本发明涉及一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体，属于蛋白质工程。
背景技术：
苯丙氨酸脱氨酶(PAL)可用于有效并长期式地治疗苯丙酮尿症(PKU)。鱼腥藻Anabaena variabilis来源的PAL(Av-PAL)因为其稳定性以及较低免疫原性，在PKU治疗方面展示了较好的潜力。但是原核来源的Av-PAL酶活较真核来源的PAL酶活相差较大，而人们也发现Tyr78这一loop(Ser73至Ala97)对MIO这一家族酶有着非凡的意义，包括酶活和底物的选择性。
技术实现要素：
本发明旨在提供一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体，由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码。
本发明还提供一种重组表达所述苯丙氨酸脱氨酶突变体的方法，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET28a为表达载体，将所得重组菌种子液接种于含卡那霉素的2YT表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600至0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h苯丙氨酸脱氨酶突变体的表达。
2YT表达培养基含有蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L。
在本发明的一种实施方式中，还包括将重组菌体破碎后，收集上清，上清膜过滤后，用His Trap HF柱分离得到苯丙氨酸脱氨酶突变体。
本发明提供的苯丙氨酸脱氨酶突变体S73N的比酶活为2.22U/mg，较原酶的1.78U/mg提高了25％；kcat(s-1)较原酶的1.650s-1提高了26.7％。
具体实施方式
酶活的定义：每分钟每毫克PAL转化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸的量(μmols)。
酶活测定方法：在pH 8.5的100mM Tris-Hcl缓冲液中，以10mM L-苯丙氨酸为底物，在37℃下反应20min，根据290nm的吸收值测定生成的肉桂酸浓度，确定酶活。
动力学参数的确定：在37℃下，以0.01至0.3mM的L-苯丙氨酸为底物，加入0.5μg纯酶，在pH 8.5的100mM Tris-Hcl缓冲液中反应12min，期间96孔板连续检测产物。
实施例1
(1)突变体S73N的构建：
以pET28a-PAL为模版，以表1所示引物在表2所示条件下，PCR得到携带编码突变体S73N的基因的重组载体pET28a-PAL/S73N。pET28a-PAL的构建方法参见Moffitt,M.C.,Louie,G.V.,Bowman,M.E.,Pence,J.,Noel,J.P.and Moore,B.S.(2007)Discovery of two cyanobacterial phenylalanine ammonia lyases:Kinetic and structural characterization.Biochemistry-Us,46,1004-1012.
表1引物
表2全质粒PCR扩增反应体系
PCR扩增反应条件为：
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将PCR产物纯化、消化后转入BL21宿主。
(2)将重组大肠杆菌BL21/pET28a-PAL/S73N接种于4mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振荡过夜培养。
将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的100mL 2YT表达培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)中，37℃、200r/min振荡培养至OD600至0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h得到菌体，5000g的转速离心收菌。
(3)将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(50mmol/L Na2HPO4、50mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的His Trap HF柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用SDS-PAGE分析鉴定。
(4)酶活的测定：在400μl pH 8.5的Tris-Hcl缓冲反应体系中分别加入3μg纯化后的突变酶S73N和野生酶(SEQ ID NO.2)，加底物L-苯丙氨酸至10mM，在37℃下反应20min，确定相应比酶活。S73N的比酶活为2.22U/mg，野生酶的1.78U/mg。
(5)动力学参数的确定：以不同浓度的L-苯丙氨酸为底物(0.01至0.3mM)，确定动力学参数。
表1野生酶(WT)和S73N的动力学参数
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
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attttaactg cgatcgctat gggcgttcac gctctagata tccaagcttt aaacggaacc 780
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<212> DNA
<213> 鱼腥藻
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