一株脱硫鞘氨醇杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株鞘氨醇杆菌，具体涉及一株新筛选的脱硫鞘氨醇杆菌及其在生物脱硫中的应用，属于生物与环保技术领域。

背景技术：

硫化氢的释放是生物燃气以及污水处理废水时伴生的主要问题。即生物燃气以及污水处理厂的废水中硫化氢直接或间接地排放到空气中，不但对大气环境造成污染，也对人们的身体健康造成威胁。由于硫化物的腐蚀性、有毒性、恶臭以及高耗氧量等诸多问题，所以工业生产中排放向环境中的废气废水必须使硫化物达到相关行业标准方可允许排放。目前，常用的脱硫手段包括物理脱硫、化学脱硫以及生物脱硫。

传统的脱硫工艺常使用化学法来脱除硫化物，但由于需要不断地消耗脱硫剂，运行成本较高。而生物脱硫技术主要依靠能够自我繁殖的微生物来催化脱硫，脱硫剂可以自我再生，运行成本较低，具有广阔的应用前景。

针对以上的现象，在20世纪50年代，应用微生物进行脱硫的研究就已经开始，截止目前，生物脱硫已经成为了常用的去除硫化物的方法之一。在生物脱硫现有的技术中，常应用自养硫氧化细菌进行硫化物的去除，但也存在一些问题，如菌株的生长速度太慢，不易获得高密度菌体，脱硫效率不高且增加了成本。

如一株耐碱性排硫硫杆菌及其在生物脱硫中的应用(申请号：201110149623.1)，该菌在一定条件下，具有很强的脱除硫化氢的能力，但其不足之处在于该菌的营养类型为严格自养型，在工程实际应用的时候不易快速获得高密度菌体，且该菌的生长速度也较慢，需培养48h。

综上所述，可知目前生物脱硫行业中迫切需要一些生长快速，能快速脱除无机硫的高效脱硫菌株。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有脱硫微生物存在的生长慢、不易获得高密度菌体、脱硫速率慢的问题及不足，提供一株高效脱硫菌株及其在含硫化物的废水、天然气或沼气生物脱硫中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供了一株硫氧化细菌，鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DS-4，于2016年06月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号为：CGMCC No.12632。

本发明提供的鞘氨醇杆菌DS-4从成都市第二污水处理厂好氧池污泥中筛选得到，筛选方法为：采用硫代硫酸钠培养基富集驯化7天，重复3～4次，采用硫化钠培养基进行平板分离，3～4天后菌落生成，挑取单菌落接入硫化钠培养基培养，重复4次以上获得纯菌，其生理特点为：该菌为短杆状、长1.2～2μm、宽0.8～0.1.2μm，革兰氏阴性，无鞭毛；其生长pH为5.0～9.0，最适pH为7.0；生长温度为20～35℃，最适温度为30℃；其菌落呈椭圆形，表面凹陷，颜色为乳白色；该菌营养类型为兼性营养型，能利用牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等有机碳源进行异养快速生长，也能利用二氧化碳为唯一碳源进行自养生长；在以二氧化碳为唯一碳源进行自养生长时，该菌能够利用氧气将硫化物氧化为单质硫或硫酸盐。

2HS^-+O₂→2S+2OH^-

HS^-+2O₂→SO₄^2-+H⁺

其次，本发明还提供了菌株CGMCC No.12632的应用，脱硫效果验证显示，该菌株在自养条件下5h内实现了99.13％的硫化物去除，77.9％的单质硫转化率。该菌株用于生物脱硫。

本发明还提供了在菌株筛选和培养过程中使用到的培养基，其培养基配方为在驯化富集过程中优化得到，配方为：(1)硫化钠培养基，用于菌株筛选和脱硫效果实验，其配方为：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液调节pH至中性。(2)硫代硫酸钠培养基，用于菌种富集，培养基配方为：Na₂S₂O₃.5H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml，用1mol/L的NaOH或HCl溶液调节pH至中性。(3)有机碳源异养培养基，用于扩大培养和验证该菌的营养类型：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH 7.0～7.2。

本发明提供了上述菌株的16SrDNA鉴定结果。经过16SrDNA鉴定及BLAST比对，DS-4与鞘氨醇杆菌属的同源性达到了99％，因此鉴定该菌株为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DS-4。本发明提供的鞘氨醇杆菌的16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示：

GAAGGATGGCGTCTGTCTACAATGCAGTCGAGCGCACCCTTCGGGGTGCTCGGTGTCCGGGTGAATAGTGCGTGACGGTAGGCCCTTTGGTGCGCAATCTACCCGTATCACGGGGATAGCCCCAGTATGCGCCCTTCGGGGCAAAGATTTATCTCCCCCGGCATCCCCGCGTTGGATTAAGTTATTGGAGGGGTATGGGCTCACGTGACCTAAGATCCTTGGTGGTTTGAGAGGATGATCAGCGAACATGTCACTGAGATCTGACCAGACTCCTACCACACGGGTACTGGGACAATCTTAAAACTCCTACGCAACCCTGATCTAACGATGCCTGGTGAATGATGACAGCCCTGAACCTGCCATGCTCTTTGCACGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGTTAGGCTAACTCCCCGTCTACATGTACGTGGCTGAATGTACCGCTAGCGTTGTGCTCAATTACTGGCCGGCCAGCGCACGTAGTAATACCGAAGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAGAGGTGCCTACGCGGTACTTTAAGTCGAGGGTGAGAGACTGCGTGTTATTGTCGTGTGCCTTTGATACTGAAGTGCTTGAATGCAATACAAGACGGCGGAGTGAGACACTGACTCGATACATGCATAGAAGTGTCTCAGAATGCCGATTGCGAAAGGATCTGTCTACTGCGTTACTGACCCCTGATGCAAAAAATGCTGGTCATCGAACAGCATGATGTACCCTTGACAGACCCTACCCCTATAAAGATGACAACTCCGATGATTGCACCCTACCCGATCACATCCCAAACGAAATCGATAAGTTTCTCCATCTTGGCGAGGGCGCTTCGTGCGTTTTGTATTTA

本发明涉及的相关保藏信息为：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年06月16日；保藏编号：CGMCC No.12632；命名为：鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DS-4。

本发明的优点在于：

(1)本发明涉及的鞘氨醇杆菌的营养类型为兼性营养型，在异养条件下实现菌体的快速繁殖，在自养条件下实现高效脱硫。利用有机碳源异养培养基对菌株进行扩大培养获得高密度菌体，用于实现生物脱硫工程的快速启动。

(2)本发明涉及的鞘氨醇杆菌的脱硫速率较快，自养条件下5h硫化物去除率可达到99.13％，单质硫转化率可达到77.9％；

(3)本发明涉及的鞘氨醇杆菌能够耐受较高浓度的硫化物，自养条件下耐受的硫(S^2-)浓度高达1098.75mg/L；

(4)符合生物安全法规，该微生物菌株从被高硫化物长期胁迫的选择环境中筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害。

附图说明

图1本发明的鞘氨醇杆菌DS-4在扫描电子显微镜(SEM)下的细胞形态。

图2本发明的鞘氨醇杆菌DS-4在初始pH为7.0，温度为30℃条件下的生长曲线，其中：(a)鞘氨醇杆菌DS-4在自养条件下的生长曲线,(b)鞘氨醇杆菌DS-4在异养条件下的生长曲线。

图3本发明的鞘氨醇杆菌DS-4在脱硫效果实验过程中各因素的变化情况，其中：(a)硫化物去除效果变化,(b)单质硫浓度变化。

图4本发明的鞘氨醇杆菌DS-4脱硫形成的生物硫颗粒在扫描电镜(SEM)下的形态。

具体实施方式

以下结合实施例详细说明本发明。实施方案方便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例中涉及到的培养基配方为：

(1)硫化钠培养基，配方为：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液调节pH至中性。

(2)硫代硫酸钠培养基，配方为：Na₂S₂O₃.5H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml，用1mol/L的NaOH或HCl溶液调节pH至中性。

(3)有机碳源异养培养基，配方为：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH 7.0～7.2。

实施例1：菌株筛选

取成都市第二污水处理厂好氧曝气池污泥适量，按20％的接种量加入含5L硫代硫酸钠培养基的反应器中，在pH＝7.0，曝气0.5L/min，30℃的条件下富集培养7天，重复3～4次，采用硫化钠培养基进行平板分离，3～4天后菌落生成，挑取单菌落接入硫化钠培养基培养，重复4次以上获得纯菌。

实施例2：菌株鉴定

将菌株按照相同的接种量接种于硫代硫酸钠培养基中，置于不同温度的摇床中(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养30h，确定该菌株最适生长温度为30℃；采取初始pH别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0在最适生长温度下培养30h，确定最适生长pH为7.0。

将分离纯化的菌株在扫描电子显微镜(SEM)下观察，结果如图1所示；该菌为短杆状、长1.2～2μm、宽0.8～0.1.2μm，无鞭毛；革兰氏鉴定该菌为阴性。

采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过16SrDNA通用引物27F和1492R进行PCR，然后测序分析，测序结果经BLAST比对，鉴定该菌株为鞘氨醇杆菌，命名为DS-4，即为本发明的保藏菌株鞘氨醇杆菌CGMCC No.12632(Sphingobacterium sp.DS-4)。

对鞘氨醇杆菌DS-4进行生长曲线研究，分别选用硫代硫酸钠培养基进行自养培养和有机碳源异养培养基进行异养培养，结果如附图2(a)、(b)所示：(a)鞘氨醇杆菌DS-4可以在硫代硫酸钠培养基中生长，培养30h后菌液OD值达到0.21；(b)鞘氨醇杆菌DS-4在能够在有机碳源异养培养基中快速生长，培养30h后，菌液OD值达到0.99，远高于在无机环境中培养的结果。这说明该菌的营养类型为兼性营养型；在工程应用中用有机碳源异养培养基可快速获得高密度菌体。

实施例3：脱硫瓶试

将200ml硫化钠培养基溶液(600mg/LS^2-)在紫外下灭菌30分钟，无菌条件下装入已灭菌的500ml三角瓶中，然后加入50ml培养30h的鞘氨醇杆菌菌液，用好氧塞塞住瓶口，置于摇床中振荡(30℃、200r/min)，测定初始硫化物浓度为460mg/L S^2-；对照组加入等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔30分钟取样测定硫化物浓度、单质硫浓度，结果取平均值。在5小时后，其测定计算结果如附图3所示。实验组硫化钠溶液中添加该脱硫菌后，其硫化物浓度比对照明显降低，单质硫转化率明显要高，其中硫化物去除率(a)达到99.13％，单质硫累积浓度(b)最高达358.49mg/L，相应的单质硫转化率为77.9％。对照组中硫化物的去除是由于摇瓶振荡促进了硫化物的逸出，但从单质硫转化率可以看出，硫化物的去除只是单纯的物理性移除，并不是生物转化去除。

实施例4：脱硫罐试

将5L硫化钠培养基溶液(设计初始浓度为1200mg/L S^2-，实测浓度为1098.75mg/L)装入已灭菌的8L的反应器中(反应器中添加有软性填料，用以微生物挂膜)，然后加入500ml培养30h的鞘氨醇杆菌菌液，用空气泵曝气，曝气速率为0.4L/min，保持环境温度为28℃～30℃，在此条件下挂膜驯化7天，使微生物能够在填料上附着，然后进行去除硫化物的验证试验；在实现菌体在反应器中挂膜成功后，往反应器中添加1000ml通过紫外灭菌硫化钠培养基溶液；对照组加入等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔30分钟取样测定硫化物浓度、单质硫浓度，取其平均值。在3.5h后，其测定计算结果如下表1所示。

表1鞘氨醇杆菌罐试脱硫效果

由上表可知，在实验组实现挂膜后的反应器中，加入硫化钠溶液3.5小时后，硫化物浓度比对照组去除率明显要高，单质硫转化率明显要高，其中硫化物去除率可达到98.03％，单质硫转化率可达到66.8％。与实例3相比，成功挂膜的反应器中，该菌株对硫化物的去除速率更快，效率更高，可实施用于脱硫应用。对照组中硫化物的去除是由于空气吹脱导致硫化物的逸出，但从单质硫转化率可以看出，硫化物的去除只是单纯的物理性移除，并不是生物转化去除。

实施例5：生物硫颗粒观察

对鞘氨醇杆菌DS-4处理后废水中的单质硫聚合形成的生物硫颗粒进行了扫描电子显微镜观察，结果如附图4所示：废水中的生物硫颗粒形态大小不一，颗粒表面有凸起。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一株脱硫鞘氨醇杆菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>878

<212>DNA

<213>鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）

<400>1

gaaggatggc gtctgtctac aatgcagtcg agcgcaccct tcggggtgct cggtgtccgg 60

gtgaatagtg cgtgacggta ggccctttgg tgcgcaatct acccgtatca cggggatagc 120

cccagtatgc gcccttcggg gcaaagattt atctcccccg gcatccccgc gttggattaa 180

gttattggag gggtatgggc tcacgtgacc taagatcctt ggtggtttga gaggatgatc 240

agcgaacatg tcactgagat ctgaccagac tcctaccaca cgggtactgg gacaatctta 300

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catgctcttt gcacgatgac tgccctatgg gttgtaaact gcttttgtta ggctaactcc 420

ccgtctacat gtacgtggct gaatgtaccg ctagcgttgt gctcaattac tggccggcca 480

gcgcacgtag taataccgaa gatccgagcg ttatccggat ttattgggtt taagaggtgc 540

ctacgcggta ctttaagtcg agggtgagag actgcgtgtt attgtcgtgt gcctttgata 600

ctgaagtgct tgaatgcaat acaagacggc ggagtgagac actgactcga tacatgcata 660

gaagtgtctc agaatgccga ttgcgaaagg atctgtctac tgcgttactg acccctgatg 720

caaaaaatgc tggtcatcga acagcatgat gtacccttga cagaccctac ccctataaag 780

atgacaactc cgatgattgc accctacccg atcacatccc aaacgaaatc gataagtttc 840

tccatcttgg cgagggcgct tcgtgcgttt tgtattta 878