大豆根和根瘤特异表达的启动子及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种大豆根和根瘤特异表达的GmPHT1.11启动子及其应用。

背景技术：

启动子是基因中重要的顺式作用元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。启动子根据转录模式不同可分为三种：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组织或器官特异性启动子的活性是受特定的组织细胞结构和化学、物理信号诱导调节的，即这类启动子的表达具有特定的时空性。在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，提高区域表达量，同时也可以避免目标基因在其他组织器官中表达造成的不利影响。

到目前为止，已有大量的组织或器官特异性启动子被分离出来，其中包括叶片特异启动子、花特异启动子和种子特异启动子及根特异启动子等。根是植物体吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白(calreticulin)基因构建融合表达载体。转基因烟草水培研究结果表明：根细胞不仅能够高效产生GFP，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中(Borisjuk et al.,1999)。此外，应奇才等运用松树根特异性启动子PmPgRP10驱动CMO/BADH双价基因并转入水稻。对转基因植株根和叶的CMO酶、BADH酶活性及其它生理生化指标进行了测定，结果表明：CMO/BADH双价基因可在根部特异性表达(应奇才，2006)。

GmPHT1.11基因属于植物磷转运蛋白的家族成员，在调控磷的转运过程中起着重要的作用。因此有必要研究和获得调控大豆磷转运基因GmPHT1.11的启动子序列，从而为深入研究植物磷转运过程提供有效手段和途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供调控大豆磷转运基因GmPHT1.11的启动子序列，从而为在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根(和根瘤)中特异表达目标基因提供有效途径。

为达到以上目的，本发明提供了一种大豆根和根瘤特异表达的GmPHT1.11启动子，其具有：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的大豆磷转运基因GmPHT1.11的启动子(SEQ ID No.1)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到所述启动子的突变序列。例如在非活性区段，在不改变启动子功能的情况下，进行以下取代方式中的至少一种所获得的核苷酸序列：将第70位的A取代为C,将第270位的T取代为A,将第2788位的C取代为G。

本发明还提供了含有GmPHT1.11启动子的载体、宿主细胞、转化植物细胞或表达盒。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，只要适合GmPHT1.11启动子的表达即可，例如可以为市售的载体及质粒。

本发明还提供了GmPHT1.11启动子或含有其的上述生物材料在调控下游基因在植物根或根瘤特异表达中的应用。

本发明还提供了GmPHT1.11启动子或含有其的上述生物材料在提高下游基因在植物根或根瘤表达量中的应用。

本发明还提供了GmPHT1.11启动子或含有其的上述生物材料在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了GmPHT1.11启动子或含有其的上述生物材料在植物根和根瘤发育调节中的应用。

本发明还提供了GmPHT1.11启动子或含有其的上述生物材料在植物种质资源改良中的应用。

本发明还提供了GmPHT1.11启动子或含有其的上述生物材料在植物育种中的应用。

优选地，上述植物为作物、林木、蔬菜、花卉、牧草。

更优选地，上述植物为作物。最优选为大豆。

本发明还提供了从大豆基因组中克隆得到2923bp的GmPHT1.11启动子序列所用的特异性引物，其包括正向引物：5’-attgGAGCTCTGTAGATACGACATTCAGGGAC-3’，和反向引物：5’-gagtTGCGCAGGCGCTGAACCAAGGTTGCTAT-3’。

含有上述特异性引物的试剂盒也属于本发明的保护范围。

上述特异性引物也可用于检测本发明所述的大豆磷转运基因GmPHT1.11的启动子。

本发明首次分离了大豆根和根瘤特异表达的GmPHT1.11启动子，利用GmPHT1.11启动子表达GUS基因，结果表明GmPHT1.11启动子可明显促进植物根和根瘤中GUS基因的表达量，因而，GmPHT1.11启动子在植物根和根瘤具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根和根瘤中特异表达目标基因并能够提高目标基因的表达量。

附图说明

图1为GmPHT1.11-GUS在大豆根中的表达结果，A图为发根的GUS染色，B图为侧根发生处的GUS染色。

图2为GmPHT1.11-GUS在大豆根瘤中的表达结果，A图为根瘤的GUS染色，B图为GUS染色后根瘤的纵切图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1大豆GmPHT1.11启动子的克隆

利用正向引物5’-attgGAGCTCTGTAGATACGACATTCAGGGAC-3’和反向引物5’-gagtTGCGCAGGCGCTGAACCAAGGTTGCTAT-3’从大豆基因组中PCR扩增并测序获得长度为2923bp的GmPHT1.11启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR产物两端分别带有Sac I和Fsp I的酶切位点及保护碱基。

上述PCR扩增体系为：(20μl体系)

PCR程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min共25个循环；72℃10min。

实施例2大豆GmPHT1.11启动子调控下游基因GUS的表达情况

根据实施例1中PCR克隆得到GmPHT1.11启动子，切胶回收产物用Sac I和Fsp I双酶切。将载体pCAMBIA3301(pCAMBIA3301购自澳大利亚Cambia公司)先用HindⅢ和Nco I双酶切掉35S启动子后用Klenow补齐成平末端，Solution I自连后转化至DH5α中扩繁。提质粒后再用SacI和Sma I双酶切，回收后与GmPHT1.11启动子的回收片段用Solution I连接。获得双元表达载体pGmPHT1.11::GUS，将植物表达载体pGmPHT1.11::GUS转化至大肠杆菌DH5α中扩繁。

大肠杆菌感受态细胞的转化，包括：(1)制备含卡那霉素的LB固体培养基；(2)取出贮存于-80℃的感受态细胞，冰浴中融化后，加入5μl连接产物轻轻混匀，冰浴中放置30分钟；(3)42℃热激30秒，然后立即置于冰浴中3分钟；加入300μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(160rpm)；(4)取适量培养液均匀涂于选择性培养基上，37℃倒置培养16小时，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200μl选择性液体LB培养基中摇菌培养；(5)PCR检测筛选到的阳性克隆扩繁提质粒后转化农杆菌EHA105。通过发根农杆菌介导转化方法，将pGmPHT1.11::GUS转入大豆天隆一号，获得转化pGmPHT1.11::GUS的发根50条。

GUS活性分析表明，GmPHT1.11启动子在植物的根(图1)和根瘤(图2)中特异表达，尤其是在根的维管束及根冠(见图1的A图和B图)部位表达最强，可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的根(和根瘤)中特异表达目标基因。

发根农杆菌介导的大豆转化及根瘤接种的方法：

(1)将大豆用氯气熏蒸法灭菌12个小时后，取出置于超净台吹净剩余氯气后，用灭菌的超纯水浸泡16小时备用；

(2)将带有pGmPHT1.11::GUS的农杆菌K599挑单克隆活化后，试管小摇后用YEP大摇至菌液OD在0.8-1.0之间，4000转，22℃离心10min后，重悬于LCCM(1/10X Gamborg B₅盐,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,pH 5.4.灭菌后加入40mg/L乙酰丁香酮)中；

(3)将浸泡好的大豆的胚根切下，以下胚轴为外植体，将外植体浸于重悬菌液中30min完成侵染，在滤纸上吸干浸染液，将侵染后的大豆外植体置于CCM(1/10X Gamborg B₅盐,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,4.25g/L琼脂,pH 5.4.灭菌后加入Cysteine 400mg/L,and 40mg/L乙酰丁香酮)上避光培养3天；

(4)将共培养后的大豆外植体的下胚轴插入发根诱导培养基(1X Gamborg B₅盐,30g/L蔗糖,and 0.59g/L MES,7g/L琼脂，pH5.7.灭菌后加入Cefotaxime 100mg/L)中，长日光照下培养10-14天诱导发根，发根生长至2cm时，取材；

(5)将诱导成熟的发根(根长≥3cm)取出洗净培养基，置于根瘤菌HH103悬浮液中浸染30min，完成根瘤菌接种，将接种后的发根复合植株置于浇灌BD营养液的蛭石中，长日光照培养12-14天后可见幼嫩根瘤，取材。

转化株的GUS染色：

(1)将组织样品加入90％丙酮中，置于冰上20～30分钟；

(2)经丙酮处理后，用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)、2mM K₄Fe[CN]₆及2mM K₃Fe[CN]₆溶液润洗组织；

(3)将样品放在X－Gluc染色液中(50mM磷酸缓冲液(pH7.2),1mM X-gluc,2mM K₄Fe[CN]₆,2mM K₃Fe[CN]₆)，抽气10分钟，然后37℃染色过夜；

(4)第二天用70％乙醇脱色；

(5)在载玻片上加几滴HCG溶液，将脱色后的样品置于其中；

(6)压片，透明15分钟或者过夜透明(根据组织的发育时期而定)。

GUS染色液配方：

20mM X-gluc(MW＝521.8)

用DMSO或N,N-二甲基甲酰胺溶解，100mg X-gluc需用9.58ml DMSO溶解,终浓度为20mM。

50mM磷酸缓冲液(pH7.0)

A液：NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

B液：Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

取39mlA液与61mlB液混合。

染色液配制：5mM铁氰化钾；5mM亚铁氰化钾；10mM EDTA；50mM磷酸缓冲液；1mM X-gluc。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 大豆根和根瘤特异表达的启动子及其应用

<130> KHP161114909.4Q

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2923

<212> DNA

<213> GmPHT1.11启动子

<400> 1

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taaaacaaaa ctacactttt ttttatatat atgttggaag ccagcttagg gtggaaagtg 2700

caacttacaa gctttaacgc taaacattgt gttctcaaat atcaatgaat ttcccttgaa 2760

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atgtctcaat tgtcaaaatc caaggagtct ataaaacaat catgttccaa cccttttgtt 2880

ttgctcacac tttaccgtca gatagcaacc ttggttcagc gcc 2923

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 32

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<213> 人工序列

<400> 3

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