用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法及其应用。

背景技术：

间充质干细胞(MSCs)由于其多能性以及免疫调节的能力在再生医学中越来越受到重视，但它们在体外长期培养扩增并保持其性能以用于临床治疗仍是一个挑战，因此建立确定的安全培养系统来扩增细胞以用于临床治疗至关重要。尽管标准的TCP培养板足以支持MSCs从最初的异质组织分离物中分离和附着，但它不能够确保这些干细胞在体外长期培养生长后的多能特性。事实上，已经有研究表明MSCs在TCP上长期培养可能会降低其向成骨和成脂细胞分化的能力。另外，使用动物衍生基质如明胶、胶原蛋白或纤连蛋白作为培养基质也有不足，可能存在很多不确定因素，如存在批次差异，有引起病原体转移感染的风险。因此，为了保持MSCs完整的临床应用潜力，开发一种组成确定的合成基材对于MSCs的体外长期培养是迫切需要的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：基于上述问题，本发明提供一种用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是：一种用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法，包括以下步骤：

a、盖玻片的处理：

用等离子表面清洗机对盖玻片正反两面进行处理，然后将处理后的盖玻片浸泡于的改性溶液中，放置一段时间，取出，溶剂淋洗，自然风干，备用；

b、聚合物涂层的制备：

将单体、交联剂、紫外光引发剂和溶剂按比例混合均匀，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再将步骤a得到的盖玻片盖在液滴上，轻轻挤压排出空气，紫外聚合，得到聚合物涂层；

步骤b中单体为：甲基丙烯酸羟乙酯A、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液E、甲基丙烯酸环己酯L、甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯K，聚合物涂层为：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，数字为各单体之间的质量比。

进一步地，步骤a中等离子表面清洗机功率500w，时间120s；盖玻片的规格为φ30mm；改性溶液包括乙腈、三乙胺和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，乙腈、三乙胺和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的体积比为60～61：0.4～0.42：0.85～0.87。

进一步地，步骤a中处理后的盖玻片浸泡于的改性溶液中，在恒温振荡器震荡24h后，取出盖玻片，用丙酮清洗2～3次，自然风干，保存在-25℃冰箱中待用。

进一步地，步骤b中交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，紫外光引发剂为1-羟环己基苯酮，溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮，单体固含量为50％，交联剂和紫外光引发剂分别占单体总质量的10％和5％，步骤b中聚合物溶液为10μL。

进一步地，步骤b中聚合物涂层具体制备方法为：用365nm紫外光照射30min后，将PET薄膜剥离，得到复合有聚合物涂层的载玻片，将载玻片放置在40℃烘箱中12h，用丙酮和乙醇各冲洗两次，自然风干。

用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的应用，包括：

c、人类脂肪干细胞在聚合物涂层上的长期培养：

收集人类脂肪干细胞消化并计数，接种到聚合物涂层表面进行长期体外培养；

d、诱导人类脂肪干细胞向成脂、成骨、成软骨细胞的分化：

待c中的人类脂肪干细胞生长至80％融合时，分别更换成脂、成骨、成软骨诱导培养液，以加入L-DMEM培养基组作为阴性对照组于培养箱中培养。

e、对诱导后的三种成体细胞分别进行染色定性：

成脂、成骨、成软骨细胞诱导一段时间后分别进行油红O染色、茜素红染色、阿利新蓝染色，然后进行拍照观察。

进一步地，c中聚合物涂层表面进行长期体外培养的具体操作为：收集第2代人类脂肪干细胞，将细胞浓度调整为1×10⁵/mL，接种于载玻片的聚合物涂层上，载玻片置于6孔板中，每孔加2.5mL细胞悬液，用一个没有聚合物涂层的TC板作为对照组；每3天换一次培养液，待对照组的细胞长到90％融合时，将所有实验组及对照组的细胞分别脱壁计数，仍按1×10⁵/mL的浓度分别接种于对应的聚合物涂层表面进行传代长期培养。

进一步地，d中三种诱导培养液为：成脂诱导培养液：含10％FBS的H-DMEM、0.5mmol/L的3-异丁基甲基黄嘌呤、10μmol/L胰岛素、1μmol/L地塞米松和200μmol/L吲哚美辛；成骨诱导培养液：含10％FBS的H-DMEM、10mmol/L的β-甘油磷酸钠、10^-7mol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸；成软骨诱导培养液：含10％FBS的H-DMEM、10^-7mol/L地塞米松、37.5μg/mL抗坏血酸、40μg/mL脯氨酸、100μg/mL丙酮酸钠、50mg/mL ITS、100ng/mL TGF-β3。

进一步地，d中人类脂肪干细胞于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，每3d换液1次。

进一步地，e中三种诱导后的成体细胞染色具体操作为：成脂诱导3周后进行油红O染色：细胞进行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min后用PBS冲洗两次，用0.1μg/mL DAPI染色20min后用PBS冲洗两次，再用60％的异丙醇溶液浸洗5min，然后再加入油红O染色液室温染色30min，最后用60％异丙醇水溶液清洗2-3次后用显微镜进行拍照观察；成骨诱导4周后进行茜素红染色：吸弃培养液，先用PBS清洗一次，再10％的甲醛溶液固定30min，后用PBS冲洗两次，然后用2％的茜素红水溶液染色20min，最后用PBS缓冲液清洗2-3次后进行拍照观察；成软骨诱导4周后进行阿利新蓝染色：细胞进行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min，再用PBS冲洗两次，加Alcian酸化液浸泡3min，然后加Alcian染色液染色15-30min，最后用去离子水冲洗2-3次后进行拍照观察。

本发明的有益效果是：基于丙烯酸酯类/丙烯酰胺类的聚合物涂层具有良好的光学透明度以及生物相容性，有利于细胞培养与观察，聚合物涂层不仅可以促进人类脂肪干细胞的生长保持其增殖能力，而且还能保持其干细胞特性，这些新的聚合物为人类脂肪干细胞用于研究、工业化扩增和临床应用的长期培养提供了一种高效、安全的、化学组成可控的合成基材。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为实施例2的聚合物涂层E3K1L2的红外谱图；

图2为3个实施例的聚合物涂层的热失重曲线；

图3为3个实施例的聚合物涂层培养的人类脂肪干细胞分化成成脂细胞的分化率对比图。

具体实施方式

现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

称取0.1g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液(E)、0.1g甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(K)、0.1g甲基丙烯酸环己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羟环己基苯酮和0.03g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再将盖玻片盖在液滴上，轻轻挤压排出空气。用365nm紫外光照射30min后，剥离PET薄膜，将载玻片放置在40℃烘箱中12h，最后用丙酮和乙醇各冲洗两次，自然风干，得到聚合物涂层E1K1L1。

将人类脂肪干细胞按密度为1×10⁵/mL接种于聚合物涂层上进行长期培养。收集第2代人类脂肪干细胞，将细胞浓度调整为1×10⁵/mL，接种于聚合物涂层上，聚合物涂层置于6孔板中(0.5％的琼脂糖溶液处理过)，每孔加2.5mL细胞悬液，用一个没有聚合物涂层的TC板作为对照组。每3天换一次培养液，待对照组的细胞长到90％融合时，将所有实验组及对照组的细胞分别脱壁计数，仍按1×10⁵/mL的浓度分别接种于对应的聚合物涂层表面进行传代长期培养。

待细胞生长至80％融合时，分别更换成脂、成骨、成软骨诱导培养液，并分别用油红O、茜素红、阿利新蓝染色定性。

三种诱导培养液为：成脂诱导培养液：含10％FBS的H-DMEM、0.5mmol/L的3-异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、10μmol/L胰岛素、1μmol/L地塞米松和200μmol/L吲哚美辛。成骨诱导培养液：含10％FBS的H-DMEM、10mmol/L的β-甘油磷酸钠、10^-7mol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸。成软骨诱导培养液：含10％FBS的H-DMEM、10^-7mol/L地塞米松、37.5μg/mL抗坏血酸、40μg/mL脯氨酸、100μg/mL丙酮酸钠、50mg/mL ITS、100ng/mL TGF-β3。

成脂诱导3周后进行油红O染色：细胞进行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min后用PBS冲洗两次，用DAPI(0.1μg/mL)染色20min后用PBS冲洗两次，再用60％的异丙醇溶液浸洗5min，然后再加入油红O染色液(0.5％油红O异丙醇溶液/水＝3/2)室温染色30min，最后用60％异丙醇水溶液清洗2-3次后用显微镜进行拍照观察。成骨诱导4周后进行茜素红染色：吸弃培养液，先用PBS清洗一次，再10％的甲醛溶液固定30min，后用PBS冲洗两次，然后用2％的茜素红水溶液(PH4.2)染色20min，最后用PBS缓冲液清洗2-3次后进行拍照观察。成软骨诱导4周后进行阿利新蓝染色：细胞进行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min，再用PBS冲洗两次，加Alcian酸化液浸泡3min，然后加Alcian染色液染色15-30min，最后用去离子水冲洗2-3次后进行拍照观察。

实施例2

称取0.15g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液(E)、0.05g甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(K)、0.1g甲基丙烯酸环己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羟环己基苯酮和0.03g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再将盖玻片盖在液滴上，轻轻挤压排出空气。用365nm紫外光照射30min后，剥离PET薄膜，将载玻片放置在40℃烘箱中12h，最后用丙酮和乙醇各冲洗两次，自然风干，得到聚合物涂层E3K1L2。

按实施例1步骤培养人类脂肪干细胞并诱导、染色定性。

实施例3

称取0.15g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液(E)、0.05g甲基丙烯酸羟乙酯(A)、0.1g甲基丙烯酸环己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羟环己基苯酮和0.03g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再将盖玻片盖在液滴上，轻轻挤压排出空气。用365nm紫外光照射30min后，剥离PET薄膜，将载玻片放置在40℃烘箱中12h，最后用丙酮和乙醇各冲洗两次，自然风干，得到聚合物涂层E3A1L2。

按实施例1步骤培养人类脂肪干细胞并诱导、染色定性。

图1为实施例2的聚合物图层E3K1L2的红外谱图，光聚合反应前混合单体C＝C双键在1630cm^-1及650～730cm^-1处的强吸收峰没有在聚合物红外谱图中出现，说明三种单体发生了共聚反应。其他实施例的聚合物与此类似。

图2为3种聚合物的热失重曲线，从图中可以看出，3种聚合物的热失重过程相近，聚合物的初始热分解温度均在200℃左右，热稳定性比较好，作为生物材料可以用于高温灭菌处理。

图3为3种聚合物涂层培养的人类脂肪干细胞分化成成脂细胞的分化率。

实施例1～3中不同聚合物涂层培养的人类脂肪干细胞其诱导分化率有差异，由图3可知，聚合物涂层配比E1K1L1、E3A1L2和E3K1L2培养的人类脂肪干细胞诱导分化为成脂细胞的分化率明显高于对照组(TCP)，尤其是E3K1L2分化率为65％左右，高于在TCP表面培养的细胞的分化率55％。具有作为一种新型的医用生物材料的应用前景。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。