本发明涉及一种子宫内膜干细胞的分离提取方法，特别是涉及一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法。
背景技术：
：近年来，细胞疗法的兴起激发了对各种干细胞的研究热潮，而存在于骨髓、脐带、脐带血、脂肪、经血等多种成体组织中的成体干细胞(AdultStemCells，ASCs)，不仅克服了胚胎干细胞取材难、分化不确定及伦理问题等限制，同时能保持高效增殖能力和多向分化潜能，为细胞治疗提供了良好的种子细胞。子宫作为人体中具有超强再生能力的器官，其子宫内膜在每个月经周期中会增长约5～7mm，而以这种增长速率，子宫内膜会在妇女育龄期经过500次左右有规律的脱落和再生过程，这不仅表明经血源性子宫内膜干细胞(Menstrualblood-derivedEndometriumStemCells，MenESCs)的来源丰富，同时也暗示MenESCs具有较强的增殖活性。作为ASCs家族的重要成员，MenESCs除表达CD29(>99％)、CD44(>99％)、CD73(>99％)、CD90(>95％)及CD105(>99％)等ASCs表面标志物外，同时表达多向分化潜能标志物Oct-4、SSEA-4、Sox-2及Nanog，暗示MenESCs具有较高分化潜能。此外，相较于骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脐带血来源的ASCs等，MenESCs不仅具有更佳的增殖活性，同时亦具有较强的遗传稳定性(传至68代时核型无畸变)。同时，研究表明，MenESCs不表达MHCΙΙ类受体，微量表达MHCΙ类受体，暗示MenESCs具有较低的免疫原性。因此，MenESCs一经报道，凭借其来源丰富、无创伤的分离方式以及较高的增殖活性和分化潜能等方面的优势，获得了国内外的广泛关注。在临床应用MenESCs的安全性获得保障的前提下，其已在成骨、心肌、肝脏、子宫内膜及中风等疾病的治疗过程中展示了令人满意的效果。目前，从经血样本中分离提取MenESCs的方法主要是依赖Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心后收集白膜层中的有核细胞，进一步洗涤后进行后续培养。虽然利用该方法可成功分离提取MenESCs，但仍然存在以下不足：首先，分离MenESCs时所用的Ficoll淋巴细胞分离液主要有葡聚糖和泛影酸钠组成，其密度为1.077±0.0001g/mL，可分离比人淋巴细胞密度小的单个核细胞。在使用过程中，如果所需分离的标本量较少，使用细胞分离液能形成较好的单核细胞层，也方便收集；但如果需要分离的标本量较多，不但分离液使用量大，且离心后部分红细胞仍然悬浮在分离液中，致使收集细胞中混杂较多红细胞，而红细胞层内也混杂有核细胞，致使细胞收率较低。对于捐献者在一个月经周期中可收集到的经血样本超过50mL，等比例稀释到保存液中后超过100mL，完全通过密度梯度离心不仅会消耗掉大量淋巴细胞分离液，增加操作的经济和时间成本，同时由于样本量较多，势必会降低MenESCs的收率，而较长时间的离心对细胞活性的损伤较多。其次，经血样本相比外周血样本较为复杂，存在较多粘液物质及大量血凝块，在密度梯度离心后不仅可见明显的白膜层，同时可见大量悬浮的脱落子宫内膜碎片。实验发现，悬浮的脱落子宫内膜碎片中含有大量的MenESCs，而许多脱落的子宫内膜碎片由于与血液形成血凝块，因此通过密度梯度分离后会与血细胞沉淀在离心管最底层，从而降低了MenESCs的收率。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于，提供一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，其能够快速、有效地分离提取经血源性子宫内膜干细胞，而且操作简单，细胞收率高，细胞活性的损伤少。一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，包括以下步骤：1)取经血样本，加入样本保存液混匀，然后进行离心，收集沉淀物；2)将步骤1)得到的沉淀物加入红细胞裂解液中，混匀后静置进行裂解，然后进行离心，收集沉淀物；3)将步骤2)得到的沉淀物用细胞培养基重悬，然后进行细胞培养，收集培养获得的细胞，即为所述的经血源性子宫内膜干细胞(MenESCs)。优选地，所述的样本保存液为含有50～150U/mL青霉素、0.8～1.2mg/mL链霉素、0.05～0.1mg/mL两性霉素B和0.2～0.5mg/mLEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)的PBS缓冲液。更优选地，所述的样本保存液为含有100U/mL青霉素、1mg/mL链霉素、0.1mg/mL两性霉素B和0.3mg/mLEDTA-Na2的PBS缓冲液。优选地，所述的红细胞裂解液为含有120～180mmol/LNH4Cl、5～15mmol/LKHCO3和0.05～0.15mmol/LEDTA-Na2的水溶液。更优选地，所述的红细胞裂解液为含有150mmol/LNH4Cl、10mmol/LKHCO3和0.1mmol/LEDTA-Na2的水溶液。优选地，所述的红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4，优选为7.2。优选地，所述的细胞培养基为含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。优选地，在步骤1)中，经血样本与样本保存液的用量体积比为1:1～1:3；离心的转速为1200～1500rpm，离心的时间为5～10分钟。优选地，在步骤2)中，红细胞裂解液与经血样本的用量体积比为1:2～1:3；裂解的时间为5～10分钟；离心的转速为1200～1500rpm，离心的时间为5～10分钟。优选地，在步骤3)中，所述细胞培养的接种密度为5～10×104cells/cm2；所述的细胞培养是在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养。优选地，在步骤3)中，所述的细胞培养是将步骤2)得到的沉淀物用细胞培养基重悬后，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2天，用PBS缓冲液洗掉未贴壁的细胞，再加入细胞培养基继续培养，此后每隔3天更换一次细胞培养基，直至细胞融合至80％后进行传代。本发明所述的经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，通过采用所述的红细胞裂解液对经血样本进行裂解，可最大限度地保留子宫内膜，能够显著提高目标细胞的收率；同时，该分离提取过程的离心转速低(仅需1200～1500rpm)、时间短(仅需5～10分钟)，能够显著降低对细胞活性的损伤。本发明的分离提取方法无需淋巴细胞分离液，无需采用密度差异来分离提取有核细胞，避免了使用淋巴细胞分离液所必需的1800rpm下离心20分钟的高速离心过程，因而能够有效减少高速离心对细胞造成的机械损伤。本发明的分离提取方法操作简单，能够快速、有效地分离提取得到所述的经血源性子宫内膜干细胞，降低经济和时间成本。本发明的分离提取方法所采用的样本保存液，通过加入EDTA-Na2，能够有效发挥抗凝血的作用，并且通过青霉素、链霉素和两性霉素B的联合使用，能够有效发挥抗细菌、抗真菌作用，且不会影响MenESCs的细胞活性。EDTA-Na2可与经血样本中的钙离子结合成螯合物，使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固，避免经血样本凝固对MenESCs分离造成影响；青霉素、链霉素具有良好的杀菌、抑菌作用，而两性霉素B对样本收集部位(阴道)所存在真菌具有较强的杀菌、抑菌作用，三者联合使用具有更强、更广谱的抗菌作用。本发明的分离提取方法所采用的红细胞裂解液，通过NH4Cl、KHCO3和EDTA-Na2的合理搭配，能够形成良好的低渗环境，使无核的红细胞吸水膨胀裂解，但对有核细胞的影响较小，且裂解作用柔和，可最大限度保护有核细胞的活性。该红细胞裂解液与经血样本的用量体积比优选为1:2～1:3，裂解时间优选为5～10分钟，既能保证无核细胞的有效裂解，又能最大限度保护有核细胞的活性。本发明的红细胞裂解液中，NH4+离子无法透过细胞膜，Cl-离子和HCO3-离子则可跨膜进入细胞内，提高细胞内离子浓度，在溶液中形成低渗环境，同时EDTA通过螯合Mg2+和Ca2+可降低细胞膜稳定性，由于红细胞缺乏细胞核，其细胞骨架结构相对于有核细胞较为脆弱，对膨胀耐受力差，在上述低渗环境中通过低渗作用吸水破裂，发生溶血，而低渗环境对MenESCs等有核细胞的影响较小。本发明的红细胞裂解液，通过NH4Cl、KHCO3和EDTA-Na2浓度的严格控制，能够保证红细胞彻底裂解，同时保证不会损害甚至裂解MenESCs等有核细胞。本发明的分离提取方法中，优选采用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基作为细胞培养基，DMEM培养基更适合MenESCs细胞的生长，高糖成分能够给MenESCs细胞的体外增殖提供充足的能量来源，而胎牛血清能够为MenESCs细胞的生长提供丰富的营养因子，从而确保MenESCs细胞的规模化培养。附图说明图1为MenESCs细胞成脂、成骨、成软骨诱导分化检测图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例一：采集经血样本样本保存液的配制：取PBS缓冲液，分别加入终浓度为100U/mL的青霉素、终浓度为1mg/mL的链霉素、终浓度为0.1mg/mL的两性霉素B及终浓度为0.3mg/mL的EDTA-Na2，充分混合均匀。招募处于月经周期前3天的健康女性志愿者10名，分别收集其经血样本各5～15mL，然后将各经血样本分别转移至预先装有15mL样品保存液的50mL离心管中，拧紧管盖后上下颠倒充分混匀，得到经血样品保存液10份。将各经血样品保存液置于4℃下保存，在48小时内完成MenESCs的分离提取。实施例二：采用本发明的方法(红细胞裂解法)分离提取MenESCs红细胞裂解液的配制：在纯化水中，分别加入终浓度为150mmol/L的NH4Cl、终浓度为10mmol/L的KHCO3及终浓度为0.1mmol/L的EDTA-Na2，充分混合均匀后，调节pH值至7.2。取实施例一制得的经血样品保存液10mL，转移至15mL无菌离心管中，以1500rpm的转速离心5分钟，弃上清液，收集沉淀物。取15mL无菌离心管，加入10mL红细胞裂解液，将沉淀物加入红细胞裂解液中，充分吹打混匀后，在室温下静置裂解5分钟，然后以1200rpm的转速离心5分钟，弃上清液，收集有核细胞及子宫内膜沉淀物。将有核细胞及子宫内膜沉淀物用PBS缓冲液洗涤2次后，加入5mL含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬，调整细胞密度，以5～10×104cells/cm2接种细胞培养瓶，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2天，然后用PBS缓冲液洗掉未贴壁的细胞，再加入培养基继续培养，此后每隔3天更换一次培养基，直至细胞融合至80％左右，然后用0.25％的胰酶消化，传代。收集培养获得的细胞，即为所述的经血源性子宫内膜干细胞(MenESCs)。实施例三：采用传统方法(密度梯度离心法)分离提取MenESCs取实施例一制得的经血样品保存液10mL，缓慢加入到10mLFicoll淋巴细胞分离液中，以1800rpm的转速水平离心25分钟，得到4层分离液，小心除去最上层的分离液，将中间的白膜层物质及悬浮的子宫内膜碎片转移至15mL无菌离心管中，用PBS缓冲液洗涤2次后，加入5mL含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬，调整细胞密度，以5～10×104cells/cm2接种细胞培养瓶，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2天，然后用PBS缓冲液洗掉未贴壁的细胞，再加入培养基继续培养，此后每隔3天更换一次培养基，直至细胞融合至80％左右，用0.25％的胰酶消化，传代。收集培养获得的细胞，即为所述的经血源性子宫内膜干细胞(MenESCs)。实施例四：MenESCs细胞收率测定取实施例一制得的经血样品保存液20mL，平均分为2份，每份10mL，分别采用本发明的红细胞裂解法(实施例二)以及传统的密度梯度离心法(实施例三)分离获得原代经血源性子宫内膜干细胞(MenESCs)，然后分别加入6mL含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬，并接种于6孔细胞培养板中，上述两种方法所获得的细胞各接种3孔。将细胞培养板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2天，然后用PBS缓冲液洗掉未贴壁的细胞，再加入培养基继续培养，继续培养3天后用4％多聚甲醛固定。经常规结晶紫染色后，分别计算通过上述两种方法所获得的原代MenESCs细胞克隆数，测定结果如下表1所示。表1MenESC细胞收率测定结果样本细胞克隆数红细胞裂解法63±11个/孔密度梯度离心法38±9个/孔测定结果表明，采用本发明的红细胞裂解法所获得的原代MenESCs细胞克隆数显著高于采用传统密度梯度离心法所获得的原代MenESCs细胞克隆数，证明本发明的红细胞裂解法能够显著增加MenESCs细胞收率，有效提高经血样本的利用率。实施例五：MenESCs表面标志物检测分别取实施例二、实施例三所获得的P3代MenESCs细胞悬液，调整细胞密度至1×106cells/ml。取实施例二、实施例三的细胞悬液各100μL，分别加入单克隆流式抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、HLA-ABC-FITC及HLA-DR-FITC，混匀后于4℃避光孵育30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤2次，再加入培养基重悬。然后分别用流式细胞仪检测实施例二、实施例三的细胞表面标志物表达情况，检测结果如下表2所示。表2MenESCs表面标志物检测结果测定结果表明，采用本发明的红细胞裂解法和传统的密度梯度离心法所获得的MenESCs细胞表面标志物的表达，均符合国内外对成体干细胞表面标志物表达的要求，表明上述两种方法均可成功分离获得MenESCs，且二者之间在表面标志物表达阳性率上没有显著性差异。实施例六：MenESCs细胞成脂、成骨及成软骨诱导分化检测分别取实施例二、实施例三所获得的P3代MenESCs细胞悬液，以1×104cells/cm2的密度分别接种于12孔培养板中进行培养，待细胞融合达50％，分别进行成脂、成骨、成软骨诱导及鉴定。成脂诱导培养：采用DMEM高糖培养基，加入5％胎牛血清、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μmol/L胰岛素；每隔3天更换一次培养基，诱导培养21天。成骨诱导培养：采用DMEM高糖培养基，加入5％胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L左旋抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠；每隔3天更换一次培养基，诱导培养21天。成软骨诱导培养：采用DMEM高糖培养基，加入5％胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松、0.2mmol/L左旋抗坏血酸、1％胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠、10ng/mL转化生长因子-β3；每隔3天更换一次培养基，诱导培养21天。诱导培养结束后，分别用PBS缓冲液洗涤2次，然后用4％多聚甲醛固定30分钟，再用PBS缓冲液洗涤3次。成脂、成骨、成软骨诱导培养的细胞分别用油红O、茜素红、阿尔新蓝染色，然后置于倒置显微镜下观察，结果如图1所示。图1的检测结果表明，采用本发明的红细胞裂解法和传统的密度梯度离心法所获得的MenESCs细胞，均具有多向分化潜能，可在特定诱导培养基的诱导下向成脂、成骨和成软骨方向分化，符合国内外对成体干细胞多向分化潜能的要求，表明上述两种方法均可成功分离获得MenESCs细胞。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页1 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