌株的判别)。由于硫酸铵盐析分型方法操作程序较为复杂，影响因素较多，且结果判定采用肉眼观察细菌被盐析后的浊度，其方法稳定性不强，因而该方法主要在缺乏O:123和O:122单因子血清的情况下开展的备选实验方案。而本发明所述方法与经典的血清学分型结果完全一致，表明该方法的判定结果具有较高的准确性。与其它2种分型方法相比，节省了大量的人力物力资源，有效的简化可实验流程，缩短了实验周期。表2503株鸡白痢沙门氏菌分离株的分型实施例5选取已鉴定分型的鸡白痢沙门氏菌标准型菌株、中间型菌株和变异型菌株各4株，分别接种于营养琼脂培养基、胰酪胨大豆琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基和本发明提供的培养基，37℃培养32h后取出，在外加45°斜射光线条件下，通过解剖显微镜观察分离株的菌落特征，结果见表3。由表可见，鸡白痢沙门氏菌在营养琼脂培养基、胰酪胨大豆琼脂培养基和脑心浸液琼脂培养基3种常用培养基上培养后，除了在菌落外观上与本发明提供的培养基类似外，在菌落结构、荧光色彩和荧光亮度等方面均显著不如本发明提供的培养基容易鉴别。上述结果表明，使用本发明提供的培养基可以使鸡白痢沙门氏菌不同亚型菌落具有典型的鉴别特性。表3鸡白痢沙门氏菌在不同培养基上的菌落特征尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页1 2 3