一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行金针菇菌种保护的方法与流程

本发明属于金针菇菌种保护领域，特别涉及一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行金针菇菌种保护的方法。

背景技术：

金针菇(flammulinavelutipes)是我国广泛栽培的食用菌之一，具有重要的食药用的价值。金针菇的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种。而菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，其中投入了大量的人力物力和时间成本。但是由于金针菇可以进行无性繁殖，其菌种生产工艺具有可复制性，使得容易被仿冒。

营养缺陷型菌株由于基因发生突变丧失了合成某种物质的能力，在基本培养基中无法正常生长，必须补充某些物质才可以正常生长。如果无法明确知道究竟是何种营养缺陷其生产会受到极大限制，可以使得育种者的知识产权得到充分的保护。

金针菇作为深受消费者喜爱的食用菌采用营养缺陷标记具有更高的安全性。常见的营养缺陷型菌株的筛选标记有腺嘌呤、蛋氨酸、尿嘧啶、色氨酸、核菌素、精氨酸、亮氨酸、脯氨酸、肌醇等。在金针菇的遗传研究中，尿嘧啶合成的两种关键酶基因pyrf与pyrg已经被成功克隆，这为金针菇尿嘧啶营养缺陷型的研究提供了一定的理论基础。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行金针菇菌种保护的方法，该方法简单，成本低，使用常规的菌种分离方法得到的菌种无法正常的生长繁殖，可以有效对金针菇菌种进行保护。

本发明的一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行金针菇菌种保护的方法，包括：

将金针菇尿嘧啶营养缺陷型单核体ng1-92与金针菇单核体野生型菌株杂交，出菇后单孢分离获得单核体菌株；将单核体菌株接种于5-氟乳清酸筛选培养基培养并进行鉴定，得到尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株，然后通过单单杂交得到尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。

所述金针菇尿嘧啶营养缺陷型单核体ng1-92的保藏编号为：cgmccno.12878。扩增后的pyrg基因序列如seqidno.1所示。保藏日为2016年9月19日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，建议分类命名为：金针菇(flammulinavelutipes)。

所述出菇为在木屑培养基上出菇。

所述5-氟乳清酸筛选培养基的组成为：在基本培养基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶及0.5g/l的5-氟乳清酸。

所述基本培养基的组成为：kh2po31.0g、(nh4)2hpo31.5g、mgso4·7h2o0.3g、thiaminehcl500μg、琼脂粉15g，加水至1l，灭菌后倒平板备用。

所述尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在不含尿嘧啶添加物的基本培养基中无法正常生长，在pda培养基上生长速度低于野生型菌株，在添加尿嘧啶的pdau培养基上生长速度提高。

有益效果

本发明方法简单，成本低，得到的金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在不含尿嘧啶添加物的基本培养基中无法正常生长，生长速度为零；金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在马铃薯培养基上平均生长速度(0.2186cm/d)低于正常野生型菌株的生长速度(1.4089cm/d)，在添加尿嘧啶的马铃薯培养基上生长速度有很大程度的提高(421.91％)，平均生长速度为1.1409cm/d，使用常规的菌种分离方法得到的菌种无法正常的生长繁殖，可以有效对金针菇菌种进行保护。

附图说明

图1为金针菇尿嘧啶营养缺陷型单孢2-6与dg1-1在不同培养基上的生长情况；

图2为金针菇尿嘧啶营养缺陷型纯合体菌丝镜检图片；

图3为金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株vg1-2与g1在不同培养基上的生长情况；

图4为金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株pyrg基因酶切产物琼脂糖电泳检测：其中，m：dl2000marker；1：g1；2：dg1-1；3：ng1-92；4：vg1-2；5：g1酶切；6：dg1-1酶切；7：ng1-92酶切；8：vg1-2酶切。

图5为金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株和正常菌株在pda培养基上的生长速度；

图6为金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株和正常菌株在pda和pdau培养基上的生长速度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

1.材料：试验所使用的金针菇单核体菌株dg1-1、dg1-29、双核体菌株g1均由中国农业微生物保藏中心食用菌分中心保藏。

2.pcr引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

3.培养基：

木屑培养基：80％木屑与20％的麸皮混合，含水量为63％，装袋灭菌后，供出菇使用。

马铃薯培养基(pda)：pda粉末39g，加水至1l，灭菌，倒平板，供菌丝活化与菌丝培养使用。

添加尿嘧啶马铃薯培养基(pdau)：在马铃薯培养基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶。

基本培养基(mm)：kh2po31.0g、(nh4)2hpo31.5g、mgso4·7h2o0.3g、thiaminehcl500μg、琼脂粉15g，加水至1l，灭菌后倒平板备用。

添加尿嘧啶基本培养基(mmu)：在基本培养基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶。

筛选培养基(mmuf)：在基本培养基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶及0.5g/l的5-氟乳清酸。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1

金针菇尿嘧啶营养缺陷型单孢子的获得

将金针菇营养缺陷型菌株ng1-92与金针菇单核体菌株dg1-29进行杂交后得到双核体菌株sgn2进行出菇。出菇后选择菇形完整、个大、肉厚、无病虫害的子实体单株两株，在超净台中无菌平板内收集自然弹射的孢子。将收集到的孢子放入装有无菌水的ep管中浸泡，再用无菌水分梯度稀释，直到镜检时每个视野内有2-3个单孢子。将孢子液涂布到pda培养基上，置于25℃生化培养箱内培养。一般1周内可见到萌发的孢子。将萌发的孢子转接到pda培养基上，经过10天的培养，放在显微镜上检查，无锁状联合的菌丝为单孢子萌发的菌丝，挑出备用，淘汰有锁状联合的菌丝。将无锁状联合的单孢子接种于不同培养基mm、mmu、mmuf。挑选出能在mmu和mmuf上生长但在mm上不生长的单孢子，即为尿嘧啶营养缺陷型单孢子。如图1所示，单孢子2-6在mmu和mmuf上生长但在mm上不生长为尿嘧啶营养缺陷型单孢子。

实施例2

金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株的制备

将尿嘧啶营养缺陷型单孢菌株萌发得到的单核菌丝在mmu培养基上进行杂交。培养两周左右，见双亲菌丝已经融合，挑出融合处菌丝进行镜检，有锁状联合的为尿嘧啶营养缺陷型双核菌丝(vg1-2(cgmccno.12877，保藏日为2016年9月19日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，建议分类命名为：金针菇(flammulinavelutipes))为2-6与2-33杂交得到，2-6、2-33为dg1-29与ng1-92杂交得到的子实体收集单孢得到)。

实施例3

尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株5’-氟乳清酸验证

将得到的金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株接种于不同培养基mm、mmu、mmuf，这些纯合体可以在mmu培养基和mmuf培养基上生长而不可以在mm培养基上生长。如图3所示，尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株vg1-2可以在mmu和mmuf上生长但在mm上不生长。

实施例4

尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株基因组dna的提取与pcr克隆相关基因

提取尿嘧啶营养缺陷型纯合体菌株基因组dna(ctab法)。设计pyrg基因的引物。

pcr扩增体系为50μl，包含：takaraextaq(5u/μl)0.5μl，10×extaqbuffer(mg²⁺plus)5μl，dntpmixture(2.5mmol/l)4μl，模板dna(100ng/μl)1μl，引物各1μl，双蒸水(ddh2o)37.5μl。pcr反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃75s；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。

表1扩增pyrg基因的pcr引物

出发菌株金针菇尿嘧啶营养缺陷单核体ng1-92的pyrg基因在236位有碱基替换t→c，突变相应引起xhoι酶切位点(c/tcgag)的缺失，提取尿嘧啶营养缺陷型纯合体菌株基因组dna后对pyrg基因进行pcr扩增，经过琼脂糖凝胶电泳并割胶回收，对回收产物进行酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示尿嘧啶营养缺陷型纯合体菌株的条带与出发菌株一致，与其它菌株不同，如图4所示。

实施例5

金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株的生长速度测定

将金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株1株和野生型1株接种于pda培养基和pdau培养基，3天后测量生长情况。

结果如图5所示，金针菇尿嘧啶缺陷型在pda培养基上的生长速度(0.2186cm/d)普遍低于野生型的生长速度(1.4089cm/d)。

金针菇尿嘧啶营养缺陷型菌株在添加了尿嘧啶的pdau培养基上生长速度(1.1409cm/d)与在pda培养基上的生长速度(0.2186cm/d)相比都有很大的提高。而野生型在添加了尿嘧啶pda的培养基上生长速度没有太大变化，甚至还有所降低(见图6)。

sequencelisting

<110>上海市农业科学院

<120>一种利用尿嘧啶营养缺陷型进行金针菇菌种保护的方法

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