本发明属于生物技术领域，属于从猪鼻骨中提取硫酸软骨素的方法。
背景技术：
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)是一种酸性粘多糖，广泛存在于哺乳动物的软骨、喉骨、鼻骨和气管中。硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结而成的双糖聚合物，它含有50～70 个双糖基本结构,分子量为10000～50000。按其化学组成和结构,可分为CSA、C、D、E、F、H 等多种同分异构体,药用硫酸软骨素是从动物软骨中提取的,主要是A、C 及各种硫酸软骨素的混合物。CSA 和CSC 均由D2氨基葡萄糖醛和N2乙酰2D2氨基半乳糖组成,只是硫酸基团位置不同。
硫酸软骨素通常与蛋白质结合成糖蛋白的形式存在，当其水解时发生消去反应，连接硫酸软骨素与蛋白质中丝氨酸羟基的苷键断裂，可以得到游离态的硫酸软骨素。硫酸软骨素为白色或微黄色粉末,具有吸湿性，易溶于水而成粘度较大的溶液，难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，临床上可用于预防动脉粥状硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病，与硝酸铋或氢氧化铝反应得到的络合物可用于治疗消化性溃疡，与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉剂。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。
随着硫酸软骨素生物活性不断被揭示和其应用领域的不断扩展,有关硫酸软骨素的提取、纯化和分离技术已取得了一定的研究成果,但应用于生产实际还有许多需要改进和完善之处。目前，硫酸软骨素生产厂家主要采用的方法成本高，产率和纯度低。所以，本公司开发了稀碱——酶解——树脂吸附提取法从猪鼻骨中提取硫酸软骨素，以降低成本，提高效益。
技术实现要素：
本发明提供了一种全新的方法（稀碱—酶解—树脂吸附提取法）从猪鼻骨中提取硫酸软骨素，能够有效地降低成本，并提高产品的产率和纯度。
为此，本发明通过以下技术方案予以实现：
1、碱解
将猪鼻骨粉碎，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡，42～53℃下保温碱解3小时。
2、酶解
加4mol/L盐酸调节pH到6.5～7.5，按猪鼻骨与胰蛋白酶1000∶(1~8)的质量比加入胰蛋白酶，于40～50℃酶解12小时后，再按猪鼻骨与胃蛋白酶1000∶(1~8)的质量比加入胃蛋白酶，40～50℃酶解12小时。
3、树脂吸附
将溶液通过离子交换树脂柱吸附完毕，用0.5 mol/L的NaCl 液洗涤，再用1.8mol/L 的氯化钠液洗脱，流速2L/h。
4、沉淀
调节洗脱液pH至6.8～7.2，再加入2.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后，静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素。
5、纯化
将硫酸软骨素溶于浓度为2%~5%(m/v)的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到较高纯度的硫酸软骨素。
6、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
本发明的有益效果是：用碱解、酶解、树脂吸附三者相结合的方法分离猪鼻骨中的硫酸软骨素，并且增加了纯化过程，有效地降低了生产成本，并且提高了产品的产率和纯度。
四、具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：
1、碱解
称取100千克猪鼻骨粉碎，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡，45℃下保温碱解3小时。
2、酶解
加4mol/L盐酸调节pH到6.6，按猪鼻骨与胰蛋白酶1000∶3的质量比加入胰蛋白酶，于49℃酶解12小时后，再按猪鼻骨与胃蛋白酶1000∶3的质量比加入胃蛋白酶，42℃酶解12小时。
3、树脂吸附
将溶液通过离子交换树脂柱吸附完毕，用0.5 mol/L的NaCl 液洗涤，再用1.8mol/L 的氯化钠液洗脱，流速2L/h。
4、沉淀
调节洗脱液pH至6.9，再加入2.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后，静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素。
5、纯化
将硫酸软骨素溶于浓度为2%(m/v)的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到较高纯度的硫酸软骨素。
6、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
7、对比
称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量24726L,产出硫酸软骨素20.27kg,纯度78.26%，产率49.20%。称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用稀碱—酶解—树脂吸附提取法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量2993L,产出硫酸软骨素28.36kg,纯度97.24%，产率85.54%。通过对比发现：传统工艺明显地成本高，效益低。
实施例二：
1、碱解
称取100千克猪鼻骨粉碎，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡，51℃下保温碱解3小时。
2、酶解
加4mol/L盐酸调节pH到7.3，按猪鼻骨与胰蛋白酶1000∶3的质量比加入胰蛋白酶，于43℃酶解12小时后，再按猪鼻骨与胃蛋白酶1000∶3的质量比加入胃蛋白酶，48℃酶解12小时。
3、树脂吸附
将溶液通过离子交换树脂柱吸附完毕，用0.5 mol/L的NaCl 液洗涤，再用1.8mol/L 的氯化钠液洗脱，流速2L/h。
4、沉淀
调节洗脱液pH至7.1，再加入2.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后，静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素。
5、纯化
将硫酸软骨素溶于浓度为2%(m/v)的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到较高纯度的硫酸软骨素。
6、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
7、对比
称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量24726L,产出硫酸软骨素20.27kg,纯度78.26%，产率49.20%。称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用稀碱—酶解—树脂吸附提取法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量2983L,产出硫酸软骨素28.91kg,纯度97.13%，产率86.20%。通过对比发现：传统工艺明显地成本高，效益低。
实施例三：
1、碱解
称取100千克猪鼻骨粉碎，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡，49℃下保温碱解3小时。
2、酶解
加4mol/L盐酸调节pH到6.9，按猪鼻骨与胰蛋白酶1000∶3的质量比加入胰蛋白酶，于44℃酶解12小时后，再按猪鼻骨与胃蛋白酶1000∶3的质量比加入胃蛋白酶，47℃酶解12小时。
3、树脂吸附
将溶液通过离子交换树脂柱吸附完毕，用0.5 mol/L的NaCl 液洗涤，再用1.8mol/L 的氯化钠液洗脱，流速2L/h。
4、沉淀
调节洗脱液pH至7.1，再加入2.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后，静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素。
5、纯化
将硫酸软骨素溶于浓度为2%(m/v)的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到较高纯度的硫酸软骨素。
6、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
7、对比
称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量24726L,产出硫酸软骨素20.27kg,纯度78.26%，产率49.20%。称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用稀碱—酶解—树脂吸附提取法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量2988L,产出硫酸软骨素31.26kg,纯度98.97%，产率95.96%。通过对比发现：传统工艺明显地成本高，效益低。