本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及筛查遗传性心脑血管疾病相关基因突变的检测试剂盒及其医学解读数据库，具体涉及一种遗传性心脑血管疾病诊断试剂盒。
背景技术：
脑血管病是指各种病因所致脑血管损害而引起的脑组织病变，临床表现为各种脑功能障碍，是第二大致死原因和最常见的致残原因，给个人家庭和社会带来巨大的精神压力和沉重的经济负担。越来越多的研究表明，遗传因素是脑血管病的重要致病原因，通过对遗传性脑血管病患者基因检测，可明确诊断，对脑血管病患者早期个体化防治提供有力证据。近年来二代测序技术(NGS)以其通量高，成本低，可检测突变范围广的特点，已经发展为重要的临床基因分析技术，而结合目标区域捕获技术(target region capture technology)可进一步富集目标区段，提高检测效率降低成本，目前没有一种产品或技术可以全面覆盖全部脑血管病致病基因。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种遗传性心脑血管疾病诊断试剂盒，以解决现有技术中遗传性心脑血管疾病诊断方法较为局限、缺乏分子生物学依据的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对遗传性心脑血管疾病的诊断方法准确性较低。
本发明要解决的再一技术问题是当以标志性基因作为遗传性心脑血管疾病诊断依据时，由于此类疾病范围较广、分型复杂，因此标志性基因与疾病对应关系混乱。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种遗传性心脑血管疾病诊断试剂盒，该试剂盒检测如下表所示的229个基因的突变情况：
。在以上技术方案中，所述突变是本领域常规的突变位点，较佳地包括了indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertion or deletion，indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点。
作为优选，所述诊断试剂盒包括以上229个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上229个基因的全部外显子区域。
作为优选，所述试剂盒包括用于扩增所述外显子区域的多重PCR引物，以及用于二代测序的试剂。
作为优选，所述试剂盒包括将检测对象中抽提出基因组DNA制成可供测序的文库的试剂。
作为优选，所述试剂盒包括dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的试剂，阳性对照或阴性对照。
作为优选，所述遗传性心脑血管疾病是大脑淀粉样血管病，该试剂盒的检测对象为APP基因的突变情况。
作为优选，所述遗传性心脑血管疾病是脑腱黄瘤病，该试剂盒的检测对象为CYP27A1基因的突变情况。
作为优选，所述遗传性心脑血管疾病是白质消融性脑白质病，该试剂盒的检测对象为EIF2B1基因的突变情况。
作为优选，所述遗传性心脑血管疾病是脑室周围结节性异位，该试剂盒的检测对象为ERMARD基因的突变情况。
作为优选，所述遗传性心脑血管疾病是血小板无力症，该试剂盒的检测对象为ITGA2B基因的突变情况。
本发明所述的229个基因外显子区域的突变情况可用于对遗传性心脑血管疾病做出辅助诊断，遗传性心脑血管疾病常规的诊断方法包括形态学、细胞遗传学和流式细胞学，本发明所述方法较佳地从分子生物学角度对一系列遗传性心脑血管疾病做出诊断。
本发明提供一组检测相关标志性基因外显子区域的多重PCR引物，所述引物的扩增范围包括229个标志性基因的外显子区域。利用本发明提供的多重PCR引物，结合二代测序技术，能够检测本发明所披露229个标志性基因中的全部外显子区域。
其中所述的二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。
本发明所述检测试剂盒更佳地还包括将检测对象中提取的基因组DNA制成可供测序使用的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足多重PCR对基因组DNA质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。
本发明所述检测试剂盒较佳地还包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的是Backman磁珠。
本发明所述的样本为检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种，优选地为骨髓样本。
一种本发明所述试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：
(1)利用本发明所述检测试剂盒抽提检测对象的骨髓，提取基因组DNA；
(2)用多重PCR引物对基因组DNA中发明中所述229个标志性基因的外显子区域进行扩增；
(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供Ion Torrent测序平台测序的文库；
(4)对步骤(3)中所得DNA文库进行测序，得到下机数据；
(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。
以上各个步骤的具体操作方法详见试剂盒说明书。
本发明所用的试剂和原料均市售可得。
本发明提供了一种遗传性心脑血管疾病诊断试剂盒，该技术方案通过对OMIM以及相关文献的查找，设计了一款全新的心脑血管相关致病基因组合，该组合包括229个基因，可基于杂交捕获原理对这229个基因的编码区及侧翼±30bp区域进行捕获，后续对捕获的目标区域进行二代测序并对测序结果进行标准化信息分析和变异解读，通过对测序检出的异常变异进行分析解读，明确受检者的致病突变，实现对脑血管病患者的准确诊断、针对性的治疗以及防止疾病在家族中复发。根据人类基因组HG19，选取上述229个基因的外显子序列以及侧翼±30bp区域设计探针组合，本组合中探针对目标区域覆盖度达99％。
本发明公开了一组用来筛查遗传性心脑血管疾病相关基因突变的测序试剂盒，以及后续的医学解读数据库。遗传性心脑血管疾病相关基因群包括ABCA1、ABCC2、ABCC6等229个基因。测序试剂盒包括对遗传性心脑血管疾病相关的229个基因全部外显子扩增的多重PCR引物。本发明提供的筛查遗传性心脑血管疾病相关基因突变的试剂盒具有检测效率高、突变基因覆盖面广、检出率高等优点，给出的医学解读报告具有准确、权威的特点。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
在首都医科大学附属北京天坛医院心脑血管相关科室2016年1月至2016年12月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(85名)。
入选标准为：血常规、生化检测及影像学辅助检查不能明确疾病种类的患者。实验组别及特征如表1所示：
表1实验对象及其临床特征
样本采集：3ml静脉血。
样本处理：样本基因组利用天根DNA提取试剂盒(货号：DP316)进行抽提，具体操作方法参见试剂盒使用说明书。
文库构建：对提取得到的DNA片段使用KAPA公司生产的文库构建试剂盒，实验操作方法参见KAPA公司试剂盒的使用说明书。用多重PCR引物对基因组DNA进行扩增，具体操作方法见吉泰公司生产的PCR扩增试剂盒的使用说明书。
杂交捕获：把扩增好的文库，使用安捷伦公司定制的探针进行杂交捕获。
高通量测序：将构建好的测序文库在Illumina公司平台上进行高通量测序，测序方法请参考Illumina公司高通量测序仪及其配套设备的使用说明书。
生物信息学分析：使用Cutadapt(https://pypi.python.org/pypi/cutadapt)和FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)过滤低质量的测序片段，使用bwa比对软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml)将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19，用GATK软件(http://www.broadinstitute.org/gatk/)分析比对序列获取SNP和Indel突变，将SNP和Indel突变使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白质水平变异，突变在dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，1000Genomes数据库(http://www.1000genomes.org/)，esp6500数据库(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)，PoliPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/phh2/)、sift(http://sift.jcvi.org/)、MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)、GERP功能预测结果。以及hgmd(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)疾病位点数据库。进一步使用以上原则筛选疑似致病位点。
医学解读：用OMIM数据库对生物信息学分析得出的基因突变型做出分子病理诊断。结果见表2和表3。
表2脑血管病类型及基因数
表3基因疾病对应关系
经统计后表明：(根据上述表格进行总结)由此可见，使用二代测序的方法对一系列心脑血管疾病进行辅助诊断，具有诊断准确、分型清晰、获得信息量大等特点。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。