本发明涉及药学领域，特别涉及一种抗菌药材的筛选方法。
背景技术：
筛选高效的抗菌药物仍然是治疗细菌性传染病的最主要方法。在测试致病性细菌对某一药物的敏感性时，常用的方法有纸片法、牛津杯法、试管二倍稀释法、平板二倍稀释法等。目前上述四种检测方法存在操作繁琐、工作量大、周期长、培养条件不一致等问题，不能快速地确定致病菌株对各药物的敏感性。尤其在初步筛选抗菌中药时，植物药材种类繁多，每种药材预先要粗提其有效部位，并去除萃取溶剂，操作程序更复杂、耗时更长。
技术实现要素：
基于此，需要提供一种针对多菌种可同步进行初筛抗菌中药的快速简便的药敏试验方法。
为解决上述问题，发明人提供了一种抗菌药材的筛选方法，包括如下步骤：
在培养基中加入经超微粉碎处理的抗菌药材，以制成预设浓度梯度的药敏培养基；
在所述药敏培养基上接种致病菌，并将培养预设时间后供菌落形成的最低浓度作为待筛药材的最低抑菌浓度。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，在培养基中加入经超微粉碎处理的抗菌药材的形式包括：加入经超微粉碎的抗菌药材，或，加入含有预设浓度的经超微粉碎的抗菌药材的药液。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，所述经超微粉碎的抗菌药材的尺寸为5-10μm。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，所述步骤“加入含有预设浓度抗菌药材的药液”具体包括：将抗菌药材的超微粉末加蒸馏水在高压灭菌锅中蒸煮，所得物经离心处理后提取上清液。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，加入经超微粉碎的抗菌药材的初始添加浓度为6g/mL。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，加入含有预设浓度的经超微粉碎的抗菌药材的药液的初始添加浓度为1g/mL。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，在步骤“制成预设浓度梯度的药敏培养基”和步骤“在所述药敏培养基上接种致病菌”间还包括步骤：对所述药品培养基进行灭菌处理。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，所述预设时间为24小时。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，在28℃的温度条件下培养24小时。
进一步地，所述的抗菌药材的筛选方法中，步骤“在所述药敏培养基上接种致病菌”具体包括：将致病菌制备为107CFU/mL的菌液，以各2μL的剂量接种于所述药敏培养基上，每一块药敏培养基上接种9株致病菌。
区别于现有技术，上述技术方案具有操作简便、快捷、耗时短、处理量大(即每一个90mm平皿可同时检测9-12株致病菌对药物的敏感度)，试验成本低，以及药敏试验结果准确可靠等优点，是一种高效率的药敏试验方法，在试验研究中具有很好的应用价值，为开发和应用抗菌植物药提供有益参考。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
第一实施例
一种抗菌药材的筛选方法，包括如下步骤：
S1、在培养基中加入经超微粉碎处理并保证颗粒尺寸位于5-10μm的抗菌药材，以初始添加浓度6g/mL开始进行二倍稀释，配置为不同浓度梯度的药敏培养基，并进行121℃、20min的灭菌处理。
S2、将致病菌制备为107CFU/mL的菌液，以各2μL的剂量接种于所述药敏培养基上，每一块药敏培养基上接种9株病原菌。、
S3、在28℃的温度条件下培养24小时，然后将培养预设时间后供菌落形成的最低浓度作为作为待筛药材的最低抑菌浓度。
第二实施例
S1、以蒸馏水和经超微粉碎处理并保证颗粒尺寸位于5-10μm的抗菌药材配制为浓度为1g/mL的混合物在高压灭菌锅中蒸煮，所得混合物经离心处理后提取上清液。
S2、对所提取的上清液进行二倍稀释，配置为不同浓度梯度的药敏培养基，并进行121℃、20min的灭菌处理。
S3、将致病菌制备为107CFU/mL的菌液，以各2μL的剂量接种于所述药敏培养基上，每一块药敏培养基上接种9株病原菌。、
S4、在28℃的温度条件下培养24小时，然后将培养预设时间后供菌落形成的最低浓度作为作为待筛药材的最低抑菌浓度。
发明人同时以滤纸片法和平板二倍稀释法对上述二实施例所述的方法进行了对照，三种方法的具体实施还包括相同的其他条件或过程如下：
所使用的药品与试剂：五倍子(Galla Chinensis，缩写GC，产地湖北)、石榴皮(Pomegranate Rind，缩写PR，产地安徽)、大黄(Rhubarb Officinale，缩写RO，产地甘肃)、黄芩(Baical Skullcap Root，缩写BSR，产地河北)、虎杖(Rhizoma Polygoni Cuspidati，缩写RPC，产地福建)、黄连(Golden Thread，缩写GT，产地四川)、连翘(Weeping Forsythia Capsule，缩写WFC，产地江西)、知母(Common Anemarrhena Rhizome，缩写CAR，产地河北)、首乌藤(Caulis Polygoni Multiflori，缩写CPM，产地江苏)、地榆(Radix Sanguisorbae，缩写RS，产地福建)、贯众(Dryopteris Setosa，缩写DS，产地四川)、金银花(Flos Lonicerae，缩写FL，产地辽宁)、紫花地丁(Purpleflower Violet，缩写PV，产地河南)；马齿苋(Portulaca Oleracea Linn，缩写POL，产地福建)、苦楝皮(Cortex Meliae，缩写CM，产地四川)，国药控股福建有限公司；标准肉汤培养基(Mueller-Hinton Broth，M-H)，广东环凯微生物科技有限公司(批号：201111072)。
致病菌菌株：9株气单胞菌均为厦门市渔用药物工程技术研究中心从漳浦、莆田、龙岩、福清等养殖场病鳗中分离得到，并经人工感染试验证实为致病菌，同时菌株进行生理生化和基因鉴定，分别确定为气单胞菌属(Aeromonas sp.B01、B19)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae B14)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila B10、B15、B18、B20、B27)、肠棕气单胞菌(Aeromonas enteropelgenes B09)。
菌悬液制备：从保种斜面上挑取菌苔划线接种M-H琼脂(Mueller-Hinton Agar)平板，置于28℃恒温培养箱内培养20h；挑取单个菌落划线至新鲜斜面上，28℃培养24h后，用无菌生理盐水将菌体冲洗下来，采用酶标仪测定菌液浓度，测定波长为600nm。采用菌落计数法确定细菌浊度与吸光度OD600的关系，不同菌株的菌液OD600值约为0.2～0.3时，对应活菌计数值约为108CFU/mL，将菌液浓度稀释10倍调至107CFU/mL，即可作为药敏试验接种的菌悬液。
中药高压浸提液的制备：称取50g的中药超微粉，加蒸馏水300mL置于20kHz超声处理40min后，置于高压灭菌锅中煎煮(110℃、10min，95℃、30min)提取，然后用50mL离心管分装，用冷冻离心机8000rpm离心10min，取上清液，放置4℃冰箱保存备用。
采用实施例一或二所述技术方案测定9株气单胞菌对15种常用中药的敏感度，实验结果见表1，可见其中五倍子的抑菌效果最佳，其次是首乌藤、地榆，再次为石榴皮、贯众、大黄、黄芩、虎杖，其余中药的抑菌效果极差。B01、B27对五倍子极度敏感，其余7株菌为高度敏感；除B19、B20对首乌藤显示中度敏感外，其余7株菌均表现为高度敏感；B10对地榆显示低度敏感，B01、B14、B27为中度敏感，B09、B15、B18、B19、B20均为高度敏感；B15、B18、B19、B20、B27对石榴皮显示中度敏感，仅B01、B09表现高度敏感，B10显示低度敏感，而B14显现不敏感；B20对贯众不敏感，B09、B27显示低度敏感，B10、B14、B15、B19显示对贯众中度敏感，B01、B18对贯众显示高度敏感；除B01、B10、B15对大黄中度敏感外，其余均为低度敏感；9株气单胞菌对黄芩均呈现低度敏感。9株气单胞菌对虎杖的敏感性差异很大，B01、B10、B14、B18表现为高度敏感，但其余菌株均不敏感。
表1超微药粉琼脂稀释法测定各种中药的最低抑菌浓度(药物浓度单位：μg/mL)
从作为对照的纸片法和稀释法的结果来看：
平板二倍稀释法与纸片法所使用的药物都是液体，在做药敏试验之前同样都要通过耗时较长、操作较复杂的中药提取工序。而本发明所述的技术方案只需将中药药材进行超微粉碎处理即可，步骤简单。由于药材粉碎颗粒足够细，达到了5-10μm，保证药材中的有效成分在琼脂培养基中可以充分溶出无需再考虑有效成分提取率高低对药敏结果的负面影响。
比较本发明所述技术方案与稀释法的实验结果可见：本发明所述技术方案测得平均最低抑菌浓度均低于平板二倍稀释法，灵敏度明显增加。虽然这两种方法在抑菌浓度上测得数据有差异，个别菌株的敏感度级别发生变化，但不同中药对某一株致病菌的抑制效应强弱是一致的。
本发明实施例所述技术方案测定的中药MIC值均低于平板二倍稀释法，原因在于平板二倍稀释法使用的是中药高压水提液，而本发明实施例所述技术方案使用的是中药超微粉；采用水煎煮、高压抽提、超声提取、微波提取或有机溶剂萃取等中药粗提方法，均无法将中药植物药材细胞内的有效成分完全溶出，故降低了抑菌效果；而本法将中药超微粉直接添加入琼脂培养基，在进行抑菌药敏试验过程中，微米级颗粒的药粉一直存在于细菌培养基内，不断释放抗菌有效成分，可达到较高的抑菌作用。故可避免由于中药粗提方法选择不当，造成有效物质提取率低，而容易在初步筛选时将高效的抗菌药材遗漏等问题。
再进行纸片法与超微药粉琼脂稀释法的比较：针对9株致病菌从15种中药筛选出具有高效抑菌作用的药材，采用药敏纸片法需要制备81个琼脂平板；而本发明实施例所述技术方案只需要45个琼脂平板。两者相比，筛选工作量显著减少，操作更快捷，试验材料费大大降低。
前期预试验结果显示，由于受纸片上药物含量的限制，低敏感度和不敏感的中药对致病菌均不产生抑菌圈，且考虑到实验操作量，只选择抑菌效果较好又存在差异的3种中药(五倍子、地榆、石榴皮)和有代表性的4株致病菌进行比较试验。从实验结果可见采用本发明实施例所述技术方案测得有效抑菌浓度低于纸片法，即灵敏度相应提高，然而4株致病菌对中药五倍子、地榆、石榴皮的分级敏感程度与纸片法检测结果一致，同样体现了超微药粉琼脂稀释法的可靠性和高灵敏性。
综上比较说明，本发明提供的抗菌药材筛选方法具有操作简便、快捷、耗时短、处理量大(即每一个90mm平皿可同时检测9-12株致病菌对药物的敏感度)，试验成本低，以及药敏试验结果准确可靠等优点，是一种高效率的药敏试验方法，在试验研究中具有很好的应用价值，同时为开发和应用抗菌植物药提供有益参考。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。