一种用于检测克柔假丝酵母菌的LAMP引物组合物及其LAMP检测试剂盒和使用方法与流程

本发明涉及真菌病原分子检测技术领域，尤其涉及一种克柔假丝酵母菌的LAMP引物组合物及其LAMP检测试剂盒和使用方法。

背景技术：

近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物和免疫抑制剂等的广泛应用，器官移植、骨髓移植、导管插管等的普遍开展，尤其是艾滋病等的流行，致使真菌尤其是念珠菌引起的深部感染机会日益增多。

念珠菌是一种芽生的酵母状真菌。已知可以致病的常见念珠菌有：白念、热带、近平滑、克鲁斯、星状、季也蒙和光滑念珠菌等八种。这些菌不仅广泛存在于自然界里，而且也可寄生在正常人体皮肤、口咽、胃肠道、肛门和阴道粘膜上而不发生疾病，是一种典型的条件致病菌。

念珠菌感染是由念珠菌属，尤其是白念珠菌引起的一种真菌性广谱病变。该病病原菌既可侵犯皮肤、粘膜和指(趾)甲等引起的浅部念珠菌病，又能累及内脏、系统甚至播散导致深部念珠菌感染。随着免疫受损或低下人群的不断扩大。机会性念珠菌病继续增多，迄今仍是医学真菌领域研究的热点。

克柔假丝酵母菌是属于白念珠菌的一种，该真菌既可侵犯皮肤、粘膜和指(趾)甲等引起的浅部念珠菌病，又能侵入内脏，导致深部念珠菌感染。20世纪70年代，克柔假丝酵母菌感染在静脉高营养患者中非常常见。随着新型抗真菌药物的应用使原本最常见的白念珠菌感染减少，而统称为非白念珠菌(NCAS)的光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、挪威假丝酵母菌、溶脂假丝酵母菌、都柏林假丝酵母等栖居增多，由其引起的感染所占比例呈逐年上升趋势。

目前临床应用的克柔假丝酵母菌的检测方法可以分为三大类：形态学方法、血清学方法、分子生物学方法。

形态学方法需要培养克柔假丝酵母菌而该真菌的培养周期一般需要数天甚至数周；菌种鉴定也较困难，需要交给具有丰富的经验的专业技术人员判断，而这限制了病情的早期诊断，易贻误最好的治疗时机。

血清学方法包括抗原检测和抗体检测。念珠菌的抗原成分复杂，与自然界中的多种物质，如血红蛋白、白蛋白、血透用硝酸纤维膜、多糖类免疫调节剂、细菌、其他真菌、类风湿因子等存在广泛的交叉，抗原检测易导致假阳性结果；念珠菌感染患者多合并有免疫抑制，抗体反应低下，可能导致假阴性的结果。而且，机体产生抗体反应需要一定的时间，因此抗体检测不能用于早期诊断。

分子生物学技术的发展为深部真菌感染的早期诊断创造了条件，目前应用于临床诊断的主要是PCR技术。包括以PCR为基础衍生出的多种技术：包括反转录PCR(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、RAPD技术、实时荧光定量PCR等。然而，PCR操作过程比较复杂，需要专业人员操作，并不是所有医院都具有该专业技术人员。另外，PCR仪价格昂贵，扩增时间长。因此，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的试剂盒及使用方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供了一种用于检测克柔假丝酵母菌的LAMP引物组合物、基于上述引物组合物的克柔假丝酵母菌检测试剂盒以及试剂盒的使用方法。所述LAMP引物组合物包括正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP和反向内引物BIP。克柔假丝酵母菌检测试剂盒使用所述LAMP引物组合物。该试剂盒操作方法简便，不需要复杂的仪器，也不需要特殊的试剂。反应时间快速高效，45-60min即可获得结果。结果的鉴定方法非常简便，既能够直接肉眼观察反应液浑浊度，也可以加入荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto9。本发明适用于现场检测。

为了实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于检测克柔假丝酵母菌的LAMP引物组合物，包括：

正向外引物F3：5’-TAGTACTACACTGCGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-GAAACGACGCTCAAACAG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向内引物FIP：5’-GCTCTTCATCGATGCGAGAAGTCGACAAGAGAAATCTACG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向内引物BIP：5’-GCAGCGAAATGCGATACCTATGTGCGTTCAAGAACTC-3’(SEQ ID NO:4)。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测克柔假丝酵母菌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测克柔假丝酵母菌的LAMP引物组合物。

优选地，引物组合物中正向外引物F3浓度为50μM，反向外引物B3浓度为50μM，正向内引物FIP浓度为50μM，反向内引物BIP为50μM。

优选地，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶，dNTP，10×IsothermalAmplification反应缓冲液，MgSO4，H₂O，显色剂。

进一步地，Bst DNA聚合酶的浓度为7-9U/μL，dNTP浓度为12mM，MgSO₄浓度为150mM。

进一步地，所述显色剂为荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto 9。

另一方面，本发明还提供一种检测克柔假丝酵母菌的方法，检测方法使用用于检测克柔假丝酵母菌的LAMP引物组合物。

进一步地，检测克柔假丝酵母菌的方法包括以下步骤：

步骤一：将待检测样品煮沸后离心，吸取上清，得到样品DNA；

步骤二：在PCR管中依次加入引物组合物，样品DNA，dNTP，10×IsothermalAmplification反应缓冲液，MgSO4水溶液，Bst DNA聚合酶和H₂O，得到反应液；

步骤三：将带有反应液的PCR管60～65℃反应45～60min；

步骤四：根据PCR管反应液浑浊程度判断扩增结果。

此外，本发明还提供了另一种检测克柔假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：

步骤一：将待检测样品煮沸后离心，吸取上清，得到待检样品DNA；

步骤二：在PCR管中依次加入引物组合物，克柔假丝酵母菌DNA，dNTP，10×Isothermal Amplification反应缓冲液，MgSO₄水溶液，Bst DNA聚合酶和H₂O，得到反应液；

步骤三：将带有反应液的PCR管放入水浴锅反应；

步骤四：向PCR管反应液内加入荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto 9，根据荧光强度判断扩增结果。

为了进一步优化上述检测克柔假丝酵母菌的方法，本发明所提供的技术措施还包括：

步骤一中待测样品可以为真菌培养物、疑似病变组织或组织渗出液，煮沸时间为10min，离心速度为10000g/min；

步骤二中反应液的反应体系为：1μL待检样品DNA，4μL 12mM dNTP，2.5μL 10×Isothermal Amplification反应缓冲液，1μL 150mM MgSO₄水溶液，1μL Bst DNA聚合酶和14.5μL H₂O；

步骤三中将带有反应液的PCR管放入60～65℃的水浴锅中，反应时间为45-60min；

步骤四中加入的显色剂为2μL。

本发明提供了一种克柔假丝酵母菌环介导等温扩增试剂盒及使用方法，相对于现有技术，具有如下技术效果：本发明基于环介导等温扩增技术LAMP法，在克柔假丝酵母菌的特异内源性基因处设计了四条特异性引物，具有很强的品系特异性，且非常稳定，保证了反应的顺利进行。整个操作过程简便，即使非专业人员也能独立完成反应。反应过程中不需要复杂的仪器，只需要一台水浴锅就能完成。相比传统PCR扩增需要1-2h，本发明扩增只用45-60min即可完成，扩增产量可达10⁹-10¹⁰个拷贝，肉眼观察反应液浑浊程度就能判断结果，此外还可以加入荧光染料SYBGreen或Cyto9观察颜色变化。而且，本发明的方法灵敏度高，最低检测限可达到100个拷贝，在感染初期就能进行检测。

附图说明

图1是实施例一的检测结果图；1：阳性对照；2-5：待检样品；6：阴性对照。

图2是实施例二的显色检测结果图；1：阳性对照；2-5：待检样品；6：阴性对照。

图3是实施例3的扩增检测结果图；1：阳性对照；2-5：待检样品；6：阴性对照。

图4实施例四的扩增检测结果图；1：阳性对照；2-7依次为：105cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10¹cfu/ml、10cfu/ml的样品DNA；8：阴性对照。

图5实施例五的扩增检测结果图；1-20依次为：1-20依次为：白假丝酵母菌(ATCC 66027)、热带假丝酵母菌(ATCC 66029)、热带假丝酵母菌(分泌物)、热带假丝酵母菌(粪便)、热带假丝酵母菌(尿液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 6258)、克柔假丝酵母菌(痰液)、克柔假丝酵母菌(血液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 22019)、克柔假丝酵母菌(粪便)、克柔假丝酵母菌(引流液)、克柔假丝酵母菌(痰液)、光滑假丝酵母菌(ATCC MYA-2950)、光滑假丝酵母菌(血液)、光滑假丝酵母菌(尿液)、季也蒙假丝酵母菌(血液)、季也蒙假丝酵母菌(痰液)、挪威假丝酵母菌(尿液)、都柏林假丝酵母菌(分泌物)、红酵母菌(分泌物)。

具体实施方式

本发明提供了一种克柔假丝酵母菌环介导等温扩增试剂盒及使用方法，该检测试剂盒具有操作简便、反应快速高效、特异性和灵敏度高、最低检测限可达到100个拷贝、鉴定方法多样等优点。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一：

本实施例提供了一种克柔假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒和检测方法。试剂盒中包括引物液、预混液、DNA聚合酶和对照。引物液包括50μM正向外引物F3、50μM反向外引物B3、50μM正向内引物FIP和50μM反向内引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-TAGTACTACACTGCGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-GAAACGACGCTCAAACAG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向内引物FIP：5’-GCTCTTCATCGATGCGAGAAGTCGACAAGAGAAATCTACG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向内引物BIP：5’-GCAGCGAAATGCGATACCTATGTGCGTTCAAGAACTC-3’(SEQ ID NO:4)；

预混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反应缓冲液：150mM MgSO4水溶液，体积比为8:5:2；DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；对照包括阳性对照和阴性对照，阳性对照含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

使用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

将带检样品煮沸后离心，吸取上清，即为待测样品DNA；在200μL PCR管配制反应体系：各引物液1.8μL，反应液15.2μL，DNA聚合酶1μL，待检DNA 1～6μL，用H₂O补齐到25μL。设置阳性对照反应时，用克柔假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45-60min；通过观察PCR管内产物是否浑浊来判断扩增结果。

图1是本实施例的检测结果图。图1中阳性对照1的PCR管内产物浑浊，阴性对照6的PCR管内产物澄清，待测样品2、3的PCR管内产物浑浊，表明待测样品2、3中含有克柔假丝酵母菌；待测样品4、5的PCR管内产物澄清，表明待测样品4、5中不含克柔假丝酵母菌。

实施例二：

本实施例提供了一种含荧光染料的克柔假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒和检测方法。试剂盒中包括引物液、预混液、DNA聚合酶、对照和荧光染料。引物液包括50μM正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、50μM反向内引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-TAGTACTACACTGCGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-GAAACGACGCTCAAACAG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向内引物FIP：5’-GCTCTTCATCGATGCGAGAAGTCGACAAGAGAAATCTACG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向内引物BIP：5’-GCAGCGAAATGCGATACCTATGTGCGTTCAAGAACTC-3’(SEQ ID NO:4)；

预混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反应缓冲液：150mM MgSO4水溶液，体积比为8:5:2；DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；对照包括阳性对照和阴性对照，阳性对照含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；荧光染料为SYBGreen。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

将带检样品煮沸后离心，吸取上清，即为待测样品DNA；在200μL PCR管配制反应体系：各引物液1.8μL，反应液15.2μL，DNA聚合酶1μL，待检DNA 1～6μL，用H₂O补齐到25μL。设置阳性对照反应时，用克柔假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45-60min；向上述反应管中再加入2μL显色剂，混匀，若显现黄绿色为阳性，橙色为阴性。

图2是实施例二的显色检测结果图。图2中阴性对照6显现橙色，阳性对照1显现黄绿色，待测样品2、3的PCR管显黄绿色，表明待测样品2、3中含有克柔假丝酵母菌；待测样品4、5的PCR管显橙色，表明待测样品4、5中不含克柔假丝酵母菌。

实施例三：

本实施例提供了一种含荧光指示剂的克柔假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒和检测方法。试剂盒中包括引物液、预混液、DNA聚合酶、对照和荧光指示剂。引物液包括50μM正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、50μM反向内引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-TAGTACTACACTGCGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-GAAACGACGCTCAAACAG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向内引物FIP：5’-GCTCTTCATCGATGCGAGAAGTCGACAAGAGAAATCTACG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向内引物BIP：5’-GCAGCGAAATGCGATACCTATGTGCGTTCAAGAACTC-3’(SEQ ID NO:4)；

预混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反应缓冲液：150mMMgSO4水溶液，体积比为8:5:2；DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；对照包括阳性对照和阴性对照，阳性对照含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；荧光指示剂为Syto9。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

将带检样品煮沸后离心，吸取上清，即为待测样品DNA；在200μL PCR管配制反应体系：各引物液1.8μL，反应液15.2μL，DNA聚合酶1μL，待检DNA 1～6μL，用H₂O补齐到25μL。设置阳性对照反应时，用克柔假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene 9640qPCR仪上60～65℃反应45-60min；根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没有显现“S”型扩增曲线则为阴性。

图3是实施例3的扩增检测结果图。图3中阴性对照6显现“直线”扩增曲线，阳性对照1显现“S”型扩增曲线，待测样品2、3显现“S”型扩增曲线，表明待测样品2、3中含有克柔假丝酵母菌，待测样品4、5显现“直线”扩增曲线，表明待测样品4、5中不含克柔假丝酵母菌。

实施例四：

本实施例提供了一种含荧光指示剂的克柔假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒和检测方法。试剂盒中包括引物液、预混液、DNA聚合酶、对照和荧光指示剂。引物液包括50μM正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、50μM反向内引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-TAGTACTACACTGCGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-GAAACGACGCTCAAACAG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向内引物FIP：5’-GCTCTTCATCGATGCGAGAAGTCGACAAGAGAAATCTACG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向内引物BIP：5’-GCAGCGAAATGCGATACCTATGTGCGTTCAAGAACTC-3’(SEQ ID NO:4)；

预混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反应缓冲液：150mM MgSO4水溶液，体积比为8:5:2；DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；对照包括阳性对照和阴性对照，阳性对照含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；荧光指示剂为Syto9。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

将浓度为10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10¹cfu/ml、10cfu/ml的带检菌液煮沸后离心，分别吸取上清，即为待测样品DNA；恒温检测反应：在200μL PCR管配制反应体系：引物液1.8μL，反应液15.2μL，DNA聚合酶1μL，荧光指示剂Syto91μL，待检DNA1～6μL，用ddH2O补齐到25μL；设置阳性对照反应时，用克柔假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene 9640qPCR仪上60～65℃反应45-60min；根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没有显现“S”型扩增曲线则为阴性。

图4实施例四的扩增检测结果图；1：阳性对照；2-7依次为：10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10¹cfu/ml、10cfu/ml的样品DNA；8：阴性对照。本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到10²cfu/ml的浓度。

实施例五：

用实施例二的鉴定方法分别对分离纯化的白假丝酵母菌(ATCC 66027)、热带假丝酵母菌(ATCC 66029)、热带假丝酵母菌(分泌物)、热带假丝酵母菌(粪便)、热带假丝酵母菌(尿液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 6258)、克柔假丝酵母菌(痰液)、克柔假丝酵母菌(血液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 22019)、克柔假丝酵母菌(粪便)、克柔假丝酵母菌(引流液)、克柔假丝酵母菌(痰液)、克柔假丝酵母菌(ATCC MYA-2950)、克柔假丝酵母菌(血液)、克柔假丝酵母菌(尿液)、季也蒙假丝酵母菌(血液)、季也蒙假丝酵母菌(痰液)、挪威假丝酵母菌(尿液)、都柏林假丝酵母菌(分泌物)、红酵母菌(分泌物)进行鉴定。

图5实施例五的扩增检测结果图；1-20依次为：白假丝酵母菌(ATCC 66027)、热带假丝酵母菌(ATCC 66029)、热带假丝酵母菌(分泌物)、热带假丝酵母菌(粪便)、热带假丝酵母菌(尿液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 6258)、克柔假丝酵母菌(痰液)、克柔假丝酵母菌(血液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 22019)、克柔假丝酵母菌(粪便)、克柔假丝酵母菌(引流液)、克柔假丝酵母菌(痰液)、克柔假丝酵母菌(ATCC MYA-2950)、克柔假丝酵母菌(血液)、克柔假丝酵母菌(尿液)、季也蒙假丝酵母菌(血液)、季也蒙假丝酵母菌(痰液)、挪威假丝酵母菌(尿液)、都柏林假丝酵母菌(分泌物)、红酵母菌(分泌物)。鉴定结果显示白假丝酵母菌(ATCC 66027)、热带假丝酵母菌(ATCC 66029)、热带假丝酵母菌(分泌物)、热带假丝酵母菌(粪便)、热带假丝酵母菌(尿液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 6258)、克柔假丝酵母菌(痰液)、克柔假丝酵母菌(血液)、克柔假丝酵母菌(ATCC 22019)、克柔假丝酵母菌(粪便)、克柔假丝酵母菌(引流液)、克柔假丝酵母菌(痰液)、季也蒙假丝酵母菌(血液)、季也蒙假丝酵母菌(痰液)、挪威假丝酵母菌(尿液)、都柏林假丝酵母菌(分泌物)、红酵母菌(分泌物)反应管无“S”型曲线，即无扩增；克柔假丝酵母菌(ATCC MYA-2950)、克柔假丝酵母菌(血液)、克柔假丝酵母菌(尿液)显现“S”型扩增曲线，即有扩增。

综上所述，实施例一至实施例三的克柔假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒均可以从带检样品中检测出克柔假丝酵母菌。实施例四将本发明的试剂盒与商品化的克柔假丝酵母菌核酸检测试剂盒进行了灵敏度比较，结果表明，本发明的灵敏度高于商品化试剂盒，检测下限可以达到10²cfu/ml的浓度。实施例五验证了本发明试剂盒的特异性，结果表明，本发明试剂盒能够特异的检测克柔假丝酵母菌核酸，不会与其他真菌发生交叉反应。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

<110> 上海速创诊断产品有限公司

<120> 一种用于检测克柔假丝酵母菌的LAMP引物组合物及其LAMP检测试剂盒和使用方法

<160> 4

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 1

tagtactaca ctgcgtgag 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 2

gaaacgacgc tcaaacag 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 3

gctcttcatc gatgcgagaa gtcgacaaga gaaatctacg 40

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 4

gcagcgaaat gcgataccta tgtgcgttca agaactc 37