1.一种HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒,其特征在于,包括:
MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针、阳性对照U6snRNA的核酸探针、原位杂交缓冲液和蛋白酶K粉末。
2.根据权利要求3所述的HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒,其特征在于,所述MiR-126-3p的核酸探针序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求3所述的HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒,其特征在于,
所述阴性对照Scramble的核酸探针序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求3所述的HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒,其特征在于,
所述阳性对照U6snRNA的核酸探针序列如SEQ ID NO:3所示。
5.HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用,其特征在于,所述HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p的核酸探针序列如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求5所述的HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用,其特征在于,采用FISH检测方法检测乳腺癌组织中的miR-126-3p含量。
7.根据权利要求5所述的HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用,其特征在于,包括步骤:
(1)制备MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针和阳性对照U6snRNA的核酸探针;
(2)杂交步骤
①将组织芯片放入烘箱中,温度调至60-65度,烘蜡1小时;
②探针的预处理:
准备1×miRNA-ISH缓冲液:10ml 2×miRNA-ISH缓冲液和10ml DEPC H2O,将40ul的核酸探针放在无RNA酶的PCR管中,90℃变性4min,放在冰上,快速离心后加入20ml的1×miRNA-ISH缓冲,按1-2ml的体积分装,待使用时直接冻融使用;
③缓冲液配制:
10×PBS:取40g NaCl,1g KCl,7.2g Na2PO4,1.2g KH2PO4,用HCl调节pH 7.4,用DEPC水定容至500ml;
1×PBT:取50ml 10×PBS和0.5ml Tween,用DEPC水定容至500ml;
1M Tris-HCl,PH7.4:30.475g Tris碱,加150mlDEPC水,用浓盐酸调节PH至7.4,用DEPC水定容至250ml;
蛋白酶K存储液的配制:用10mM Tris-HCl PH.7.5稀释蛋白酶K至20mg/ml;
顺丁烯二酸缓冲液:0.1M顺丁烯二酸,0.15MNaCl,用NaOH调节PH至7.5;
NBT/BCIP稀释液:100ml 1M/L Tris-HCl,20ml 5M/L NaCl,880ml DEPC ddH2O,pH9.5;
④样本脱蜡:
二甲苯3次每次5min,
乙醇100%上下浸洗10次,
乙醇100%上下浸洗10次
乙醇100%5min,
乙醇96%上下浸洗10次,
乙醇96%5min,
乙醇70%上下浸洗10次,
乙醇70%5min,
PBS 2-5min;
⑤蛋白酶消化样本:
蛋白酶K 15ug/mL 37℃处理10-30min,PBS 2次,简单震摇;
⑥酒精脱水:
乙醇70%上下浸洗10次
乙醇70%1min,
乙醇96%上下浸洗10次,
乙醇96%1min,
乙醇100%上下浸洗10次,
乙醇100%1min,放在干净的纸上空气干燥15min;
⑦杂交:
每张玻片上加50-100ul的杂交液;玻片上盖上22mm×22mm盖玻片,用胶水封片,在杂交温度50℃1h;
⑧严格的洗片:
用镊子小心的把封片胶撕掉,把玻片放入下面溶液梯度洗片:
5×SSC 5min杂交温度50℃,
1×SSC 5min杂交温度50℃,
0.2×SSC 5min杂交温度50℃,
0.2×SSC 5min室温,
室温,PBS 1次×5min;
⑨免疫检测:
将玻片甩干,在室温湿盒上滴加封闭液,封闭15min;用纸吸干封闭液后,放在湿盒1:800anti-DIG-AP Fab fragments,4℃过夜;室温,PBST 3次×3min;
⑩颜色反应和复染封片:
避光反应NBT/BCIP 30℃显色2h(400ul/玻片),室温,PBST 3次×5min;在水中洗片,2次1min;加200ul核固红染液,10秒-1分钟;将片子在自来水中冲洗10分钟,酒精脱水;用中性树脂封片;
(3)原位杂交检测结果判断:
通过双盲法独立评估,分别评价其阳性细胞数和染色程度,阳性细胞数评分:未见阳性细胞为0,阳性细胞<5%为1,6%~25%为2,25%~50%为3,51%~75%为4,>75%为5;染色程度评分:未见染色为0,出现浅灰色颗粒为1,出现深灰色为2,出现黑色颗粒为3,总评分结果=染色阳性细胞数评分×染色程度评分。