一种以pH调控结合有机氮源补料提高ε‑聚赖氨酸产量的方法与流程

本发明涉及一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法。

(二)

背景技术：

1977年，日本科学家Shima.S和Sakai.H无意中从土壤中筛选得到一株能够产生生物碱类物质的白色链霉菌(Streptomyces albulus)346，通过研究发现，这是一种赖氨酸聚合物，是由25～35个L-赖氨酸残基通过α-COOH和ε-NH₂脱水缩合形成的，分子量约为3500～4500，由于其肽键不同于一般蛋白质的α肽键，所以将这种物质称为ε-聚赖氨酸(ε-PL)。

ε-PL在生物学性质上是一种多肽，具有抑菌作用，能够作为食品防腐剂使用，在人体内，它能够被分解成L-赖氨酸，而赖氨酸是人体必须的8种氨基酸之一，因此ε-PL是一种营养型抑菌剂。ε-PL的安全性很高，其很难被机体吸收且急性口服剂量高达5g/kg。ε-PL还具有较广的抑菌范围，它除了对霉菌、革兰氏阳性菌(G⁺)、革兰氏阴性菌(G^-)、酵母菌有一定的抑菌效果之外，其还带有一定的抗噬菌体能力。ε-PL作为一种新型的微生物防腐剂，已被美国FAD认证并被广泛应用在美国、韩国、日本和欧盟等地，在2014年，中国也已经批准其作为食品添加剂使用。

ε-PL的抑菌作用主要通过两种方式：第一，破坏细胞膜的完整性。ε-PL容易被微生物通过吸附作用结合到细胞膜上，并利用物化作用来破坏膜结构的完整性，从而改变细胞膜的通透性，中断细胞的物质、能量和信息传递并引发胞内溶酶体膜破裂，使微生物产生自溶作用，最终使细胞死亡。第二，破坏蛋白合成系统。由于ε-PL呈高聚合多价阳离子态，易结合在核糖体上，能够有效抑制多种酶及蛋白质的合成，从而使微生物因缺乏相关酶而不能够正常进行能量转化、物质代谢等过程，导致微生物生长抑制或死亡。

目前，ε-PL主要与其它防腐剂复配使用，复配产物在市场上售价约为1500元/kg左右。在2001年，日本窒素公司发酵水平已经达到了48.3g/L，形成了年产千吨级ε-PL的工业化生产规模，市场份额达到了数十亿日元。而国内的研究还处于实验室及中试规模的阶段，但中国的人口是日本的数十倍，潜在的市场价值十分可观。因此在我国进行ε-PL发酵工艺的研究开发以提高发酵水平，对实现ε-PL的工业化生产具有重要意义。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种提高ε-PL产量的方法，能够获得最高的ε-PL产量为34.19g/L，并大大缩短了发酵周期。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种提高ε-PL产量的方法，所述方法为：在5L发酵罐中按接种量10％接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到一定pH值，自动流加12.5％的氨水使得pH维持一段时间不变，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，获得一种对产物合成最有效的pH调控方式。

进一步，所述下降到的pH值范围为6.5～5.0。

进一步，所述pH维持时间为6h～18h。

进一步，所述最有效的pH调控方式下，利用800g/L的葡萄糖、80g/L的(NH₄)₂SO₄并结合一定浓度的有机氮源进行间歇补料，使发酵液中NH₄⁺-N浓度维持在0.5g/L左右，葡萄糖浓度维持在10g/L左右，获得一种提高ε-PL产量的补料方式；所述有机氮源为酵母粉、玉米浆、鱼粉、牛肉膏、混合有机氮源(玉米浆与鱼粉的浓度之比为1∶2，即C_玉米浆∶C_鱼粉＝1∶2)。

进一步，所述有机氮源的总浓度为200g/L。

本发明的有益效果主要体现在：采用本发明方法，在此pH调控方式下，发酵前期就能积累一定的菌体量，能够促进ε-PL的合成；利用混合有机氮源补料，弥补了单一有机氮源在产物合成或菌体生长方面的不足；能够有效缩短ε-PL的发酵周期，在较短的时间获得较高的ε-PL产量，提高ε-PL的得率。

(四)附图说明

图1 5L发酵罐中ε-PL的发酵过程动力学参数曲线图

图2实施例11基于pH调控间歇补混合有机氮源发酵产ε-PL的动力学参数曲线图

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到6.5，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，最终菌体量为12.25g/L，ε-PL产量为1.65g/L。

实施例2：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到6.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，最终菌体量为15.00g/L，ε-PL产量为1.91g/L。

实施例3：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.5，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，最终菌体量为15.81g/L，ε-PL产量为2.44g/L。

实施例4：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，最终菌体量为16.96g/L，ε-PL产量为2.81g/L。

实施例5：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持6h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，最终菌体量为14.40g/L，ε-PL产量为2.17g/L。

实施例6：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持18h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，最终菌体量为19.20g/L，ε-PL产量为0.97g/L。

实施例7：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，利用800g/L的葡萄糖、80g/L的(NH₄)₂SO₄并结合200g/L的酵母粉进行间歇补料，使发酵液中NH₄⁺-N的浓度维持在0.5g/L左右，葡萄糖的浓度维持在10g/L左右，最终菌体量为45.98g/L，ε-PL产量为26.66g/L，得率为3.68g/(L·d)。

实施例8：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，利用800g/L的葡萄糖、80g/L的(NH₄)₂SO₄并结合200g/L的鱼粉进行间歇补料，使发酵液中NH₄⁺-N的浓度维持在0.5g/L左右，葡萄糖的浓度维持在10g/L左右，最终菌体量为40.48g/L，ε-PL产量为29.30g/L，得率为4.04g/(L·d)。

实施例9：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，利用800g/L的葡萄糖、80g/L的(NH₄)₂SO₄并结合200g/L的玉米浆进行间歇补料，使发酵液中NH₄⁺-N的浓度维持在0.5g/L左右，葡萄糖的浓度维持在10g/L左右，最终菌体量为52.78g/L，ε-PL产量为21.60g/L，得率为2.98g/(L·d)。

实施例10：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，利用800g/L的葡萄糖、80g/L的(NH₄)₂SO₄并结合200g/L的牛肉膏进行间歇补料，使发酵液中NH₄⁺-N的浓度维持在0.5g/L左右，葡萄糖的浓度维持在10g/L左右，最终菌体量为48.14g/L，ε-PL产量为23.74g/L，得率为3.27g/(L·d)。

实施例11：

在5L发酵罐中按10％接种量接完发酵液后，等初始pH 6.8自然下降到5.0，自动流加12.5％的氨水使得pH维持12h，然后使其pH自然下降到产物合成最佳的pH 3.8，并自动流加氨水维持在这一pH，利用800g/L的葡萄糖、80g/L的(NH₄)₂SO₄并结合67g/L的玉米浆及133g/L的鱼粉(C_玉米浆∶C_鱼粉＝1∶2)进行间歇补料，使发酵液中NH₄⁺-N的浓度维持在0.5g/L左右，葡萄糖的浓度维持在10g/L左右，最终菌体量为46.44g/L，ε-PL产量为34.19g/L，得率为4.72g/(L·d)。