一种封闭IL6R的用于缓解CRS的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用与流程

技术特征：

1.一种封闭IL6R的用于缓解CRS的CAR-T转基因载体，其特征在于，包括：

用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.1所示；

用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；

用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；

用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQ ID NO.11所示；

用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQ ID NO.12所示；

用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；

人IL6R的人源化单链抗体，所述人IL6R的人源化单链抗体为如SEQ ID NO.21所示的IL6RscFv1，或者如SEQ ID NO.22所示的IL6RscFv2，或者如SEQ ID NO.23所示的IL6RscFv3；

用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.25所示；

IL6信号肽，如SEQ ID NO.26所示；

人源抗体Fc段，如SEQ ID NO.27所示；

以及用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述人IL6R的人源化单链抗体为如SEQ ID NO.21所示的IL6RscFv1。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件。

4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV启动子。

5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQ ID NO.13所示的CD8 leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.14所示的CD19单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.15所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.16所示的CD19单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.17所示的CD8 Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.18所示的CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.19所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.20所示的TCR嵌合受体T细胞激活域；

所述用于组成集识别、传递、启动于一体的三代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQ ID NO.13所示的CD8 leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.14所示的CD19单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.15所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.16所示的CD19单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.17所示的CD8 Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.18所示的CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.19所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.20所示的TCR嵌合受体T细胞激活域、以及如SEQ ID NO.28所示的CD28嵌合受体共刺激因子。

6.如权利要求1-5任一项所述的载体，其特征在于，所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的封闭IL6R的用于缓解CRS的CAR-T转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将如SEQ ID NO.1所示的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、如SEQ ID NO.2所示的原核复制子pUC Ori序列、如SEQ ID NO.3所示的病毒复制子SV40 Ori序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、如SEQ ID NO.11所示的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件存储于慢病毒骨架质粒上；

(2)将如SEQ ID NO.12所示的人EF1α启动子、用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体组合成二代CAR或三代CAR设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中，得到二代CAR或三代CAR设计的重组慢病毒质粒；

(3)将人IL6R的人源化单链抗体IL6RscFv1、IL6RscFv2、或IL6RscFv3，IRES核糖体结合序列、IL6信号肽以及人源抗体Fc段分别克隆至重组慢病毒质粒中，得到IL-6R阻断重组慢病毒质粒pCAR19-IL6RscFv1、pCAR19-IL6RscFv2、或pCAR19-IL6RscFv3；

(4)将得到的重组慢病毒质粒pCAR19-IL6RscFv1、pCAR19-IL6RscFv2、或pCAR19-IL6RscFv3分别与慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞，在HEK293T/17细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液；

(5)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、吸附、洗脱的柱纯化方式进行纯化，分别得到重组慢病毒载体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，由人EF1α启动子启动整个CAR基因表达；CAR蛋白定位于细胞膜表面，识别CD19抗原，刺激T细胞增殖和细胞因子分泌，激活下游信号通路的表达；当scfv区域与CD19抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生T细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞一系列生物学效应；由IRES核糖体结合序列共表达IL6RscFv与Fc的融合蛋白，并在IL6信号肽的引导下分泌到细胞外，通过与IL6R的结合，阻断IL-6的与IL6R的结合，从而阻断IL6的信号通路，达到抑制CRS的效果。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述抽滤步骤要控制上清体积在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5MPA～-0.9MPA，防止由于堵孔带来的载体损失；所述吸附步骤要控制溶液的PH值在6～8，防止PH的变化导致载体失活；所述洗脱步骤要控制洗脱液的离子强度在0.5M～1.0M，防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。

10.如权利要求1-6任一项所述的载体在制备缓解CRS的药物中的应用。