本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种重组腺病毒的生产方法，尤其涉及一种WAVE无血清培养悬浮细胞制备重组腺病毒的方法。
背景技术：
：腺病毒(Adenovirus，Adv)载体是基因治疗中最有前途的基因转移载体之一。其生物学特性得到广泛研究。Adv有一个中等大小的基因组，其大小平均36kb，适合于容纳大片段基因，与反转录病毒载体相比，腺病毒载体能有效地将外源基因转移到各种靶细胞或组织中。腺病毒载体容易构建和操作，容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达1.0×1011IU/mL。宿主范围广，感染性强，可经不同途径进入不同组织，能感染分化后的非分裂期细胞。在Adv生活周期中，其基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，外源基因能游离地表达。Adv制成疫苗临床应用表明，采用Adv进行体内基因转移是安全的。目前，针对重组腺病毒的中试级生产中，多采用细胞工厂或细胞罐结合片状载体或微载体的方式进行病毒包装细胞的培养，采用这些方式培养的细胞多为293系列等贴壁细胞，与悬浮培养法相比，贴壁细胞扩大培养困难，培养过程不能有效监测细胞生长，占地面积大，投资大。此外贴壁细胞培养时需要使用血清培养，而悬浮细胞在培养过程可以采用无血清培养。有研究结果表明，细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，而且不同批次牛血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，制品中残留的牛血清易引起接种者对血清的过敏反应。而无血清培养过程中不使用牛血清，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定，可简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免血清污染造成的危害。随着人们对基于细胞培养制备的生物制品的产业化需求越来越高，对此类生物制品的质量要求也越来越严格，能确保批次间质量稳定的无血清悬浮细胞培养势必成为细胞培养和病毒扩增领域的一大趋势。技术实现要素：针对以上技术问题，本发明公开了一种WAVE(波浪式生物反应器)无血清培养悬浮细胞制备重组腺病毒的方法，解决了目前中试过程中采用血清培养贴壁细胞制备重组腺病毒所存在的技术缺陷和产品质量稳定性差的问题，也为进一步生产工艺的放大提供了较为直接的理论和可行性数据支持。对此，本发明采用的技术方案为：一种WAVE无血清培养悬浮细胞制备重组腺病毒的方法，其特征在于：其包括以下步骤：步骤S1：确认WAVE设备运行正常以及细胞袋无菌情况正常后，取悬浮细胞种子液转移至细胞袋中进行细胞培养，细胞袋中细胞初始密度为3-5×105个细胞/mL；设定培养参数为：温度37℃±1、二氧化碳浓度5％、通气量0.2Lpm；在培养过程，根据细胞密度逐级调整反应器摇摆速度和角度；其中，所述悬浮系细胞包括HER096、其他适应无血清驯化后的适用于制备重组腺病毒的悬浮系细胞中的任意一种，如HEK293悬浮细胞(HEK293-F)。步骤S2：步骤S1中进行灌注培养后，使用新鲜的培养基逐步稀释培养袋中的培养液，当细胞密度达到4-6×106个细胞/ml时，计算细胞袋中总的细胞数量，调整病毒种子液中病毒颗粒数，按照MOI(VP/cell)＝100:1～300:1接种重组腺病毒，染毒2-3h后，启动灌注程序，进行病毒扩增，灌注速度5-10L/d，进行病毒扩增，调整反应器摇摆速度为15-30rpm，，摇摆角度为6-12°，病毒扩增30-48h后，离心收集细胞，预处理后进行纯化；步骤S3：先将步骤S2中收集的细胞进行纯化预处理，得到病毒纯化预处理样品，然后将病毒纯化预处理样品依次进行阴离子交换色谱层析和分子筛层析收集得到腺病毒。优选的，所述纯化预处理采用反复冻融法、超声破碎法或高压破碎法。进一步优选的，采用反复冻融法对进行纯化预处理，包括以下步骤：将收集的细胞加入病毒保存液重悬，分装细胞悬液，于-80℃和37℃反复冻融三次得到细胞匀浆；然后向细胞匀浆中加入核酸水解酶，充分混匀，在37℃进行处理后，于转速6000×g、4℃条件下离心20min，收集上清；向收获的上清液中加入缓冲液AB液进行稀释，得到病毒纯化预处理样品。进一步优选的，采用高压破碎进行纯化预处理，包括以下步骤：将收集的细胞加入病毒保存液重悬，用高压破碎仪，采用200-1000bar的高压压力，优选400-800bar的高压压力对细胞进行破碎处理；然后向细胞匀浆中加入核酸水解酶，充分混匀，在37℃进行处理后，于转速6000×g、4℃条件下离心20min，收集上清；向收获的上清液中加入缓冲液AB液进行稀释，得到病毒纯化预处理样品；然后将病毒纯化预处理样品依次进行阴离子交换色谱层析和分子筛层析收集得到腺病毒。其中，核酸水解酶用以去除样品中DNA和RNA。缓冲液AB液是离子层析时的流动相。上述本技术方案按照步骤S1～步骤S3分别为细胞培养、病毒扩增和病毒纯化三部分。本技术方案与贴壁细胞培养受限于载体表面积不同，在悬浮细胞的培养中，细胞的生长受限于培养过程中的细胞密度，因此在悬浮细胞培养过程中对细胞密度进行监测，同时根据培养过程中细胞密度的变化对生物反应器的摇摆速度和角度进行调整，即可以实现高密度细胞培养的顺利进行。采用上述技术方案，摆脱了现有技术通常采用贴壁细胞培养制备重组腺病毒的传统做法，而且现有技术在采用贴壁细胞培养的中试化制备病毒工艺中，常采用生物反应器微载体或片状载体结合的方法，在这种类型的贴壁细胞培养过程中，比表面积和可获得的细胞浓度较小，细胞易受搅拌、珠间碰撞、流动剪切力等动力学因素的破坏，此类载体在某种程度上阻碍了氧等营养成分的传递和病毒对细胞的感染，而且这类载体也较容易受代谢废物积累的影响。上述两种载体均存在吸附血清、易于变形且仅可一次性使用、培养后的分离过程损失细胞等缺点。采用悬浮细胞培养，并采用WAVE反应器，解决了目前中试过程中采用血清培养贴壁细胞制备重组腺病毒所存在的技术缺陷和产品质量稳定性差的问题，也为生产工艺的放大工艺的研发提供了较为直接的理论和可行性数据支持。经过实践发现，采用悬浮细胞培养时，在高密度细胞条件下进行病毒扩增，病毒接种量和扩增时间对病毒的单细胞产量影响很大，因此优化病毒接种量和病毒扩增时间，可以提高单细胞病毒产量，同时，优化纯化工艺，以提高病毒回收率。作为本发明的进一步改进，步骤S1中，在细胞培养的初始阶段，反应器的摇摆速度为10-30rpm，摇摆角度为4-8°；随着细胞培养的进行，当细胞密度达到约1-2×106个细胞/ml时，调整反应器的摇摆速度和角度，同时开始进行灌注培养，灌注速度为5-10L/d，此阶段，反应器的摇摆速度为15-30rpm，摇摆角度为5-10°。作为本发明的进一步改进，步骤S1中，在细胞培养的初始阶段，反应器的摇摆速度为15-25rpm，摇摆角度为5-7°；在进行灌注培养时，反应器的摇摆速度为20-25rpm，摇摆角度为6-8°。作为本发明的进一步改进，步骤S1中，在WAVE进行细胞培养前，先预运行WAVE生物反应器过夜，检查设备运行及细胞袋无菌情况，设置CO2浓度5％，温度37±1℃，摇动速度15rpm，转动角度5°～8°。作为本发明的进一步改进，步骤S2中，进行病毒扩增时，所述反应器摇摆速度为15-30rpm，摇摆角度为6-12°。作为本发明的进一步改进，步骤S2中，进行病毒扩增时，所述反应器摇摆速度为20-25rpm，摇摆角度为7-10°。作为本发明的进一步改进，步骤S3中，在进行所述阴离子交换色谱层析中，对色谱柱先进行预处理，然后用病毒纯化预处理样品上样，上样量为5×1013-1.5×1015VP，上样流速20-50mL/min；上样后梯度洗脱，洗脱流速30-70mL/min；腺病毒特征峰出现后收集第一次层析的样品，然后用于下一步纯化。优选的，其中洗脱过程中，洗脱梯度为30％B液，2-4CV，30-60％B液，4-6CV，100％B液，1-2CV。作为本发明的进一步改进，所述对色谱柱先进行预处理包括以下步骤：依次以1-2倍CV的0.5MNaOH洗柱，1-2倍CV的注射用水、以及1-2倍CV的BB液分别冲洗色谱柱，最后，用2-4倍CV的AB液平衡色谱柱。作为本发明的进一步改进，所述色谱柱中采用的层析填料为Source30Q。作为本发明的进一步改进，所述色谱柱中采用的层析填料为QSepharoseXL。作为本发明的进一步改进，步骤S3中，在进行所述分子筛层析中，以2-4倍CV的病毒保存液平衡分子筛层析柱；用经阴离子层析纯化后的样品上样，上样体积2％-20％CV，流速20-30mL/min；以病毒保存液洗脱，洗脱流速为20-30mL/min，腺病毒特征峰出现后开始收集腺病毒样品；所述分子筛层析柱的填料为Sepharose4FastFlow。优选的，所述WAVE反应器为美国GE公司的WAVE生物反应器系统20/50，是为实验室规模细胞培养、工艺开发和生产而设计的通用型生物反应器系统，控制更加可靠。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的技术方案利用WAVE工艺无血清培养悬浮细胞制备重组腺病毒，解决了目前中试过程中采用血清培养贴壁细胞制备重组腺病毒所存在的技术缺陷和产品质量稳定性差的问题。采用培养贴壁细胞制备重组腺病毒一方面产量受基质表面积的限制，以及需要采用胰酶消化分离细胞，增加后续纯化成本，另一方面，需要使用牛血清，细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，而且不同批次牛血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，制品中残留的牛血清易引起接种者对血清的过敏反应。采用细胞工厂或瓶皿等贴壁培养方式进行中试生产，所需器具很多，占用空间大，每个器具之间存在操作以及细胞生长等差异，在继续扩大工艺的过程中采用这种方法既不现实，也不能满足临床研究中对病毒样品质和量的需求，而此时再进行工艺的更改需要重新进行工艺开发，需要再次耗费大量人力和物力。采用生物反应器结合片状载体或微载体等贴壁培养形式同样存在一定的不足，以应用最广的Pharmacia公司生产的Cytodex系列和Cytopore系列为例，Cytodex系列尽管具有细胞贴壁快，生长快，能长时间培养等优点，但其比表面积和可获得的细胞浓度较小，细胞易受搅拌、珠间碰撞、流动剪切力等动力学因素的破坏。尽管Cytopore系列解决了因搅拌、气泡等引起的机械损伤，而且细胞可以拥有更充分的生长空间，但这种培养方式在某种程度上阻碍了氧等营养成分的传递和病毒对细胞的感染，而且这种微载体也较容易受代谢废物积累的影响。上述两种微载体均存在吸附血清、易于变形且仅可一次性使用、培养后的分离过程损失细胞等缺点。而采用无血清培养悬浮细胞，细胞生长受细胞密度影响，采用稀释法即可刺激细胞生长，操作简单，采用WAVE生物反应器可通过调整反应器摇摆角度和摇摆速度即可调整溶氧量以满足细胞的高密度生长，接种病毒过程中，病毒与细胞能够充分接触，保证了病毒的感染效率，灌流后代谢废物能及时清除，减少了代谢废物对细胞的影响，培养过程不使用牛血清，保证了产品质量稳定，WAVE生物反应器成熟的控制体系和完善的产品规格也使得后续的工艺放大成为可能，保证了生产放大过程中工艺评价的一致性，小试以及中试工艺开发即采用WAVE生物反应器建立细胞培养和病毒生产工艺为生产工艺的放大提供了较为直接的理论和可行性数据支持。本发明中优选采用的美国GE公司的WAVE生物反应器系统20/50，为实验室规模细胞培养、工艺开发和生产而设计的通用型生物反应器系统，依托于这个系统可以实现100mL-10L甚至25L的放大需求，后期通过采用同一工作原理的其他更大规模的WAVE生物反应器系统进行cGMP生产工艺研发，即可轻松实现小试、中试、生产三个阶段工艺放大，保证了研发工艺的连续性和稳定性，减少工艺研发投入，提高了工艺研发效率。附图说明图1是本发明不同病毒接种量及收获时间的结果图。图2是本发明不同的预处理方式病毒释放效果对比图。图3是本发明重组腺病毒柱阴离子交换层析纯化图。图4是本发明细胞袋工艺稳定性研究分析比较图。具体实施方式下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。本发明提供了一种利用WAVE生物反应器进行无血清培养悬浮细胞中试化生产重组腺病毒的技术，包括如下步骤：步骤S1：细胞培养；预运行WAVE生物反应器过夜，检查设备运行及细胞袋无菌情况，设置CO2浓度5％，温度37±1℃，摇动速度15rpm，转动角度6°左右。确认设备运行以及细胞袋无菌情况正常后，取制备好的悬浮细胞HER096种子液转移至20L细胞袋中，使得细胞初始密度为3-5×105个细胞/mL。设定培养参数如下：温度为37℃±1、二氧化碳浓度5％、通气量0.2Lpm，在培养过程，根据细胞密度逐级调整反应器摇摆速度和角度。在本发明的初始阶段，反应器的摇摆速度为10-30rpm，优选15-25rpm，摇摆角度为4-8°，优选5-7°。随着细胞培养的进行，当细胞密度达到1-2×106个细胞/ml时，再次调整摇摆速度和角度，同时开始灌注培养，灌注速度5-10L/d。在该阶段，反应器的摇摆速度为15-30rpm，优选20-25rpm，摇摆角度为5-10°，优选6-8°。步骤S2：病毒扩增；采用本发明的细胞培养工艺培养悬浮细胞HER096，培养至细胞密度达到1-2×106个细胞/mL时，根据培养期间细胞密度的变化及时调整反应器摇摆角度和摇摆速度，同时启动灌注培养，灌注速度5-10L/d，使用新鲜的培养基逐步稀释培养袋中的培养液。在细胞密度达到4-6×106个细胞/ml时，计算细胞袋中总的细胞数量，调整病毒种子液中病毒颗粒数，按照MOI(VP/cell)＝100:1-300:1接种重组腺病毒，染毒2-3h后，启动灌注程序，灌注速度5-10L/d。病毒扩增期间，反应器摇摆速度为15-30rpm，优选20-25rpm。摇摆角度为6-12°，优选7-10°。病毒扩增30-48h后，离心收集细胞，预处理后进行纯化。步骤S3：病毒纯化；3.1纯化预处理向收获的细胞沉淀中加入缓冲液重悬，采用优选的预处理方式处理细胞沉淀，于转速6000×g，4℃条件下，离心20min，收集上清。向收获的上清液中加入AB液进行稀释，为病毒纯化预处理样品。3.2阴离子交换色谱层析本步骤中采用的层析填料为GE公司的Source30Q，优选QSepharoseXL，依次以1-2倍CV的0.5MNaOH洗柱，1-2倍CV的注射用水，以及1-2倍CV的BB液冲洗色谱柱。最后，用2-4倍CV的AB液平衡色谱柱。用病毒纯化预处理样品上样。上样量为5×1013-1.5×1015VP，上样流速20-50mL/min。上样后梯度洗脱，洗脱流速30-70mL/min，洗脱梯度为30％B，2-4CV，30-60％B，4-6CV，100％B，1-2CV。腺病毒特征峰出现后开始收样，样品用于下一步纯化。3.3分子筛层析本步骤中使用的层析柱填料类型为Sepharose4FastFlow，以2-4倍CV的病毒保存液平衡层析柱。用经阴离子层析纯化后的样品上样，上样体积2％-20％CV，流速20-30mL/min。以病毒保存液洗脱，洗脱流速为20-30mL/min，腺病毒特征峰出现后开始收样。纯化后的病毒样品送质量部门检测各项指标。实施例1病毒感染复数MOI(VP/cell)以及病毒扩增时间的优化。在本发明的病毒扩增阶段，对病毒扩增效果影响较大的因素为病毒接种量以及病毒扩增时间，因此，确定病毒扩增阶段生物反应器的摇摆条件，同时对病毒接种量和病毒扩增时间进行优化。具体如下：取制备好的悬浮细胞种子液接种至20L细胞袋中，使得细胞初始密度约为3-5×105个细胞/mL，以摇摆速度为10-30rpm，优选15-25rpm，摇摆角度为4-8°，优选5-7°的摇摆条件培养细胞，培养至细胞密度达到1-2×106个细胞/mL时，根据培养期间细胞密度的变化及时调整反应器摇摆角度和摇摆速度，具体为摇摆速度为15-30rpm，优选20-25rpm，摇摆角度为5-10°，优选6-8°。同时启动灌注培养，灌注速度5-10L/d，使用新鲜的培养基逐步稀释培养袋中的培养液。在细胞密度达到4-6×106个细胞/ml时，计算细胞袋中总的细胞数量，调整病毒种子液中病毒颗粒数，按照MOI(VP/cell)为100:1、300:1、500:1、700:1分别接种重组腺病毒，染毒2-3h后，启动灌注程序，灌注速度5-10L/d。病毒扩增期间，反应器摇摆速度为15-30rpm，优选20-25rpm，。摇摆角度为6-12°，优选7-10°。分别于病毒扩增30h、48h、60h、72h收获病毒，结果见图1。从实验结果可知，随着病毒接种量的提高，病毒收获时间随之提前，综合考虑工艺放大可行性和工艺成本，本发明的病毒扩增工艺中病毒接种量和收获时间优选MOI(VP/cell)＝100:1-300:1，扩增30-48h后收获病毒。实施例2病毒纯化工艺预处理方法优化。在病毒纯化阶段，细胞破碎的预处理影响着病毒的释放效果，该步骤的回收率直接影响本阶段工艺的最终纯化效果，因此对细胞破碎条件进行优化。本发明采用反复冻融裂解，超声破碎、高压破碎的方法预处理细胞培养物。实验分三组进行，具体如下：A组反复冻融裂解：收获细胞后，于4℃、1000×g转速下离心10min，弃上清，向细胞沉淀中加入适量的病毒保存液进行重悬，重悬后在-80℃冻存后，于37℃融化至刚刚成液体后重新放入-80℃冷冻，反复冻融，随后4℃、2000×g转速下离心40min，取上清液送检，分别检定病毒颗粒数和病毒滴度。B组超声破碎：收获细胞后，于4℃、1000×g转速下离心10min，弃上清，向细胞沉淀中加入适量的病毒保存液进行重悬，调节超声破碎仪参数为：AMPL20％-60％，time1min，pulse3s，3s，temp4℃，对重悬的细胞按此条件超声处理3次。随后4℃、2000×g转速下离心40min，取上清液送检，分别检定病毒颗粒数和病毒滴度。C组高压破碎：收获细胞后，于4℃、1000×g转速下离心10min，弃上清，向细胞沉淀中加入适量的病毒保存液进行重悬，调节压力参数200-1000bar，将重悬的细胞经高压破碎处理后于4℃、2000×g转速下离心40min，取上清液送检，分别检定病毒颗粒数和病毒滴度。实验结果见图2，从实验结果可知，使用反复冻融、超声破碎、高压破碎等方式均可获得较好的病毒释放效果，其中以高压破碎效果最佳，超声破碎效果次之，反复冻融效果稍差，但就比滴度而言超声破碎效果较其他两种方法处理的病毒比滴度更低，即超声破碎会对病毒活性造成一定损失，因此本发明纯化工艺中纯化预处理的方法优选使用高压破碎细胞释放病毒，4℃，2000×g转速下离心40min取上清进行纯化，但反复冻融和超声破碎也可实现释放病毒的目的。实施例3病毒纯化工艺离子交换色谱层析工艺优化。分别采用美国GE公司的Source30Q、QSepharoseXL以及德国MERCK公司FractogelDEAE为介质对预处理后收获的上清液进行纯化，纯化结果见表1。从表1中可知，使用纯化介质Source30Q和QSepharoseXL均达到了较好的回收效果，两种介质均可用于重组腺病毒纯化。Source30Q吸附能力最强，同时也吸附了更多的杂质，相对更难以清洗。相较于QSepharoseXL，Source30Q的使用成本更高。因此在纯化工艺中可选择Source30Q作为层析介质，综合工艺放大及生产成本，优选QSepharoseXL。表1不同交换层析柱纯化结果比较实施例4病毒纯化工艺采用优选的美国GE公司的QSepharoseXL填料，依次以1-2倍CV的0.5MNaOH洗柱，1-2倍CV的注射用水，以及1-2倍CV的BB液冲洗色谱柱。最后，用2-4倍CV的AB液平衡色谱柱。上样量为5×1013-1.5×1015VP，上样流速20-50mL/min。上样后梯度洗脱，洗脱流速30-70mL/min，洗脱梯度为30％B，2-4CV，30-60％B，4-6CV，100％B，1-2CV。腺病毒特征峰出现后开始收样，样品用于分子筛层析。本发明中分子筛层析使用的层析柱填料类型为Sepharose4FastFlow，以2-4倍CV的病毒保存液平衡层析柱。上样体积2％-20％CV，流速20mL/min。以病毒保存液洗脱，洗脱流速为20mL/min，腺病毒特征峰出现后开始收样。参照上述参数进行病毒纯化，纯化后的病毒样品送质量部门检测各项指标。结果见表2。从实验结果可见，本发明的纯化工艺纯化获得的重组腺病毒原液质量符合2015版《中国药典》以及《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》的相关规定。表2采用优化的纯化工艺纯化后的病毒原液检测结果检验项目质量标准原液总病毒数(VP)——4.12×1014体积(mL)——389病毒颗粒数(VP/mL)——1.06×1012病毒滴度(IU/mL)——5.63×1010病毒比滴度≥3.3％5.31％病毒纯度(HPLC法)>95％100％病毒纯度(紫外吸收法)1.2～1.41.27腺相关病毒(AAV)不得检出没有检出，符合要求宿主细胞DNA残留量≤10ng/剂量<10ng/剂量细菌内毒素<10EU/剂量<10EU/剂量表2中的宿主细胞DNA残留量、细菌内毒素采用检测试剂盒检测，根据阴阳性结果判定。实施例5工艺稳定性实验。按照前述实施例中确定的工艺参数和要求，连续进行3批次生产，三批细胞培养袋培养批号分别为：W1、W2和W3，三批细胞袋培养细胞生长曲线见图4。从图4可看出，采用WAVE20L细胞袋进行3批次培养过程中，批次之间的细胞总量保持高度一致，这说明确定的细胞培养袋工艺稳定、可重复性强，适合作为中试规模重组腺病毒样品生产的生产工艺。WAVE20L细胞袋培养工艺中，细胞在良好的状态下生长代谢，使细胞在对数生长期同步的情况下扩增病毒，收获病毒细胞按实施例中的纯化工艺进行纯化，纯化后样品产量信息和质检结果分别见表3和表4。可以看出，三批样品所获得的总病毒数在1.0-1.5×1015VP之间，批次之间产量相对稳定，纯化后病毒颗粒数为5-7×1014VP之间，病毒颗粒数回收率在44％-47％之间。说明WAVE反应器20L细胞袋病毒扩增工艺和纯化工艺均有一定的稳定性。由表4可以看出，采用本发明工艺制备的重组腺病毒原液质量能够满足药学研究和临床申报需求。表3三批样品产量和收率统计表表4三批原液质检结果统计表以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3