一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖及其制备方法与流程

本发明涉及一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制备方法，属于医药保健品技术应用领域。

背景技术：

肝癌是一类常见的癌症，有极高的发病率和致死率。手术治疗法和放化疗法是目前治疗肝癌的主要手段。然而手术治疗预后差，易复发；化学药物因其对正常细胞的杀伤作用会带来较大的毒副作用，给病人带来极大的痛苦。因此，科学家们努力从天然产物中寻找更加高效低毒的抗癌剂。研究表明，长期的免疫力低下也是癌症产生的重要原因之一，提高机体的免疫水平是肿瘤治疗的关键手段。因此寻找具有提高免疫力水平作用的抗癌药物是非常必要的。

香菇的产量高，食用人群广。香菇含有丰富的营养物质，其中香菇多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒等功能，香菇多糖作为一种重要的功能因子，具有非常广泛的开发应用前景。目前普遍认为香菇多糖是通过增强机体免疫力间接发挥抗肿瘤作用，但由于香菇多糖分子量大，溶解度低，空间结构复杂，如果前处理方法不当，会导致香菇多糖的活性得不到充分发挥。目前香菇多糖常用的提取方法是水提取法，这种提取方法的缺点是时间长、效率低、破坏有效成分。超声辅助提取法、微波辅助提取法作为近年来常用的提取方法，虽然提高了效率，但是所带来的有效成分失活，辐射对人体健康所带来的伤害不容忽视。高温高压提取法由于温度较高会破坏有效成分。高压均质技术可以将液体中的固体颗粒进行超微细化，将香菇内的活性物质释放出来，缺点是一部分活性物质会残留在破碎的固料表面，不能完全进入提取溶剂中。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖。

本发明的第二个目的是提供一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶解处理：取干燥香菇子实体，粉碎，加入10～40质量倍的去离子水，加入纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶；在45～55℃，酶解2～5h；所述香菇子实体、纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的质量比为20～50：0.5～1：0.05～0.15：0.2～0.5：0.3～0.5；

(2)高压均质处理：将步骤(1)得到的香菇酶解液，用高压均质机，在50～100MPa压力下处理1～3次，每次10～30min，得到均质液；

(3)香菇多糖的提取：将步骤(2)获得的均质液过滤，滤液减压浓缩至滤液体积的1/6～1/4，得浓缩液，向浓缩液中加浓缩液体积2.5～4倍的体积浓度为95～99.7％的乙醇水溶液，静置12～24h，在3000～5000rpm，离心5～15min，将沉淀物干燥，得香菇多糖总糖含量为90％以上；分子量范围是1.82×10²～4.46×10²KDa的香菇多糖。

上述方法制备的香菇多糖总糖含量为90％以上；分子量范围是1.82×10²～4.46×10²KDa的香菇多糖。

本发明的优点：

(1)本发明利用复合酶解技术对香菇预处理，水解细胞壁，改变香菇的质地结构，再利用高压均质机短时间处理，将有效成分与溶剂充分混匀，大大提高了提取效率，充分保留活性成分不被破坏，具有制备过程简便、安全、无毒的特点，为活性化合物的工业化应用提供新方法。

(2)制备获得的香菇多糖总糖含量为90％以上；分子量范围是1.82×10²～4.46×10²KDa的香菇多糖具有提高免疫，清除体内自由基的作用，抗肝癌效果显著，且用药后不良反应少，改善了荷瘤小鼠的生存质量。

附图说明

图1为实施例1制备的香菇多糖用药后各组荷瘤小鼠肿瘤体积随观察天数的变化曲线；

图2为实施例1制备的香菇多糖用药后各组荷瘤小鼠的肿瘤照片；

图3为实施例1制备的香菇多糖用药后各组荷瘤小鼠的水食效率；

图4为实施例1制备的香菇多糖用药后各组荷瘤小鼠的肿瘤病理切片图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。

实施例1

一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶解处理：取干燥香菇子实体，粉碎，加入20质量倍的去离子水，加入纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶；在45℃，酶解时间为3h；所述香菇子实体、纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的质量比为40：0.6：0.12：0.4：0.5；

(2)高压均质处理：将步骤(1)得到的香菇酶解液，用高压均质机，在100MPa压力下处理3次，每次20min，得到均质液；

(3)香菇多糖的提取：将步骤(2)获得的均质液过滤，滤液减压浓缩至滤液体积的1/6，得浓缩液，向浓缩液中加浓缩液体积3倍的体积浓度为95％的乙醇水溶液，静置24h，在4000rpm，离心15min，将沉淀物干燥，得香菇多糖。

实施例2

一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶解处理：取干燥香菇子实体，粉碎，加入40质量倍的去离子水，加入纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶；在55℃，酶解4h；所述香菇子实体、纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的质量比为20：0.5：0.05：0.2：0.3；

(2)高压均质处理：将步骤(1)得到的香菇酶解液，用高压均质机，在50MPa压力下处理1次，每次30min，得到均质液；

(3)香菇多糖的提取：将步骤(2)获得的均质液过滤，滤液减压浓缩至滤液体积的1/4，得浓缩液，向浓缩液中加浓缩液体积2.5的体积浓度为99.7％的乙醇水溶液，静置12h，在5000rpm，离心10min，将沉淀物干燥，得香菇多糖。

实施例3

一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶解处理：取干燥香菇子实体，粉碎，加入10质量倍的去离子水，加入纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶；在55℃，酶解2h；所述香菇子实体、纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的质量比为50：1：0.15：0.5：0.4；

(2)高压均质处理：将步骤(1)得到的香菇酶解液，用高压均质机，在80MPa压力下处理3次，每次10min，得到均质液；

(3)香菇多糖的提取：将步骤(2)获得的均质液过滤，滤液减压浓缩至滤液体积的1/5，得浓缩液，向浓缩液中加浓缩液体积4倍的体积浓度为95的乙醇水溶液，静置12h，在3000rpm，离心5min，将沉淀物干燥，得香菇多糖。

实施例4

一种具有抗肝癌提高免疫力作用的香菇多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶解处理：取干燥香菇子实体，粉碎，加入30质量倍的去离子水，加入纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶；在50℃，酶解5h；所述香菇子实体、纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的质量比为30：0.8：0.08：0.3：0.3；

(2)高压均质处理：将步骤(1)得到的香菇酶解液，用高压均质机，在60MPa压力下处理2次，每次25min，得到均质液；

(3)香菇多糖的提取：将步骤(2)获得的均质液过滤，滤液减压浓缩至滤液体积的1/6，得浓缩液，向浓缩液中加浓缩液体积3倍的体积浓度为99.7％的乙醇水溶液，静置24h，在5000rpm，离心5min，将沉淀物干燥，得香菇多糖。

表1各实施例制备得到香菇多糖的得率及理化性质

实施例5

本发明的香菇多糖对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用。

实验目的：

检测本发明的香菇多糖对小鼠移植性肿瘤生长的影响。

实验材料：

1.受试物：实施例1获得的香菇多糖。准确称量香菇多糖，用生理盐水溶解，配成浓度为15mg/mL的贮存液，在-20℃下保存，使用时用生理盐水将香菇多糖稀释成3，6和12mg/mL的低中高三个剂量的溶液；环磷酰胺：江苏盛迪医药有限公司(批号15101225)；0.9％氯化钠注射液(生理盐水)：河北天成药业股份有限公司(批号A15100801)；

2.试剂：DMEM培养基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS缓冲液：Solarbio(Beijing)；台盼蓝：Solarbio(Beijing)；其余试剂均为市售。

3.动物及瘤株：雄性昆明种小鼠，体重20±2g，共40只，动物合格证SCXK(京)2014-0004，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。鼠源性H22肝癌细胞：购自上海细胞库。

4.仪器：CO₂培养箱(BPN-80CW)：上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台(SW-CJ-1FD)：苏州净化设备有限公司；倒置显微镜(BDS-200)：重庆奥特光学仪器有限公司。紫外分光光度计(UV-9200)：北京瑞利分析仪器厂。酶标仪(DNM-9602)：北京普朗医疗设备有限公司。

实验方法及结果：

1.受试物对H22实体瘤的抑制作用

取冻存的鼠源性H22肝癌细胞，置于37℃恒温水浴中解冻，离心，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤两次，再用PBS液重悬细胞，经ICR小鼠腹腔传3代以上，腹水长出后，在无菌条件下抽取瘤液，瘤液与生理盐水按体积比1:1的比例稀释并充分混合得到细胞悬液。用台盼蓝染色后，在血细胞计数器上计数，其中活细胞数大于95％，用生理盐水调整细胞悬液的浓度为1×10⁷个瘤细胞/mL。然后将调整好浓度的细胞悬液按0.2mL/只接种于小鼠右前肢腋窝皮下，构建实体瘤动物模型，得到H22荷瘤小鼠。

接种后次日随机分组，每组8只，受试物组(低中高三个剂量)，模型组(生理盐水)和阳性对照药组(25mg/kg)。小鼠灌胃给药，每天一次，剂量0.01mL/g(给药体积/小鼠体重)连续给药给药14天，给药期间，每隔2到3天用游标卡尺测量肿瘤的最大直径a、最小直径b，按V＝1/2×a×b²计算瘤体积，绘制小鼠肿瘤生长曲线。实验结果见表2、图1；于第15天称取各小鼠的体重，摘除眼球取血，脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤、脾脏、胸腺并称重，按以下各式计算肿瘤抑制率、脾脏指数及胸腺指数。肿瘤拍照。实验结果见表3、表4、图2。

肿瘤抑制率(％)＝(1－给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％

脾脏指数(mg/g)＝脾脏重量/体重

胸腺指数(mg/g)＝胸腺重量/体重

表2实验各组小鼠给药期间肿瘤体积

实施例1各组小鼠给药期间肿瘤体积如表2所示，图1是实施例1各组小鼠的瘤体积随观察天数的变化曲线，结果表明，本发明的香菇多糖能减缓小鼠移植性肿瘤的生长速度，对肿瘤的生长有阻碍作用。

实验证明，实施例2、3、4的香菇多糖能减缓小鼠移植性肿瘤的生长速度，对肿瘤的生长有阻碍作用。

表3实验各组小鼠的瘤重及肿瘤的抑制率

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs阳性对照药组

由表3所示的实验数据及图2的肿瘤照片可知，与模型组相比，实施例1的香菇多糖对小鼠H22实体瘤有明显的抑制作用(P<0.001)，且具有浓度依赖性，随着用药剂量的增加，抑瘤作用增强。高剂量组的抑瘤效果接近于阳性对照药，无显著性差异，P>0.05。

实验证明，实施例2、3、4的香菇多糖对小鼠H22实体瘤有明显的抑制作用。

表4实验各组小鼠的脾脏指数和胸腺指数

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs阳性对照药组

由表4的实验结果可知，实施例1的高剂量的香菇多糖可以显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，提高了小鼠的固有免疫力。

实验证明，实施例2、3、4的香菇多糖，高剂量可以显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，提高了小鼠的固有免疫力。

本发明的香菇多糖对荷瘤小鼠生存质量的影响

实验方法及结果：

每日测定小鼠的体重，摄食量及摄水量。计算小鼠的水食效率。摄食效率＝(增长的体重/摄食量)×100％；摄水效率＝(增长的体重/摄水量)×100％。实验结果见图3。

由图3可知，与阳性对照药相比，实施例1的香菇多糖可以显著提高荷瘤小鼠的水食效率(P<0.001)，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存质量。

实验证明，实施例2、3、4的香菇多糖可以显著提高荷瘤小鼠的水食效率，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存质量。

本发明的香菇多糖对荷瘤小鼠肝脏中相关酶的影响

实验方法及结果：

测肝组织匀浆中过氧化氢(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活力及丙二醛(MDA)的含量。测定试剂盒购买于南京建成生物工程研究所(货号依次为：A007-1；A005；A001-3；C009-2；C010-2；A003-1)。各组小鼠肝脏中相关酶的含量如表5所示。

表5实验各组小鼠肝脏中相关酶的含量

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs阳性对照药组

由表5的结果可知，本发明实施例1的香菇多糖可以提高肝脏中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝脏MDA的水平，且有浓度依赖性。另外，实施例1的香菇多糖可以显著降低肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力，降低肝毒性，减少肝脏炎症的产生。与模型组相比，阳性药组小鼠肝脏中转氨酶升高，这表明化疗药环磷酰胺对肝脏有较大的毒性。

实验证明，实施例2、3、4的香菇多糖提高肝脏中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝脏MDA的水平，且有浓度依赖性。可以显著降低肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力，降低肝毒性，减少肝脏炎症的产生。与模型组相比，阳性药组小鼠肝脏中转氨酶升高，这表明化疗药环磷酰胺对肝脏有较大的毒性。

本发明的香菇多糖对荷瘤小鼠血清中免疫因子含量的影响

实验方法及结果：

各组小鼠停药后次日采用眼球摘除法取血，静置后离心分离血清，ELISA法检测荷瘤小鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量，结果见表6。

表6实验各组小鼠血清中血管内皮生长因子、白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的含量

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs阳性对照药组

由表6可知，实施例1的香菇多糖可以降低肿瘤血管内皮生长因子的表达，提高白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达，提高机体免疫力。

实验证明，实施例2、3、4的香菇多糖可以降低肿瘤血管内皮生长因子的表达，提高白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达，提高机体免疫力。

实施例1荷瘤小鼠的肿瘤病理切片见图4(A-E分别代表：模型组、阳性对照药组、香菇多糖低剂量组、香菇多糖中剂量组、香菇多糖高剂量组)

给药组细胞生长不如模型组活跃，部分紧密排列，部分较松散，大片状肿瘤组织坏死，高剂量组可见较大部分凝固性坏死，肿瘤周边可见血管、出血及纤维组织；少量炎细胞浸润。