一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法与流程

本发明涉及棉花黄萎病菌的鉴定，具体涉及一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法。

背景技术：

黄萎病被称为棉花的癌症，是为害棉花的一种毁灭性病害。近20年来，该病在我国各地频繁流行危害，如1993年、1995年、1996年、2002年、2003年黄萎病即在我国各棉区大发生，有时还造成大面积棉花落叶枯死。黄萎病已发展成为棉花可持续生产的主要障碍之一。培育抗病品种是防治该病的主要方法，但由于黄萎病病菌变异频繁，导致病原菌的致病机制、寄主的抗病机制、及病原菌与寄主的互作机制等研究滞后，严重限制抗病品种的选育，且往往导致现有的抗性不高的耐病品种丧失抗性，因此研究病原菌的遗传变异是该病综合防治及相关研究的基础。

棉花黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。我国的棉花黄萎病菌划分为三个生理型：生理型I，致病力最强，以陕西泾阳菌系为代表；生理型II，致病力弱，以新疆和田、车排子菌系为代表；生理型III，致病力中等，广泛分布于长江和黄河流域棉区。80年代初，陆家云等首次报道在我国江苏局部地区出现落叶型棉花黄萎病，其典型症状是叶片轻度萎蔫，很快脱落，植株枯死前即成光杆。之后，落叶型菌株一直受国内科研及技术推广部门的广泛关注，也成为棉花抗黄萎病综合防治及抗病育种等研究的核心。

对于落叶型棉花黄萎病菌的鉴定，国内外有不同的方法，但一直没有统一、规范、易操作，能反应病原菌的真实特性，并得到广泛认可的方法。根据河北、湖北、江苏的鉴定，当地近年来新分离黄萎病菌系90％以上是落叶型菌系，对当地棉花可持续生产构成巨大威胁。但是，在各地分离鉴定落叶型黄萎病菌系时经常出现落叶型菌系的致病力并不强的现象，以病情指数判定甚至还不如中等致病力菌系，如何划分和判定从黄萎病病株中分离获得的病原菌为落叶型黄萎病菌，是困扰棉花病害工作者的主要问题，明确落叶型黄萎病菌的鉴定标准对该病的防治和病理学具有重要的指导意义，本发明就棉花黄萎病病菌落叶型菌系的划分提出一种综合评判方法，以期为棉花黄萎病的控制技术及抗病育种提供理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用分子检测结合生物测定鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法。

根据本发明的一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法包括以下步骤：

(1)待测棉花黄萎病菌的分离、单孢纯化；

(2)将步骤(1)纯化后的黄萎病菌接种现有感病、耐病寄主品种，对待测菌株进行生物测定；

(3)利用特异引物对待测菌株进行分子检测，采用落叶型菌株特异引物D-1/D-2：CATGTTGCTCTGTTGACTGG/GACACGGTATCTTTGCTGAA，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2：CAGGGGATACTGGTACGAGACG/(ATGAGTATTGCCGATAAGAACA对待测菌株进行PCR扩增；

(4)落叶型黄萎病菌的评价

(4-1)待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱落；

(4-2)待测菌株在感病对照上病情指数达到50时，在耐病品种上的发病率能达到50.0％以上，病情指数能达到耐病品种审定时的病情指数及以上；

(4-3)落叶型菌株特异引物D-1/D-2扩展出特异条带，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2未扩展出特异条带，

满足以上三个条件的菌株为棉花黄萎病菌为落叶型菌株。

根据本发明的具体实施方案，所述方法包括以下步骤：

1、棉花黄萎病菌的分离、单孢纯化

采集棉花黄萎病病株主茎中下部，剪成小段，去掉表皮并消毒。将棉杆薄片置于PDA培养皿中培养，待薄片周围长出白色菌丝，挑取菌落边缘的稍许菌丝，放入Czapek液体培养基中培养，过滤菌液并均匀涂布于水琼脂平板上，挑取萌发的单个孢子。

2、将纯化后的黄萎病菌接种感病、耐病品种，对待测菌株进行生物测定。

寄主的黄萎病调查分级标准：0级，棉株健康，无病叶，生长正常；1级，棉株三分之一以下叶片表现病状；2级，棉株三分之一以上，三分之二以下叶片表现病状；3级，棉株三分之二以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。

病株率和病情指数按下面的公式进行计算：病株率＝发病株数/总株数×100％；病情指数＝∑(相应病级×相应病级病株数)/(总株数×4)×100。

3、利用特异引物对待测菌株进行分子检测

采用大丽轮枝菌(V.dahliae)落叶型菌株特异引物D-1/D-2(CATGTTGCTCTGTTGACTGG/GACACGGTATCTTTGCTGAA)，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2(CAGGGGATACTGGTACGAGACG/(ATGAGTATTGCCGATAAGAACA)对待测菌株进行PCR扩增，PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，以落叶型菌株T₉作为对照菌株。

4、落叶型黄萎病菌的评价

⑴待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱落；

⑵待测菌株在感病对照上病情指数达到50时，在耐病品种上的发病率能达到50.0％以上，病情指数能达到t及以上的(注：t为耐病品种审定时的病情指数)；

⑶落叶型菌株特异引物D-1/D-2能够扩展出特异条带，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2不能扩展出特异条带。

结合生物测定和分子检测结果，满足以上三个条件的菌株为棉花黄萎病菌为落叶型菌株。

根据本发明的方法具有以下特点：

1、不选用特定的耐病品种为鉴别寄主，规定耐病品种的病情指数达到t及以上时即可(注：t为耐病品种审定时公布的病情指数)，以方便使用者根据当地情况采用当地的耐病品种。

2、本发明的鉴定规定供试菌株在耐病品种上的发病率达到50.0％以上，病情指数达到t及以上，客观的反映病原菌的致病力。

3、鉴别周期短。本发明的鉴定方法采用蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液的方法，检测病原菌的落叶情况和致病力，寄主接种后7天左右开始发病，25天左右达到鉴定要求(感病对照冀棉11病情指数在40.0～66.7)，鉴定周期为45天左右。

4、客观性、全面性。本发明结合生物测定和分子测定，即反映了病原菌的致病力、落叶等生物特点，也从基因水平上反映了落叶型和非落叶型菌株的差异。

附图说明

图1温室致病力测定中的落叶型病株。

图2棉花黄萎病菌分子检测示意图。

图3 D-1/D-2对部分菌株扩增的结(maker2000)。

图4 ND-1/ND-2对部分菌株扩增的结果(maker2000)。

具体实施方式实例

一、材料

待测菌株；对照菌株，落叶型菌株T₉；

以国家棉花品种区试验抗病性评价中的感病对照冀棉11、鄂荆1818、新陆早36为本试验的感病对照，以当地种植较为广泛的耐病品种为指示品种。

二、生物测定

1、待测菌株的分离

8月中旬前，采集棉花黄萎病病株主茎中下部，剪成4cm左右的小段，去掉表皮，用75％的酒精消毒。在超净工作台上将去皮的茎杆置于0.1％升汞中浸泡30～60min左右(依据茎干的粗细适当调整消毒时间)，用灭菌的蒸馏水清洗3次，剪成2～3mm的薄片。将薄片置于PDA培养皿中央，于25℃条件下暗培养，2～3d后，薄片周围长出白色菌丝，5～7d后可进一步转皿纯化。

从棉花病株上分离到的菌落为野生菌株，挑取野生菌株菌落边缘的稍许菌丝，置PDA平板中央进行初步纯化，25℃下培养10d，然后进行单孢纯化。

2、待测菌株单孢纯化

挑取上述菌落边缘的少量菌丝，放入Czapek液体培养基中，25℃培养7d后，用4层纱布过滤以除去菌丝，将孢子液稀释到100个孢子/ml的浓度。吸取0.1ml的孢子液均匀涂布于水琼脂平板上，置25℃条件下暗培养30h。将培养皿倒置，在显微镜下观察孢子萌发的情况，用记号笔标记单个萌发的孢子(一个中心点萌发的孢子)，萌发的孢子周围应无其它孢子或距离其它萌发孢子较远。用打孔器对准标记打孔，挑取饼块到PDA平板上，于25℃培养箱中培养10d，分别转管用于进行生物学性观察等试验。

3、棉苗培养

所用的棉花种子均经硫酸脱绒，并经3％的H₂O₂表面消毒10min，再用55～60℃温水浸泡30分钟，然后加入凉水，浸泡12h后，凉干备播。

将购买的商品蛭石和晒干的河沙按6:4混合均匀，用报纸制作6cm×10cm的纸筒，将纸筒放入75cm×35cm×15cm(长×宽×高)的塑料盘内，每行7个钵，共4行。将蛭石和沙子的混合物装入纸筒中，离上沿2cm，即制成了蛭石沙土营养钵。从盘子中间空隙处灌水，使营养钵内的蛭石沙土充分吸水，以纸钵内最上面的蛭石沙土湿润而盘子内没有积水为宜。将上述种子均匀分散在营养钵内，每钵4-5粒，轻轻按压，覆盖同样的蛭石沙土1.5cm厚，用手适当抚平并镇压。

5、接种

将经单孢纯化后的菌株移入Czapek液体培养基中，置25℃暗培养7～10d，用4层纱布过滤掉菌丝，获得孢子悬浮液，显微镜下用血球计数板计数孢子数，将孢子悬浮液稀释至1×10⁷个孢子/ml。

订购直径6.5cm的纸碟供接种使用，待棉苗一片真叶平展时接种。接菌前，拔掉小苗弱苗，留整齐一致的棉苗，接菌前一天不浇水或少量浇水。将营养钵从塑料盘内小心取出，放置在干净的塑料布上，将6.5cm的纸碟摆放在塑料盘内，一钵一碟，摆放整齐，在纸碟中加入10ml孢子悬浮液，将营养钵放入纸碟，注意将毛细根全部浸入菌液，使根系吸干菌液后，适量喷水。

6、病情调查

接菌后7天左右棉苗开始发病，出现病株后，每天认真观察并记载指示品种的发病情况及是否出现典型的落叶型黄萎病，落叶型黄萎病的症状：子叶黄化、失水、变软，轻轻动一下病株，子叶即脱落，棉苗呈光杆，只留生长点(图1)；

跟踪监测感病对照的发病情况，感病对照病情指数达到50时，进行病情分级调查。分级标准为：0级，健苗，无病状；1级，1～2片子叶表现病状，子叶变黄，真叶不显病状；2级，子叶和1片真叶表现病状；3级，2片真叶表现病状；4级，全部叶片表现病状，严重时叶片脱落，顶心枯死。

7、统计分析

根据调查结果,计算出病株率、病情指数和相对病情指数。

病株率(％)＝(发病株数/调查总株数)×100％

病情指数＝[∑(各级病株数×相应病级)/调查总株数×最高病级(4)]×100。

二、分子检测

1、提取菌株基因组DNA的

2、分子检测

利用大丽轮枝菌特异性落叶引物D-1/D-2，特异性非落叶引物ND-1/ND-2对待测菌株进行分子鉴定。对待测菌株进行分子鉴定的PCR扩增反应体系的总体积为25μl:l0XBuffer(Mg²⁺为Plus)2.5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)2.0μL、TaKaRaTaq聚合酶(5U/μL)0.14μL、引物1.0μL、模板DNA 2.0μL、ddH2O 17.36μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s；Tm℃(不同的引物设定不同的退火温度)退火50s；72℃延伸1min；共循环35次；72℃延伸10min；4℃保存。进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检检测，观察扩增条带的有无及大小，并记录(图2)。

三、落叶型黄萎病菌的评价

1、待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱落；

2、感病对照寄主病指达到50时，在耐病品种上的发病率达到50.0％以上，病情指数达到t及以上的(注：t为耐病品种审定时的公布病情指数)；

3、落叶型菌株特异引物D-1/D-2能够扩展出特异条带，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2不能扩展出特异条带。

结合温室生物测定和分子检测结果，满足以上三个条件的菌株为棉花黄萎病菌为落叶型菌株。

(1)利用几个常用菌株对该方法进行准确性检测。

如表1所示，利用分子检，结果表明Vdo76、Vd080、Vd171、Vd991、Vd8和T9均能扩增出落叶型菌株的特异性条带，只有SS-4为非落叶型菌株。而通过生物测定，我们发现Vd171的致病力非常弱，其病株率为10.8，病指为3.1；接菌后15天无落叶，20天后出现部分落叶，这也可能是其他原因造成的，我们认为其不是落叶型菌株，但是这和分子检测的结果相违背。而参考本方法：结合生物测定和分子测定的结果对落叶型黄萎病菌的评价，认为Vdo76、Vd080、Vd991、Vd8和T9为落叶型菌株，Vd171和SS-4为非落叶型菌株(表1)。这样既能反映病原菌的生物特点，避免其他原因造成的落叶现象影响结果，又能体现分子检测的结果，同时也客观的体现了病菌的致病力水平。我们认为，该划分标准比较客观、全面，能较真实地反应落叶型菌株的特点。

表1常用菌株的落叶型评价

(2)对来自我国三大棉区12个省84个县的163个菌株进行生物测定和分子检测。

分子测定

D-1/D-2,ND-1/ND-2两对引物对待测的163个菌株基因组DNA进行扩增并电泳检测(图3，图4)。结果表明，12个菌株能用ND-1/ND-2扩出条带，条带大小约为1000bp；151个菌株及落叶型对照菌株T9能用D-1/D-2扩出条带，条带大小约为550bp。表明待测的163个菌株中，落叶型菌株约占92.6％，非落叶型菌株占7.4％。151个落叶型菌株中，中等和强致病力类型菌株占84.2％，12个非落叶型菌株中，弱致病力类型菌株占86.7％，非落叶型菌株中没有出现强致病力类型的菌株。

室内生物测定

以冀11为感病对照，耐病品种为中棉所35(黄萎病指28.4)，病原菌接菌浓度为1×10⁷个孢子/ml，环境温度控制在18～31℃之间，接菌后5～7天开始发病，出现病株后1～2天即可出现落叶型病株。观察记载结果表明，至接菌后15天，163个菌株中，有90个菌株出现落叶症状，占55.2％，至接菌后20天，所有菌株均出现不同程度的落叶，分子检测中的非落叶型菌株在接菌后的15天以后出现落叶症状。

落叶型黄萎病菌的评价

分子检测结果表明来自我国主产棉省得163个菌株中，92.6％的菌株属于落叶型菌株，而在致病力测定中，接菌后20天，几乎所有的菌株均有不同程度的落叶，与分子检测结果不完全吻合。进一步研究还发现，与非落叶型菌株相比，落叶型菌株和非落叶型菌株均能导致棉苗落叶，只是落叶型出现落叶的时间比非落叶型剧菌株早3～6天。参考本发明提出的棉花黄萎病菌落叶型菌株的判定标准：待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱落；感病对照寄主病指达到50时，在耐病品种上的发病率达到50.0％以上，病情指数达到t及以上的(注：t为耐病品种审定时的公布病情指数)；落叶型菌株特异引物D-1/D-2能够扩展出特异条带，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2不能扩展出特异条带。

按照以上标准对163个菌株进行鉴定(表2，表3)，其中落叶型菌株87个，占53.4％，非落叶型菌株76个，占46.6％，落叶型菌株均为强致病力类型，多来自河北、河南和湖北。而新疆的24个菌株中，只有5个为落叶型菌株。

表2我国三大棉区163个棉花黄萎病菌株在中棉所35上的病指及病株率分布情况

表3落叶型菌株的检测结果

<110> 中国农业科学院棉花研究所，中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法

<160> 2

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catgttgctc tgttgactgg gacacggtat ctttgctgaa 40

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggggatac tggtacgaga cgatgagtat tgccgataag aaca 44