猪肝羧酸酯酶基因的调控序列的制作方法

本发明属于动物基因工程
技术领域：
，具体涉及猪肝羧酸酯酶基因(简称PLE1)的调控序列，对该调控序列进行了相关的生物信息学分析和功能验证。
背景技术：
：猪肝羧酸酯酶(piglivercarboxylesterase,PLE)又称为猪肝酯酶(pigliveresterase)，是由多种同功酶组成的酶家族。PLE独特的手性水解特性使得其在有机化学合成领域具有不可取代的地位(Roberti2000)，也使得对PLE近一个世纪的研究主要围绕其在有机化学合成方面的应用开展。研究发现，PLE能够水解丁酰胆碱、芳香胺等内外源性酯类、酰胺类化合物，因此有理由相信PLE在猪体内酯类物质代谢等生理过程中发挥重要作用，如药物的代谢(Morris2008)、毒物的解毒、调节机体炎症水平等(Liu2015,Brüsehaber2009)。PLE是哺乳动物中最复杂的羧酸酯酶家族，成员多且理化特性相似，用物理化学方法很难分离纯化获得单一成分的同工酶。早在20世纪60年代，人们就尝试从猪肝脏中提取天然的PLE，发现从猪肝脏中提取的PLE是多种同工酶的混合物，且同工酶的水解特性各不相同(Adler1961)，这些因素严重阻碍了对PLE的研究应用。分子生物学研究技术的快速发展，使获得单一成份的PLE成为可能。PLE1～PLE6及APLE七种同工酶相继被克隆表达(Lange2001,Hermann2008)，并对它们的cDNA序列和氨基酸序列进行分析比对，发现N-端18个氨基酸的信号肽序列和C-端His-Ala-Glu-Leu内质网潴留信号(Junge1979)，还参照人羧酸酯酶晶体结构，通过同源建模对PLE的空间结构也有了初步的了解(Hasenpuschetal2011)。基于前期对PLE基因的充分研究，我们对现有的PLE基因序列和cDNA序列分析比对发现，不同的PLE亚型，不仅外显子高度相似且内含子同源性也很高，若用第二代基因测序方法和常规的PCR技术得到的片段，无法获得完整的PLE基因及其上游完整的调控序列。随着三代基因测序的兴起，近些年来，许多大片段复杂基因组的基因序列、结构及功能的研究可以通过构建BAC文库并结合三代测序技术来完成(Ostermann2016)，利用已经建立的BAC文库筛选目的基因完整序列的方法是目前应用比较广泛的生物学技术(Brune2000)，在人类和动物基因组计划的研究中，目前已成功构建了猪(Suzuki1997)、人(Asakawa1997)、鱼类(Jiang2016)、桑蚕(Chen2015)的BAC基因组文库。虽然对PLE的研究已经比较充分，但关于PLE基因序列的数据，尤其是调控机制的研究还存在很大的空白，权威数据库中提供的PLE基因序列残缺不全或顺序混乱，不能为进一步的研究提供充足的依据，严重制约了后续对PLE基因调控机制的研究和应用。同时，在本课题组前期的研究发现，不同亚型的PLE在同一个体组织器官内的表达量存在很大差异，同一亚型PLE在同一个体的不同年龄段的表达量也存在很大差异，而调控序列对目的基因的调控作用对PLE在猪体内各组织表达量的高低起着举足轻重的作用。所以本发明利用成熟的PacBio三代测序技术，从已构建好的荣昌猪BAC文库中筛选获得PLE1基因完整序列及其上游完整的调控序列并对该调控序列进行生物信息学分析和功能验证，以期对后期PLE1调控机制及相关方面的研究提供参考，同时可以应用于药物代谢、临床用药及基因工程和DNA疫苗等方面。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得猪肝羧酸酯酶基因1(PLE1基因)调控序列，并对该调控序列进行生物信息学分析和功能验证。实现本发明的技术方案如下所述：本发明利用前期申请人构建的荣昌猪BAC基因组文库(Liu2010)，根据PLE外显子保守区域设计合适的引物从文库中筛选BAC阳性克隆，然后用第三代PacBio单分子式测序技术(平均读长10kb)，测定BAC阳性克隆(平均长110kb)中的PLE基因，进行正确拼接，结果获得PLE1完整的基因序列及其22,655bps的调控序列(即在PLE1基因的上游位于-22,655bp～-1bp)，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，对PLE1基因上游调控序列进行生物信息学分析，发现该调控序列上存在两段720bps的反向互补序列，可以形成特殊的Loop环状结构。功能验证发现该特殊结构可以上调下游PLE1基因的表达。本发明的技术方案如下所述：申请人提供了一种上调猪肝羧酸酯酶基因1(PLE1基因)表达的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。上述的一种上调猪肝羧酸酯酶1(PLE1)基因表达的DNA片段，在所述的核苷酸序列中包含有两段720bps的反向互补序列，这两段反向互补序列构成一个如图7所示的Loop环状结构，且位于PLE1基因调控序列的-5132/-4413bp和-802/-82bp，中间间隔3611bps。本发明的一种上调猪肝羧酸酯酶1(PLE1)基因表达的DNA片段在上调PLE1基因的表达中的应用。进一步，本发明的猪肝羧酸酯酶基因表达的DNA片段，可在上调猪肝羧酸酯酶基因表达以及临床用药中应用。本发明的步骤如下1.引物的设计及验证分析已知的γ-PLE的cDNA序列(GenBank:X63323)和NCBI上不完整的PLE基因序列，根据AG-GT规则，发现PLE编码区由14个外显子组成，对部分已知PLE基因的外显子和内含子序列进行Blast比对分析，发现PLE基因的一些外显子区域高度保守，而且不同PLE亚型的内含子大小也存在明显差异，据此，跨Exon4尾和Exon5头部设计引物(引物序列见表1-ID1)。设计引物后送武汉擎科生物技术公司合成，然后用猪基因组作为模板进行PCR扩增和0.8％琼脂糖凝胶电泳，鉴定表1所述的引物是否能扩增出与预期大小相符的条带。表1从荣昌猪BAC文库筛选PLE基因的引物序列2.PCR三步法筛选BAC阳性克隆选用荣昌猪BAC基因组文库，以一头雄性荣昌猪(一种常见的四川地方猪品种)静脉血基因组构建，装配500块384板池，共包含192,000个克隆，感受态细胞为TransforMaxEPI300E.coli,克隆的质粒载体是pCC1BACTM全长8128bp，插入的基因片段平均为116kb，大部分片段分布在90-140kb，筛选文库的空载率为1.4％，覆盖猪基因组7倍，通过对随机克隆的HindIII酶切图谱进行分析检测，证明该文库中BAC克隆的稳定性好、冗余度低，可用于猪体内基因的筛选。因此采用此BAC基因组文库，有望筛选到PLE基因阳性克隆。3.阳性BAC克隆的质粒提取及鉴定将筛选得到的阳性BAC克隆转接到LB液体培养基(含12.5μg/mL的氯霉素)中，置于37℃、200rpm摇床，摇菌过夜(16h)扩大培养，用BAC/PACDNAIsolationKit(购自美国OMEGA公司)按照说明书提取阳性质粒。用NANODROP2000C超微量分光光度计(ThermoScientific)检测质粒浓度和纯度，取出少量样品进行0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。4.PacBio三代测序及生物信息学分析将鉴定过的BAC阳性质粒送北京百迈克生物科技有限公司，由该公司对该质粒进一步纯化和浓缩，达到三代测序对样品的要求后，用PacBio三代测序法(Eid2009，VanBuren2015)对质粒进行测序。测序完成后用生物信息学方法对基因序列进行分析，拼接成完整序列。PacBio三代测序法平均读长可达10～15kb，单个测序单元测序量可达1G。2015年，DonaldDanforth植物科学中心的研究人员利用PacBioRSII测序系统，以72倍的覆盖度分析了Oropetiumthomaeum245Mb的基因组，并绘制基因组草图，包含端粒和着丝粒序列、长末端重复反转录转座子、串联重复基因，以及其他难以测序的基因组元件，准确性超过99.999％。说明利用该方法测序可得到高质量的、完整可信的基因组数据。然后对测序拼接完整的序列进行生物信息学分析。5.PLE1基因及调控序列的研究通过生物信息学分析发现，在PLE1基因调控序列存在两段720bps的反向互补序列，为了探究其功能，本发明设计合适的两对引物，所述的引物序列如表2所示(ID2F、ID2R、ID3F、ID3R)。以猪的基因组为模板克隆两个不同长度的PLE1基因调控序列片段，一个片段长为5223bps，另一个片段长为4478bps，其中长度为5223bps的片段包含有两段完整的720bps反向互补序列，即可以形成Loop环状结构；而长度为4478bps的片段缺失了上游一段720bps的反向互补序列(序列位于-5132/-4413bp)，无法形成Loop环结构。通过插入pGL3-Basic质粒多克隆位点，构建不同长度的荧光素酶报告质粒，然后提取去内毒素质粒与pRL-TK内参质粒，共转染Hepli永生化猪肝细胞系(由华中农业大学动物医学院王喜亮副教授提供)，用双荧光素酶活性检测试验来初步探究该特殊结构的功能。表2扩增5223bps和4478bps调控序列的引物表1说明：引物序列后面括号里表示添加的酶切位点，引物序列中下划线的碱基为酶切位点。本发明的积极效果：本发明运用PacBio三代测序法测序并组装得到PLE1的完整基因序列，同时获得PLE1基因上游22,655bps的调控序列，分析发现在PLE1基因调控序列存在两段长720bps的反向互补序列，该反向互补序列的上游一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，两者间隔3611bps，两段反向互补序列可形成一个Loop环状结构，经过双荧光素酶活性检测试验，表明该段调控序列形成的特殊结构可以上调PLE1基因的转录表达，为后续研究PLE基因调控机制提供了技术基础，例如可以应用于PLE1转录表达、兽药水解和临床用药方面。更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。附图说明序列表SEQIDNO：1是猪肝羧酸酯酶PLE1基因上游22,655bps的调控序列(-22655bp—-1bp)：在该序列中存在两段720bps的反向互补序列(上游一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，两者间隔3611bps)，两者之间形成Loop环状的特殊结构。图1：pCC1BAC质粒载体图谱。图2：pGL3-Basic质粒载体图谱。图3：pRL-TK质粒图谱。图4：PLE基因引物在猪基因组验证结果。附图标记说明，泳道M1：Marker2000；泳道M2：Marker15000；泳道1：对引物进行验证。图5：利用设计的引物在BAC文库中筛选PLE基因的跑胶图。附图标记说明：图5A为筛选BAC文库确定第62块板池为阳性克隆；图5B为进一步筛选确定该板池第10列为阳性克隆；图5C为最终筛选确定第70个克隆孔为阳性克隆。在跑胶图中，P代表阳性对照(以猪基因组为模板)；N代表阴性对照(灭菌蒸馏水)。图6：BAC阳性克隆质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定胶图。附图标记说明：泳道M：Marker15000；泳道1、2：BAC-70质粒；图7：PLE1基因结构模式图。附图标记说明：黑色方框表示PLE基因外显子，直线表示内含子，☆表示PLE基因相对保守的外显子，箭头表示PLE基因方向，黄色表示PLE基因上游720bps的反向互补序列，与下游一段720bps的调控序列之间形成Loop环。图8：本发明构建的pGL3-Basic-5223bp重组质粒图谱。附图标记说明，紫红色序列表示插入的完整调控序列，包含有两段720bps的反向互补序列，可以形成Loop环状特殊结构。图9：本发明构建的pGL3-Basic-4478bp重组质粒图谱。附图标记说明，绿色序列表示插入的不完整调控序列，缺失一段上游720bps的反向互补序列，不能形成Loop环状特殊结构。图10：本发明pGL3-Basic-4478bp双荧光素酶报告质粒菌落PCR鉴定图。附图标记说明：泳道M：Marker15000；泳道1、2：筛选到的阳性克隆重组质粒。图11：本发明pGL3-Basic-4478bp双荧光素酶报告质粒单酶切和双酶切鉴定图。附图标记说明：泳道M1：Marker15000；泳道M2：Marker2000；泳道1：单酶切；泳道2：双酶切。图12：本发明pGL3-Basic-5223bp双荧光素酶报告质粒菌落PCR鉴定图。附图标记说明：泳道M：Marker15000；泳道1：筛选到的阳性克隆重组质粒。泳道2：阴性克隆跑胶。图13：本发明pGL3-Basic-5223bp双荧光素酶报告质粒单酶切和双酶切鉴定图。附图标记说明：泳道M1：Marker15000；泳道1：单酶切；泳道2：双酶切。图14：本发明PLE1基因上游调控序列双荧光素酶检测结果图。附图标记说明：1：pGL3-Basic-5223bp重组质粒荧光活性；2：pGL3-Basic-4478bp重组质粒荧光活性；3：pGL3-Basic荧光活性。具体实施方式实施例1：引物验证以通城猪(一种常见的湖北地方猪品种)基因组为模板(通城猪基因组DNA样品由华中农业大学动物科技学院刘榜教授馈赠)，用上述表1中引物对(ID1F,ID1R)进行PCR扩增，根据产物的有无和大小，筛选合适的引物，PCR反应体系如表3所示。扩增条件:预变性：94℃5min，变性：94℃30s，退火：62℃1min,延伸：72℃4min，循环数：30cycles,延伸：72℃10min。PCR扩增完成后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。从琼脂糖凝胶电泳图上可以看出扩增的条带大小和预期目标产物大小相近且条带较亮，说明该对引物合适，可以用来从BAC文库中筛选得到PLE目的基因。表3PCR反应体系反应成分用量(μL)猪基因组DNA模板(10ng/μL)0.5基因上游引物(10μM)(表1-ID1F)1基因下游引物(10μM)(表1-ID1R)1LATaq酶1dNTP-MIX(10mM)810*Buffer(Mg2+)5ddH2O33.5总体积50实施例2：克隆、筛选PLE1基因目前用于在BAC文库筛选目的基因的方法共有两种：杂交法和PCR筛选法，PCR筛选法是实验室常规的使用方法且操作程序比较灵活，本实施例采用三步PCR筛选方法，用筛选出的合适引物在已经建立的荣昌猪BAC文库(Liu，2010)中筛选PLE基因。具体操作步骤如下：(1)将保存在-80℃冰箱的BAC文库提前取出放在4℃冰箱解冻，用384复制针将一块384孔培养板上的所有BAC克隆接种到一个LB固体琼脂培养板(附加12.5μg/mL氯霉素)，37℃温箱过夜培养，观察有菌落长出。然后在该LB琼脂培养板上加入5mL的LB液体培养基(因为培养板上的LB是固体培养基，再次加入液体培养基是为了将培养板上的所有克隆子菌落全部涂抹制成菌悬液，取出后扩大培养提取DNA进行PCR筛选)(含12.5μg/mL氯霉素)，用三角涂棒将克隆与LB培养基涂抹混匀，将菌液混合物赶至培养板一边，用枪头吸出加入EP管中备用。(2)将上一步得到的菌液混合物转接LB液体培养基(附加12.5μg/mL氯霉素)后扩大培养，提取BAC克隆的DNA混合物。(3)用每个384孔培养板克隆培养得到的BACDNA混合物为模板进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件和引物验证时的条件体系相同，反应结束后用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，根据凝胶电泳结果初步确定含有阳性克隆的板池。(4)取出确定具有阳性克隆384孔的培养板，用384复制针再次将所有BAC克隆接种到LB琼脂固体培养基上(附加12.5μg/mL氯霉素)，37℃培养过夜。观察到有菌落长出但注意不要让菌落长得太大以至于相互粘连在一起，造成克隆之间的相互污染。(5)取24个1.5mL离心管，每管分装400μL的灭菌水，用牙签分别将每一列的克隆(16个)收集到离心管中，煮沸5min。以该混合菌体为模板，直接进行PCR扩增。操作时一个克隆一只牙签，注意不要让残留在LB琼脂培养基上的克隆之间相互污染，残留克隆的LB培养板封存放在4℃保存备用。PCR反应体系和扩增条件与引物验证时的条件体系相同，反应结束后用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，根据凝胶电泳结果进一步确定阳性克隆列。(6)确定具有阳性克隆的列后，利用步骤(5)操作时残留保存在LB琼脂培养基上的克隆，对阳性列的16个克隆直接做菌落PCR，PCR反应体系和扩增条件与引物验证时的条件体系相同。反应结束后用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，根据凝胶电泳结果确定单个阳性克隆孔。(7)挑出阳性克隆孔置于LB液体培养基(附加12.5μg/mL氯霉素)中，37℃、200rpm摇菌过夜(16h)扩大培养，即得到含有PLE基因的BAC阳性克隆。实施例3：阳性克隆的质粒提取和鉴定将筛选得到的阳性克隆命名为BAC-70，转接BAC-70阳性克隆菌液在LB液体培养基(附加12.5μg/mL氯霉素)中，置于37℃、200rpm摇床，摇菌过夜(16h)扩大培养，用BAC/PACDNAIsolationKit(购自美国OMEGA公司)按照说明书提取质粒。用NANODROP2000C超微量分光光度计(ThermoScientific)进行检测，A260/A280为1.96，A260/A230为2.1。取出5μL质粒样品，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，设定电压50V，4℃电泳3h，样品条带完整，没有杂质污染和明显降解现象，符合PacBio三代测序对样品的要求。然后送北京百迈克生物科技有限公司，该公司对质粒进一步纯化和浓缩(纯化浓缩后质粒浓度达到69ng/μL，样品量共计34.5μg)，用前述的PacBio三代测序法测序，且保证测序数据拼接的准确性。实施例4：BAC质粒测序及生物信息学分析将实施例3所得的质粒测序委托北京百迈克生物科技有限公司将样品质粒构建20kb的文库，通过PacBio单分子测序技术测序后过滤原始下机数据，获得高质量测序数据1,013,780,514bps。SMRTbraryTMLibrary的平均读长达到10kb左右，测序数据准确性为99.999％，说明测序结果可靠。用生物信息学方法分析组装质粒测序结果，获得的BAC-70质粒序列长度为136,257bps。将组装的BAC-70质粒序列与γ-PLE的cDNA序列(GenBank:X63323)进行Blast比对分析，发现BAC-70包含一个完整的PLE1基因及其上游22,655bps的调控序列，PLE1基因的序列长度为33,761bps。PLE1基因的上游调控序列存在2段长达720bps的反向互补序列，即：上游的一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，两者间隔3611bps，两段反向互补序列能形成Loop环状结构，这种特殊结构很可能对PLE1基因的表达调控具有重要意义。实施例5：双荧光素酶重组报告质粒构建以猪基因组为模板，用表2中设计好的两对引物(ID2F、ID2R、ID3F、ID3R)进行PCR扩增，PCR反应条件和扩增体系和实施案例1相同，然后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增出条带大小和预期相符，分别为5223bps和4778bps。扩增产物用PCR产物回收试剂盒进行回收，然后将扩增产物和质粒载体同时进行双酶切，37℃水浴锅酶切4h，酶切体系如表4所示。表4扩增产物和质粒载体双酶切体系然后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳跑胶检测酶切片段大小正确，用胶回收试剂盒将跑胶产物进行回收，再用T4DNA连接酶(购自宝生物工程大连有限公司)将目的片段和质粒载体在16℃水浴锅条件下过夜进行连接，连接体系如表5所示。表5T4DNA连接酶连接体系反应成分用量(μL)T4DNAligase110×T4ligasebuffer1双酶切回收载体pGL3-Basic2双酶切回收目的片段6ddH2OUpto10将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在37℃温箱培养过夜后挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，分别扩增出长约600bps和4478bps的产物，第一个扩增条带大小之所以与原始片段长度(5223bps)不同，证明了Loop环特殊结构的存在，使扩增过程中跨过该特殊结构只进行片段两端的扩增，同时也证明了该两个质粒构建成功，分别命名为pGL3-Basic-5223bp，pGL3-Basic-4478bp质粒。将阳性克隆转接LB液体培养基(含有50μg/mLAmp)扩大培养，提取质粒做单酶切和双酶切鉴定，pGL3-Basic-5223bp质粒单酶切片段长度为9995bps，双酶切得到两个片段分别为2825bps和7170bps，pGL3-Basic-4478bp质粒单酶切片段长9281bps，双酶切得到两个片段长为6246bps和3035bps，鉴定正确说明双荧光素酶重组报告质粒构建成功，双酶切体系如表6和表7所示。表6pGL3-Basic-5223bp质粒单酶切和双酶切鉴定体系表7pGL3-Basic-4478bp质粒单酶切和双酶切鉴定体系实施案例6：双荧光素酶活性检测重组报告质粒构建成功后，将含有重组质粒的菌液转接LB液体培养基(附加50μg/mLAmp)扩大培养，按照去内毒素试剂盒(购自美国OMEGA公司)的说明书介绍的操作方法提取去内毒素质粒，然后用NANODROP2000C超微量分光光度计(ThermoScientific)检测质粒浓度为238ng/μL,246.8ng/μL，按照下面的步骤进行细胞转染：(1)取一瓶细胞形态较好、生长密度在85％左右的Hepli猪肝细胞用0.25％的胰蛋白酶消化，加入不含双抗(青霉素10,000IU和链霉素10,000μg/mL)的完全培养基(配方：10％FBS胎牛血清+90％DMEM/HighGlucose细胞基础培养基(购自Hyclone公司))，吹打成细胞悬液。(2)接种24孔细胞培养板使细胞密度为l×105/孔，放37℃、5％CO2培养箱，当细胞密度达到70％-80％时进行质粒转染。(3)当细胞密度达到70％-80％时，弃去原培养液，用OPTI培养基(购自Gibco公司)洗涤细胞两次，每孔加500μLOPTI培养基。(4)取0.8μg质粒(即报告质粒：内参质粒pRL-TK的总量比＝39:1)加入50μLOPTI培养基，吹打混匀。(5)取Lipofectamine2000Reagent(脂质体转染试剂)(购自invitrogen公司)2μL加入50μLOPTI培养基中，轻轻吹打混匀，室温孵育5min。(4)再将以上步骤(4)和(5)中孵育好的混合液加在一起，轻轻吹打混匀，室温孵育20min。(5)将上述孵育好的100μL混合液加入到一个细胞孔，轻摇混匀，置放37℃、5％CO2培养箱培养，8h后更换成细胞完全培养基(配方：1％双抗+10％FBS胎牛血清+89％DMEM/HighGlucose细胞基础培养基)。(6)在转染细胞24h后，用l×PBS磷酸盐缓冲液(Hyclone公司)洗涤两次，按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书的实验操作步骤进行转染细胞双荧光的检测(双荧光素酶试剂盒购自美国OMEGA公司)。(7)进行3轮独立的试验，每个处理重复3次，将所得数据利用统计学软件SPSS进行分析，重复之误差用SD表示，显著性分析采用单因素方差分析。分析双荧光素酶活性检测实验结果，相比缺失上游一段720bps反向互补序列的重组质粒pGL3-Basic-4478bp的活性，含有两个720bps反向互补序列从而形成Loop环结构的重组质粒pGL3-Basic-5223bp上调下游PLE1基因的转录表达，活性约提高3倍(0.001＜P＜0.01)。说明该调控序列上存在的Loop环特殊结构对下游PLE1基因的表达具有重要调控作用，为后续对PLE1基因调控机制的研究奠定基础。本发明获得的一个PLE1基因上游完整的调控序列，该系列总长22,655bps，其中位于PLE1基因调控序列-5132/-1bp(起始密码子ATG中的A上游的第一个碱基为-1)的位置，存在两段720bps的反向互补序列(上游的一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，两者间隔3611bps)，可以形成Loop环状的结构，通过报告质粒证实该结构对PLE1基因的表达具有上调作用。具有这种特殊结构的启动子从未见报道，因此，本发明不仅对理解PLE基因家族的表达调控机制具有重要意义，而且对理解启动子调控基因表达的理论具有重要补充作用。同时本发明还证明PLE可以水解一些药物，该调控序列对PLE表达的调控作用可以应用于临床用药方面。本发明的这一结构可适用于靶基因的适度上调表达，在基因工程和DNA疫苗的构建上具有实用价值。主要参考文献[1]OstermannE,SpohnM,IndenbirkenD,etal.CompleteGenomeSequenceofaHumanCytomegalovirusStrainAD169BacterialArtificialChromosomeClone[J].GenomeAnnounc.2016,4(2):e00091-16.[2]BruneW,MesserleM,KoszinowskiUH.ForwardwithBACsnewtoolsforherpesvirusgenomics[J].TrendsGenet.2000,16(6),254-259.[3]AsakawaS,AbeI,KudohY,etal.HumanBAClibrary:constructionandrapidscreening[J].Gene,1997,191:69-79.[4]Suzuki,K.ConstructionofaporcineBAClibraryandits4-Dimentional(4D)PCRscreeningsystem[R].ReportofInternationalWorkshoponAnimalGenomeAnalysis,1997,51-57.[5]ChenZW,NohataJ,GuoHZ,etal.Construction,completesequenceandannotationofaBACcontigcoveringthesilkwormchorionlocus[J].Nature(scientificdata).2015,1-6.[6]LiuL,YinJ,LiW,etal.ConstructionofabacterialartificialchromosomelibraryfortheRongchangpigbreedanditsusefortheidentificationofgenesinvolvedinintramuscularfatdeposition[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2010,391(2):1280-1284.[7]JiangLK,YouWW,ZhangXJ,etal.ConstructionoftheBACLibraryofSmallAbalone(Haliotisdiversicolor)forGeneScreeningandGenomeCharacterization[J].MarBiotechnol2016,18:49–56.[8]MorrisAP,BrainKR,HeardCM.Synthesisofhaloperidolprodrugsandtheirhydrolysisbyporcineliveresterase[J].DrugMetabLett.2008,2(4):275-279.[9]RobertiM,RondaninR,FerroniR,etal.Pigliveresterase(PLE)mediatedresolutionofN-substituted4-benzoyloxy-3-carbomethoxypiperidines:aconvenientpreparationof4-hydroxyand4-benzoyloxy-3-carbometho-xypiperidinesinenantiomericallypureform[J].TetrahedronAsymmetry,2000,11,4397-4405.[10]JungeW,HeymannE.CharacterizationoftheIsoenzymesofPig-LiverEsterase[J].2.KineticStudies.EurJBiochem,1979,95(3):519-525.[11]AdlerAJ,KistiakowskyGB.Isolationandpropertiesofpigliveresterase[J].JBiolChem,1961,236(12):3240-3245.[12]LangeS,MusidlowskaA,Schmidt-DannertC,etal.Cloning,functionalexpression,andcharacterizationofrecombinantpigliveresterase[J].Chembiochem.2001,2(7-8):576-582.[13]Hermann,M.MartinU.Kietzmann,MirelaIvancic.etal.Alternativepigliveresterase(APLE)-cloning,identificationandfunctionalexpressioninPichiapastorisofaversatilenewbiocatalyst[J].JBiotechnol2008,133(3):301-310.[14]HasenpuschD,BornscheuerUT,LangelW.Simulationonthestructureofpigliveresterase[J].JMolModel.2011,17(6):1493-1506.[15]LiuZQ,LiuWF,HuangYPetal.Lipopolysaccharidesignificantlyinfluencesthehepatictriglyceridemetabolismingrowingpigs[J].LipidsinHealthandDisease,2015,14(64):1-10.[16]BrüsehaberE,D,BornscheuerUT.Insightintothephysiologicalroleofpigliveresterase:Isoenzymesshowdifferencesinthedemethylationofprenylatedproteins[J].BioorgMedChem.2009,17(23):7878-7883.[17]Eid,J.etal.Real-timeDNAsequencingfromsinglepolymerasemolecules.Science,2009.323(5910):133-138.[18]VanBurenR,BryantD,EdgerPP,etal.Single-moleculesequencingofthedesiccation-tolerantgrassOropetiumthomaeum[J].Nature,2015。当前第1页1 2 3