一种肿瘤循环DNA甲基化检测引物的制作方法

技术特征：

1.一种PCR检测引物，其特征在于，所述引物序列为

2.一种PCR检测探针，其特征在于，所述探针序列为

3.一种PCR检测阻断片段mS9-B，其特征在于，阻断片段mS9-B序列为

4.一种肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，其包括实施方案1的引物和/或权利要求2的探针和/或权利要求3的阻断片段，优选所述的阻断片段存在3`端修饰，更优选所述3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。

5.如权利要求4所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括内参基因的引物、探针，优选所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)，更优选内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：

名称序列ACTB-FgaggaggtttagtaagttACTB-RccaataaaacctactcctACTB-Pacccaacacacaataaca

进一步优选地，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。

6.一种肿瘤循环DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括(1)对待测肿瘤循环(ct-DNA)标本进行亚硫酸氢盐修饰处理；(2)将处理后的待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、靶基因引物、靶基因探针、内参基因、内参基因引物和探针进行荧光定量PCR反应；(3)测量所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、阳性质控品和阴性质控品的Ct值或者CP值。

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1的引物进行PCR扩展反应，和/或使用权利要求2的探针和/或权利要求3的阻断片段，优选所述的阻断片段存在3`端修饰，更优选所述3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。

8.如权利要求6-7所述方法，其特征在于，所述方法还包括内参基因的引物、探针，优选所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)，更优选内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：

名称序列ACTB-FgaggaggtttagtaagttACTB-RccaataaaacctactcctACTB-Pacccaacacacaataaca

进一步优选地，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。

9.如权利要求6-8所述方法，其特征在于，所述方法还包括PCR结果的判读步骤：优选地，单个PCR反应按照下表进行判读：

PCR结果mSEPT9Ct值ACTB Ct值+Ct值≤45Ct值≤32.5-无扩增信号Ct值≤32.5无效任何结果Ct值≥32.5

更优选地，所述方法还包括判读标本中是否存在甲基化DNA的步骤，优选地，所述步骤为根据待测标本三次PCR结果按照下表进行判定：

10.权利要求1的引物或权利要求2的探针或权利要求3的阻断片段在制备用于检测和/或分类个体中癌症的试剂盒中的用途。